Name: 跨体内迟发型变态反应检测方法的抗原特异性调节 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: 学习跨体内迟发型变态反应检测方法，用于监测移植受者的抗原特异性免疫反应。该技术通过分离外周血单个核细胞并注射至免疫缺陷小鼠足垫，可同步评估促炎与调节性免疫应答，为安全撤除免疫抑制治疗提供可靠依据。

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作者谨此感谢 A.M. VanBuskirk 在推动我们理解移植受者中受调控的迟发型超敏反应（DTH）方面所做出的贡献。本研究工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 PO1AI084853 和 R01AI066219-06 以及欧盟资助的 One Study 项目支持。

1. 淋巴细胞的制备
<ol>
	<li>将血液收集到含ACD（酸性柠檬酸葡萄糖）的试管中。</li>
	<li>根据标准方法，使用淋巴细胞分离液从新鲜的人外周血中分离PBMC。</li>
	<li>用PBS洗涤PBMC三次，以去除污染的血小板。已发现血小板会干扰体内跨膜DTH实验。PBMC制备物中血小板的最大允许污染量为≤1×107/次注射。</li>
	<li>如果存在明显的红细胞污染，第一次洗涤后使用ACK裂解缓冲液进行红细胞裂解。通过用PBS洗涤两次以去除ACK缓冲液。</li>
</ol>
2. 同种异体抗原的制备
<ol>
	<li>使用上述方法从供体外周血中分离 PBMC。</li>
	<li>用 PBS 重悬供体 PBMC，使其浓度为 120×106 个细胞/ml（30 μl 中含 4×106 个细胞）。</li>
	<li>向混合物中加入 1 μM PMSF，以防止蛋白质降解。</li>
	<li>使用 2 mm 探头超声仪，以七次 1 秒脉冲对细胞悬液进行超声处理。（注意：保持样品低温，避免产生过多气泡。若出现泡沫，将细胞悬液置于冰上静置 2–3 分钟。）</li>
	<li>使用血细胞计数板确认 >90% 的细胞已被破碎。</li>
	<li>将混合物在 4 °C 条件下，以 14,000 rpm 离心 20 分钟。</li>
	<li>将上清液转移至新的 2.0 ml 安全锁管中，并测定蛋白浓度。</li>
</ol>
3. 注射用细胞的制备
<ol>
	<li>每次注射将 7×106 个 PBMC 分装至 2.0 ml 带安全锁的离心管中。</li>
	<li>在微量离心机中以 6,000 rpm 离心 1 分钟，弃去上清液。</li>
	<li>用含或不含抗原的 PBS 重悬细胞，并用 PBS 调整注射体积至 35 μl。注射方案如下： 
	阴性对照：PBMC + PBS 
	阳性对照：PBMC + TT/DT（25 μg/次注射） 
	实验性抗原特异性反应：PBMC + 待测抗原（4–8 μg/次注射） 
	实验性抗原特异性调节：PBMC + 待测抗原 + TT/DT</li>
</ol>
4. 测量前准备、注射及测量后操作
<ol>
	<li>使用异氟烷麻醉CB17 SCID小鼠。使用弹簧加载的卡尺测量后足垫厚度。将卡尺置于足垫中心，一端接触足部最后一个行走垫，以此作为基准，确保测量位置一致。当卡尺读数稳定后记录足垫厚度。</li>
	<li>使用½ cc胰岛素注射器（带28号针头）将细胞悬液缓慢皮下注射至小鼠足垫。注射时针头朝向脚趾方向，针尖斜面朝上。（注意：确保无渗漏）。</li>
	<li>注射后18–24小时，使用异氟烷麻醉小鼠，并重复测量足垫肿胀程度。</li>
	<li>将每只足垫注射后的厚度减去注射前的厚度，得到足垫肿胀值，数据以10-4英寸为单位表示。通过从处理组（PBMC + 供体同种异体抗原、TT/DT或供体同种异体抗原 + TT/DT）的足垫肿胀值中减去对照组足垫肿胀值（PBMC + PBS），计算抗原特异性净肿胀。测试有效性需满足针对回忆抗原TT/DT的阳性对照反应超过PBS背景反应≥ 25×10-4英寸。</li>
	<li>通过以下公式比较每次注射的净肿胀值，确定供体抗原存在下回忆反应的抑制率： 
	<img alt="抑制率公式；用于测量抗原相关抑制结果的方程。" fo:src="/files/ftp_upload/4454/4454eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4454/4454eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="公式 1"></li>
</ol>

