体内电穿孔法将吗啉寡核苷酸导入再生的成年斑马鱼尾鳍

本实验的总体目标是在成年斑马鱼尾鳍再生过程中抑制或敲低特定蛋白质的表达。首先截除尾鳍，并使其少量组织再生。随后将吗啉代溶液显微注射到鳍一侧的每个胚芽中。

随后将形态发生表型的质粒通过电穿孔导入胚泡细胞中，另一半鳍则进行电穿孔作为对照。最后分析靶蛋白表达降低对再生出芽的影响。最终结果通过比较注射侧与未注射侧鳍的再生出芽情况，显示组织再生受到抑制。

该技术的意义在于其在伤口愈合与再生医学治疗方面的应用前景，因为它有助于揭示对组织生成至关重要的基因和信号通路。制备荧光素标记的吗啉寡核苷酸时，将300纳摩尔溶解于100微升无核酸酶水中。配制成约三毫摩尔的溶液后，分装至多个石蜡密封的微量离心管中，并在避光条件下室温保存。如需确定确切的吗啉寡核苷酸浓度，请参见书面实验方案中的详细说明。

将成年斑马鱼置于含有1毫克/毫升三卡因（trica）或二苯氧基乙醇（two phenoxy ethanol）的养殖用水中进行麻醉。当鱼完全麻醉后，将其放置于洁净的培养皿盖上，使用无菌手术刀片或剃刀刀片在第一脂质气管分支点近端处截除鱼鳍。切割时必须完全垂直于动物的前后轴平面，因为倾斜的切口将导致鱼鳍背侧与腹侧部分再生生长不均。术后将鱼放回养殖缸中，并根据实验设计需要，将其饲养在33摄氏度的环境中以加快再生速度。

截肢后零到两天内进行鳍再生实验。在引入吗啉代之前，于注射前一日制备注射用琼脂糖板：使用2%琼脂糖制备琼脂糖板，并在孔的一端切出一个凹口，以帮助在注射过程中稳定斑马鱼。注射前，将荧光素标记的吗啉代寡核苷酸（morpholino）、RNA和DNA溶于无核酸酶水中，稀释至适当浓度，并在65摄氏度水浴中孵育。

用预先准备好的注射针装载样品，持续五分钟，然后以一定角度剪去针尖。接着，对鱼进行麻醉，并将其放置在注射板上。除去所有多余的液体，将注射板置于体视显微镜的载物台上。

将针头置于骨射线远端附近。将针头轻柔插入每根骨射线远端的再生组织，继续向远端推进，直至进入胚基。当针头准确定位后，按照显微注射系统的操作说明，每次注射注入5纳升的形态发生素。

每次注射时可见一缕黄色的吗啡溶液，有助于将注射位置定位于从背侧中线开始的芽基区域。在背侧每根骨质鳍条注射约75纳升吗啡溶液，腹侧则不进行注射，仅作为电穿孔对照，在背侧注射完成后立即进行电穿孔操作。将注射用载片从显微注射装置中取出。

将麻醉液注入注射板孔中，直至淹没斑马鱼。为确保电穿孔电极不接触鱼鳍组织，将鱼体翻转至背侧朝上，并沿中线垂直向下观察以进行电穿孔。设置电穿孔参数为：15伏电压下连续施加10次脉冲，每次脉冲持续50毫秒，脉冲间间隔1秒，使用直径为3毫米的铂金板状镊形电极，电极间距设置为紧密但不接触。

对鱼鳍的背侧和腹侧均进行电穿孔，以防止因可能形成的气泡而导致电荷积聚。每次电穿孔后，用湿润的Kimwipe擦拭电极。最后，将鱼置于载玻片或培养皿上，迅速对鱼鳍成像，并确保记录背侧和腹侧的方向。

该图像将用于次日的再生分析。如果目标蛋白对鳍的正常再生至关重要，则将鱼放回鱼缸。电穿孔后一天或截肢后三天，应能明显观察到鳍背侧与腹侧之间的显著差异。

再拍摄一张鳍的图像，并将此图像与电穿孔后两天拍摄的相应图像进行比对。使用 NIH 图像软件，勾画出截肢后两天和截肢后三天背侧与腹侧两半部分的区域。为确定背侧与腹侧鳍生长面积的百分比，使用以下公式。

（背侧截肢后第三天的数量减去背侧截肢后第二天的数量）除以（腹侧截肢后第三天的数量减去腹侧截肢后第二天的数量），再乘以100，等于百分比面积。在截肢后第三天或电转后24小时检测鳍再生生长时，荧光素标记的morino应存在于鳍的背侧半部。观察到少量信号延伸至截肢水平是正常的。

在电穿孔后24小时，将对照吗啡肽注入鳍的背侧半部时，背侧的再生长度与腹侧相等，如图所示。而将实验吗啡肽注入鳍的背侧半部，则会抑制该侧的再生。按照此步骤操作。

还可以进行免疫组织化学、C二杂交、实时PCR和免疫印迹等其他方法，以回答诸如再生所需的遗传通路是什么等进一步的问题。