活体脾脏显微成像：寄生虫运动性与血流的定量分析

在此实验中，我们展示了一种定量活体显微镜方法，用于评估寄生虫通过脾脏的动力学过程。在啮齿类疟疾模型中，感染了表达绿色荧光蛋白（GFP）的转基因寄生虫的小鼠被制备用于脾脏活体显微观察，通过脾静脉插管可注入活体染料。实验过程中，可对荧光标记的细胞在脾脏不同区域的运动进行成像观察。

我们提供了用于描述寄生虫在红髓三维慢速区室中移动性的方法，并计算了血管血流量。这些参数被用于比较两种 PULE 菌株的脾脏动力学特征。大家好。

我的名字是Nando El Portillo，我实验室的主要研究问题之一是尝试理解脾脏在疟疾中的作用。脾肿大是该疾病的主要特征之一，但由于技术和伦理方面的限制，针对这一器官开展研究非常困难。为了解决这一问题，我们采用了能够观察寄生虫动态通过过程并量化这一现象的技术手段。

洛雷娜和MI将在这些实验方案中对此进行解释。本研究部分是与德国汉堡大学的Ler博士团队以及本医院诊所的Maria Kbo博士团队合作开展的，并获得了Cellex基金会和西班牙卫生部的一般性资助。感染实验通过将携带致死性或非致死性GFP寄生虫（寄生虫比例为10%）的供体M进行接种而启动。为检测寄生虫，可从小鼠尾静脉采集少量血滴，并将其涂布于显微镜载玻片上进行观察。

使用吉姆萨染液对载玻片进行染色。待染色液干燥后，可用甲醇固定血涂片两分钟，然后加入吉姆萨染液并孵育20分钟。用流动的自来水冲洗载玻片，干燥后在光学显微镜下使用100倍油镜观察，计算感染红细胞占总红细胞的百分比。

从供体小鼠尾部血液中获取致死性或非致死性寄生虫，用 PBS 稀释后感染小鼠。调整接种剂量至每只小鼠注射 50 万寄生虫，以确保感染后第 3 天外周血寄生虫率达到 1%，通过腹腔注射接种。作为对照，可使用 FITC 标记的红细胞。

从一只小鼠采集一毫升动脉血，用含EDTA的PBS缓冲液通过离心洗涤沉淀，再将沉淀重悬于FITC溶液中，于避光条件下轻柔振荡孵育两小时。孵育结束后，通过离心去除上清液，并进行充分洗涤。将处理后的细胞注入对照小鼠体内，使其在外周循环中的平均比例达到1%，随后开展体内实验。

大家好，我是mija。为了在活体动物中对脾脏进行成像，我们需要对动物实施一个小的协同操作，以将脾脏暴露出来。这一技术我是在Worker Heisler实验室向Stephanie GR学习的，我在此向她表示感谢。现在我将向您展示如何进行该操作。

在感染后第三天进行感染性肌炎成像，此时两种菌株的寄生率均为1%。在整个操作过程中，保持小鼠处于麻醉状态并维持体温恒定。保护小鼠眼睛免受脱水影响，并在进行静脉注射给药前通过轻弹足垫确认小鼠已完全麻醉。

实验过程中，对小鼠尾静脉进行插管以构建导管。将一根细针插入一根导管的一端，另一端插入其套管针中。用生理盐水填充导管并排除气泡，检查溶液是否能顺利通过导管流动。

将对尾部的侧静脉进行干净利落地插管。通过在尾根部实施轻柔的结扎以增强静脉的可见性。将套管的尖端插入静脉内。

血液的出现表明针头位置正确。如果未见血液，需在静脉的上游位置重复插管操作，然后用胶水和胶带将套管固定在尾部。通过动物左侧背部皮肤和肌肉的小切口暴露脾脏的下部。

将脾脏放置在呼吸运动较少的区域，并在其暴露的表面滴加 PBS，以清除小鼠毛发并保持组织湿润。用盖玻片封住脾脏，以便观察。你好，我叫 Lorena。

所示方案将使我们能够观察PULI寄生虫在脾脏中的运动。这得益于GFP转基因寄生虫的使用。该寄生虫由德雷塞尔大学的James Burnes惠赠。

通过成像荧光寄生虫的运动，我们将能够了解致死株与非致死株之间是否存在行为差异。活体显微成像实验在配备有温度控制孵育系统和63倍甘油物镜的Leica多光子显微镜上进行。将动物放置在显微镜载物台上，使覆盖有盖玻片的脾脏朝下对准物镜。初始时。

在较低放大倍数下观察脾脏，可获得该器官微循环结构的整体视图。利用组织自发荧光进行聚焦，可观察到表达绿色荧光蛋白（GFP）的寄生虫穿过脾脏不同区域的过程。大家好，我是来自巴塞罗那大学科学与技术中心的Maria Albo，接下来我们将进行脾脏的活体成像。

为了研究血流和受感染红细胞的移动性，我们将使用配备共振扫描装置的共聚焦显微镜，该装置可实现高速成像，有助于避免器官运动带来的干扰。这是一台光谱显微镜，可选择观察的波长范围。为了实现快速成像，我们将同时采集两种荧光素标记信号以及反射信号。

利用红细胞（RBC）、反射、对比度以及Vidal染料选择不同的区域进行成像，以显示脾脏微血管结构。接下来我们将解释如何使用Vidal显微镜结合ImageJ软件，通过获取五个Z轴深度的图像（采用高速扫描模式），追踪红髓三维网状结构中寄生虫在血管血流中的运动，从而测量寄生虫的移动性。

将图像序列转换为Z编码的彩色视频，以方便追踪单个荧光细胞。文中提供了详细信息，可通过每个视频中使用X、Y、Z和T坐标的轨迹来随时间追踪不同颗粒，并可计算诸如方向性、平均速度和停留时间等运动参数，进而以分布图形式呈现，实现不同菌株群体之间的比较分析。通过系统注射多种荧光分子（如支持性表格中所述的葡聚糖），可对脾脏中的血管血流进行成像。

利用内源性红细胞反射对比扫描，通过将血管沿激光扫描方向水平放置，并采用增强的线平均方法，对中心线血流进行成像。在这些图像中，由移动细胞产生的条纹将用于计算血流速度；同时采集不同直径血管以及心动周期中不同时相的图像，以校正血流波动。脾脏长期以来在疟疾研究中被视为一个“黑箱”，本文中我们建立了一种定量的活体显微成像方法，以深入探究该器官内寄生虫感染动态及血流情况，使我们能够回答一些重要的生物学问题，例如感染性红细胞在体内的脾脏黏附行为。

谢谢您。