活体鼠脑微循环显微镜使用一个封闭的颅窗口

该程序的总体目标是通过活体显微镜研究小鼠大脑中的微循环，这允许在较长时间内跟踪桩微循环中血流动力学和炎症标志物的动态变化。这项技术是在 La Jolla 生物工程研究所开发的，在那里它被用于多种类型的研究。例如，在伯氏疟原虫感染过程中以及脑疟疾表达期间对血流动力学变化的随访。

这是通过在活体显微镜检查研究前两周首先植入慢性颅窗来实现的。该程序的第二步是使用低放大倍率的高分辨率数字图像记录颅窗的整体形态。该程序的第三步是使用常规和荧光照明获取活体显微镜图像，并选择特定的研究地点进行血管直径和 RBC 速度的在线测量。

该程序的最后一步是通过荧光标记的特异性抗体对痔血管中白细胞和血小板的粘附进行活体分析。最终，可以通过脑活体显微镜获得结果，显示生理病理生理学或疾病状况的脑镜像模型中的体内微循环变化，以确定与这些疾病相关的血流动力学变化。这种技术的主要优点是我们在大脑的生理环境中观察大脑，而无需将其暴露在外部试剂或人工介质中，与图像相比，磁共振和血管造影具有空间和时间分辨率，使我们能够从微观观察到微观层面。

这种方法可以帮助回答脑微循环生理学和病理生理学中的关键问题，例如急性和慢性疾病期间的血流动力学和炎症变化 活体显微镜检查前 2 至 3 周。先前已证明在 8 至 10 周龄的小鼠中进行开颅手术，但未将钛棒放置在动物的头部。慢性颅窗是一种稳定的制剂，即使在实验当天植入后数月也可以检查桩微循环。

首先，检查动物的体温，然后将动物置于立体定位框架中，通过小鼠的尾静脉注入先前制备的荧光标记的红细胞。这将启用红细胞追踪，稍后将进行演示。然后用 isof fluorine 轻轻麻醉小鼠。

4% 用于感应，1 到 2% 用于维护。接下来，将动物置于加热垫上的立体定位框架中的俯卧位。使用耳杆小心固定头部，并使用左右控制杆调整水平。

用蘸有矿物油的棉签轻轻清洁颅窗上的盖玻片。然后使用连接到数码相机的体视显微镜，拍摄几张窗下船只的全景照片。将全景照片传输到计算机后，选择最好的照片进行打印、识别和注明日期。

这张照片将用作测量血管直径和红细胞速度的地图，接下来将进行演示以开始活体显微镜检查。将鼠标转移到定制的活体显微镜载物台。在颅窗上滴一滴水，利用牙科丙烯酸形成的井。

使用数值孔径为 0.5 的 20 x 水浸物镜。使用两个摄像头记录图像，一个连接到计算机和监视器的数字低光高速摄像机，以及一个连接到 VCR 磁带、时间戳和彩色监视器的低光模拟摄像机，然后选择要测量的血管，检查血管以评估制备质量，以及血液是否在所有血管中流动， 然后选择要测量的血管。它们应包括不同直径的场地和干道，并覆盖窗户暴露区域内的不同位置。

在我们的实验中，我们选择了 12 个血管进行测量，同时您查看颅窗内的各个视野。要选择血管，请在之前为每个点拍摄的 PY 脉管系统照片中注释要测量的每个点的精确位置，使用图像剪切装置测量血管直径。选择光斑后，容器的图像将在垂直位置对齐，并且图像将被剪切直到相反位置。

极值对齐并记录读数。对于红细胞跟踪，数码相机将每个点记录至少 30 秒，并以每秒 150 帧的速度记录视频图像。此速率设置为在一个视频帧上获取细胞的 1 到 6 张图像，以确定高达每秒 6 毫米的速度。

数据收集完成后，将鼠标从立体定位框架中取出并将其放回笼子中，以使用适当的软件从麻醉中恢复。采集的视频图像经过数字化和 XY 处理。获取每个单元图像的坐标数据。细胞位置是手动确定的，而不是通过图像分析确定的。

鉴于训练有素的观察者的眼睛可以很好地估计细胞中心的位置，这通常对应于观察到的最大荧光的位置。对于大多数细胞方向，确定每个血管中 15 个细胞的位置和速度。一旦获得血管直径和 RBC 速度测量值，即可获得平均 RBC 速度的平均值。

公式 Q 等于 D 乘以 PI 乘以 V 来计算每条血管中的血流，其中 Q 等于血流 V 等于红细胞速度，D 等于血管直径，用于富集评估和分析痔疮血管中白细胞的粘附性。对注入 FSE 标记的白蛋白和针对 Texas Red 标记的泛白细胞标志物 CD 45 的抗体混合物的动物进行活体显微镜检查。荧光标记的白蛋白可以改善血管网络的可视化，包括穿透血管，在脑疟疾等疾病状态下特别有用，以检查未灌注或灌注血管下的情况。

荧光标记的抗 CD 45 抗体可以轻松识别和量化白细胞滚动和粘附在桩血管上。通过计数 100 微米血管长度中的白细胞数量来定量白细胞粘附。通过在 30 秒内计算在相同的 100 微米长度中以明显慢于血液速度的速度行进的白细胞数量来量化滚动。显示。

以下是通过高速荧光细胞追踪来测量微血管红细胞速度的示例。视频记录图片 A 到 F 是微循环的序列图像。每张图片代表一个流动的红细胞的位置，由高速摄像机逐帧捕获。

这张来自代表性实验的图表显示了痔疮血流随时间的变化。在疟原虫、burgi、onca 感染的小鼠和未感染的对照小鼠中，而在对照小鼠中，桩血流随着时间的推移相对稳定。PBA 感染的小鼠在脑疟疾发展期间显示血流量市场减少。

第 6 天，用抗 CD 45、Texas 红荧光抗体染色，显示大量白细胞粘附在感染伯氏疟原虫的小鼠的桩血管上。除了今天在这里的一项工作之外，该程序还有广泛的应用。任何可以在体内使用的光学技术都可以适应该模型，并且可以在该模型中研究组织、氧水平组织、pH 活性氧和内皮细胞与白细胞的相互作用等参数。