<ol><li>Carrodeguas, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans+vivo+analysis+of+human+delayed-type+hypersensitivity+reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Trans vivo analysis of human delayed-type hypersensitivity reactivity.</a> Hum. Immunol. 60, 640-651 (1999).</li>
<li>VanBuskirk, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+allograft+acceptance+is+associated+with+immune+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Human allograft acceptance is associated with immune regulation.</a> J. Clin. Invest. 106, 145-155 (2000).</li>
<li>Burlingham, W. J., Jankowska-Gan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+strain+and+injection+site+are+crucial+for+detecting+linked+suppression+in+transplant+recipients+by+trans-vivo+DTH+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Transplant%22%5BJournal%5D)">Mouse strain and injection site are crucial for detecting linked suppression in transplant recipients by trans-vivo DTH assay.</a> Am. J. Transplant. 7, 466-470 (2007).</li>
<li>Burlingham, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+tolerance+to+a+maternal+kidney+transplant+is+selective+for+HLA+class+II%3A+Evidence+from+trans-vivo+DTH+and+alloantibody+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Immunology%22%5BJournal%5D)">Loss of tolerance to a maternal kidney transplant is selective for HLA class II: Evidence from trans-vivo DTH and alloantibody analysis.</a> Human Immunology. 61, 1395-1402 (2000).</li>
<li>Geissler, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+liver+allograft+acceptance+and+the+%27tolerance+assay%27%3A+In+vitro+anti-donor+T+cell+assays+show+hyporeactivity+to+donor+cells+but%2C+unlike+DTH%2C+fail+to+detect+linked+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Human liver allograft acceptance and the 'tolerance assay': In vitro anti-donor T cell assays show hyporeactivity to donor cells but, unlike DTH, fail to detect linked suppression.</a> Transplantation. 72, 571-580 (2001).</li>
<li>Jankowska-Gan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+liver+allograft+acceptance+and+the+%27tolerance+assay%27.+II.+donor+HLA-A%2C+-B+but+not+DR+antigens+are+able+to+trigger+regulation+of+DTH%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human liver allograft acceptance and the 'tolerance assay'. II. donor HLA-A, -B but not DR antigens are able to trigger regulation of DTH.</a> Hum. Immunol. 63, 862(2002).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minor+H+Antigen+HA-1-specific+Regulator+and+Effector+CD8%2B+T+Cells%2C+and+HA-1+Microchimerism%2C+in+Allograft+Tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Minor H Antigen HA-1-specific Regulator and Effector CD8+ T Cells, and HA-1 Microchimerism, in Allograft Tolerance.</a> J. Exp. Med. Cai, J., et al. 199, 1017-1023 (2004).</li>
<li>Rodriguez, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+regulation+and+graft+survival+in+kidney+transplant+recipients+are+both+enhanced+by+human+leukocyte+antigen+matching%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Transplant%22%5BJournal%5D)">Immune regulation and graft survival in kidney transplant recipients are both enhanced by human leukocyte antigen matching.</a> Am. J. Transplant. 4, 537-543 (2004).</li>
<li>Xu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+CD4%2BCD25low+adaptive+T+regulatory+cells+suppress+delayed-type+hypersensitivity+during+transplant+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human CD4+CD25low adaptive T regulatory cells suppress delayed-type hypersensitivity during transplant tolerance.</a> J. Immunol. 178, 3983-3995 (2007).</li>
<li>Derks, R. A., Jankowska-Gan, E., Xu, Q., Burlingham, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+type+determines+the+mechanism+of+bystander+suppression+by+adaptive+T+regulatory+cells+specific+for+the+minor+antigen+HA-1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell type determines the mechanism of bystander suppression by adaptive T regulatory cells specific for the minor antigen HA-1.</a> J. Immunol. 179, 3443-3451 (2007).</li>
<li>Jankowska-Gan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+reduction+of+immunosuppression+in+older+renal+transplant+recipients+who+exhibit+donor-specific+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Successful reduction of immunosuppression in older renal transplant recipients who exhibit donor-specific regulation.</a> Transplantation. 88, 533-541 (2009).</li>
<li>Jankowska-Gan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pretransplant+immune+regulation+predicts+allograft+outcome%3A+bidirectional+regulation+correlates+with+excellent+renal+transplant+function+in+living-related+donor-recipient+pairs%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Pretransplant immune regulation predicts allograft outcome: bidirectional regulation correlates with excellent renal transplant function in living-related donor-recipient pairs.</a> Transplantation. 93, 283-290 (2012).</li>
<li>Knechtle, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+and+limited+use+of+tacrolimus+to+avoid+rejection+in+an+alemtuzumab+and+sirolimus+regimen+for+kidney+transplantation%3A+clinical+results+and+immune+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Transplant%22%5BJournal%5D)">Early and limited use of tacrolimus to avoid rejection in an alemtuzumab and sirolimus regimen for kidney transplantation: clinical results and immune monitoring.</a> Am. J. Transplant. 9, 1087-1098 (2009).</li>
<li>Haynes, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor-specific+indirect+pathway+analysis+reveals+a+B-cell-independent+signature+which+reflects+outcomes+in+kidney+transplant+recipients%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Transplant%22%5BJournal%5D)">Donor-specific indirect pathway analysis reveals a B-cell-independent signature which reflects outcomes in kidney transplant recipients.</a> Am. J. Transplant. 12, 640-648 (2012).</li>
<li>Burlingham, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-17-dependent+cellular+immunity+to+collagen+type+V+predisposes+to+obliterative+bronchiolitis+in+human+lung+transplants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">IL-17-dependent cellular immunity to collagen type V predisposes to obliterative bronchiolitis in human lung transplants.</a> J. Clin. Invest. 117, 3498-3506 (2007).</li>
<li>Bobadilla, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TH-17%2C+Monokines%2C+Collagen+Type+V%2C+and+Primary+Graft+Dysfunction+in+Lung+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">TH-17, Monokines, Collagen Type V, and Primary Graft Dysfunction in Lung Transplantation.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 177 (6), (2008).</li>
<li>Olson, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+prostate+tumor+antigen-specific+CD8%2B+regulatory+T+cells+are+inhibited+by+CTLA-4+or+IL-35+blockade%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human prostate tumor antigen-specific CD8+ regulatory T cells are inhibited by CTLA-4 or IL-35 blockade.</a> J. Immunol. 189, 5590-5601 (2012).</li>
</ol>

