再生的成年斑马鱼尾鳍在吗啉代入体内电穿孔

我们描述了一个方法，有条件击倒目标蛋白的表达，在成年斑马鱼的鳍再生。这项技术涉及微注射和反义寡核苷酸进入鳍组织，它允许测试鳍再生，伤口愈合，芽基形成和再生产物，包括在不同阶段的蛋白质的作用吗啉代电穿孔。

该程序的总体目标是抑制或敲低再生成年斑马鱼尾鳍中特定蛋白的表达。这是通过首先截断尾鳍并允许少量组织再生来实现的。接下来将 morpho 溶液微量注射到鳍片一半的每个 blasa 中。

然后将 morph 表型电穿孔到 blasa 的细胞中，并将鳍的另一半电穿孔以进行控制。最后，分析了靶蛋白表达降低对再生生长的影响。最终，通过对注射和未注射的鳍的一半的再生生长进行比较分析，结果显示抑制了组织再生。

这项技术的影响延伸到伤口愈合和再生医学的治疗，因为有可能揭示对组织生成至关重要的基因和信号通路。要制备荧光素标记的 morino，请将 300 纳摩尔稀释到 100 微升无核酸酶的水中。为了制备大约 3 毫摩尔的溶液，将溶液分装到多个石蜡密封的微量离心管中，并在室温下避光储存要确定确切的形态浓度，请参阅书面方案了解详细信息。

水箱水中以每毫升 1 毫克的浓度在 trica 或两种苯氧乙醇中麻醉成年斑马鱼。当鱼完全麻醉后，将其放在培养皿的干净盖子上，并使用无菌手术刀或剃须刀片截去靠近第一个脂质气管分支点的鳍，重要的是要完全垂直于动物的前后平面切割鳍，因为倾斜的切口会导致鳍背半腹的鳍生长不均匀。将鱼放回水箱并保持在 33 摄氏度，以提高再生速率，具体取决于实验设计重量。

截肢后 0 至 2 天进行鳍再生。在引入 morpho 之前开始，在 morpho 注射前一天，用 2% 琼脂糖制作一个注射板，该注射板在孔的一端切出一个缺口，这将有助于稳定注射程序的鱼。注射前，将荧光素标记的morpho和不含RNA和DNAs的水稀释至适当的浓度，并在65°C的水浴中孵育。

加载先前准备好的注射针头 5 分钟，并以一定角度切下尖端。接下来，麻醉鱼并将其放在注射板上。除去所有多余的液体，并将板放在立体显微镜的载物台上。

将针头定位在骨射线的远端。将针头轻轻插入每条骨射线远端的再生组织中，并向远端推动，直到位于胚层中。当针头正确定位后，按照显微注射系统的说明，每次注射注射 5 纳升吗啡滴。

每次注射时，都可以看到一股黄色的吗啡溶液，这有助于将注射定位于从中线向背侧工作的胚芽。在背侧每条骨射线注射大约 75 纳升的 morpho，在注射 morpho 后立即将腹侧作为仅电穿孔对照。从显微注射装置中取出注射板。

用麻醉溶液充分填充注射板，直到鱼被淹没。为确保电穿孔电极不接触鳍组织，请旋转鱼的背面并直接向下看中线进行电穿孔。将电穿孔参数设置为 10 个连续的 50 毫秒脉冲，电压为 15 伏，脉冲之间暂停一秒，三个直径为毫米的铂板镊子电极设置得靠近但不接触。

鳍的背侧和腹侧进行电穿孔，以防止可能形成的气泡产生电荷积聚。每次电穿孔后，用湿 kimm 擦拭布擦拭电极。最后，将鱼放在载玻片或培养皿上，快速对鳍进行成像，确保注意背腹方向。

该图像将用于第二天的再生分析。如果所需的目标蛋白质是鳍正常再生所必需的，请将鱼放回水箱中。鳍背半部和腹侧半部之间的显着差异应在电穿孔后 1 天或截肢后 3 天明显。

再拍一张鳍的照片，并将此图像与电穿孔后截肢后两天拍摄的相应图像进行匹配。使用 NIH 图像追踪截肢后 2 天和截肢后 3 天的背侧和腹侧区域。要确定背鳍与腹鳍生长的百分比，请使用以下公式。

截肢后 3 天的背侧数量减去背侧 2 天的截肢除以截肢后 3 天的腹侧数量减去截肢后 2 天的腹侧数量乘以 100 等于百分比面积。当在截肢后 3 天或电穿孔后 24 小时测定鳍生长时，荧光素标记的 morino 应存在于鳍的背半部。看到一些下降到截肢的水平是正常的。

当电穿孔后 24 小时将对照形态注射到鳍的背半部时，可以看到与腹侧相同的生长物，如图所示。用实验性吗啡注射鳍的背半部会抑制该侧的再生。遵循此过程。

可以进行其他方法，如免疫组织化学和 C 2 杂交、实时 PCR 和免疫印迹，以回答其他问题，例如再生需要哪些遗传途径。