本文作者无任何利益冲突需要披露。

体内跨物种DTH检测是一种新型诊断试验，具有在移植、癌症和自身免疫性疾病患者中评估细胞介导免疫反应的潜在临床应用价值。该检测方法的价值在于，它不仅可用于监测记忆性T效应细胞反应，还能检测T调节细胞反应。一种可靠的人类DTH调节检测方法，可能有助于预测那些拟接受单药治疗或免疫耐受试验的患者在停用免疫抑制剂后的安全性。
Tv-DTH 在检测 MHC 间接识别途径方面非常敏感。然而，Tv-DTH 可经过改良用于检测针对完整供体 MHC 分子的直接同种反应。为了检测供体抗原相关的 DTH 抑制作用，可将表达单一供体 HLA I 类或 II 类分子的 EBV 转化 B 淋巴母细胞样细胞系（EBV-LCL）与患者的外周血单个核细胞（PBMC）共同注射。当在 DTH 实验中使用 EBV-LCL 作为抗原来源时，细胞需接受 10,000 rad 的γ射线照射，并将 200,000 个细胞与 PBMC 共同注射至 SCID 小鼠的足垫中。
在建立 Tv-DTH 实验的过程中，我们发现多种条件可影响该检测。其中最重要的是对旁观者抑制效应检测的要求...

<table><tbody><tr><td>用于血液采集的ACD管</td><td>BD</td><td>02-684-26</td><td></td></tr><tr><td>淋巴细胞分离液</td><td>Cellgro</td><td>25-072-CV</td><td></td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液</td><td>Cellgro</td><td>21-031-CM</td><td>无钙 &amp;和镁</td></tr><tr><td>ACK裂解缓冲液</td><td>BioWhittaker</td><td>10-548E</td><td></td></tr><tr><td>TT/DT 或 EBV</td><td>赛诺菲巴斯德公司 / 梅里迪安生命科学公司</td><td></td><td>TT/DT 25 &amp;mu;g/注射 EBV 8 &amp;mu;克/注射</td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂 PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>78830</td><td></td></tr><tr><td>用于细胞计数的伊红</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E-6003</td><td></td></tr><tr><td>同种异体抗原</td><td></td><td></td><td>纯化的HLA抗原，可使用合成的同种异体多肽替代供体无细胞裂解物</td></tr><tr><td>50 ml 无菌离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-443-18</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 移液管和移液器</td><td>BD Falcon</td><td>13-675-20</td><td></td></tr><tr><td>2 ml 安全锁扣管</td><td>Costar</td><td>3213</td><td></td></tr><tr><td>1000 &amp;mu;升，100 &amp;mu;l , 10 &amp;mu;l 带无菌吸头的移液器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Fisher</td><td>02-671-10</td><td></td></tr><tr><td>大型离心机和微型离心机</td><td>贝克曼库尔特／艾本德</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1/2 cc 或 1 cc 胰岛素注射器</td><td>Becton Dickinson</td><td>14-826-79</td><td>28 号针头</td></tr><tr><td>Vibracell 超声波破碎仪</td><td>Divtech Equipment Co. Sonocs Materials Inc</td><td></td><td>2 mm 探针</td></tr><tr><td>测微厚度计</td><td>日本三丰公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SCID 小鼠</td><td>Harlan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Piramal Healthcare</td><td></td><td>吸入麻醉</td></tr></tbody></table>

抗原特异性调节的跨体迟发型超敏反应检测

Trans-vivo Delayed Type Hypersensitivity Assay for Antigen Specific Regulation

迟发型超敏反应（DTH）是T细胞依赖性免疫应答的一种快速体内表现，针对宿主免疫系统近期曾接触过的外来抗原（Ag）。DTH反应通常分为致敏阶段和攻击阶段，前者指初次接触抗原的过程，后者通常在致敏后数天发生。皮肤试验中未能对回忆抗原（recall Ag）产生迟发型超敏反应，常被视为无应答（anergy）的证据。传统的DTH检测已有效应用于多种微生物感染的诊断。
尽管直接迟发型超敏反应（DTH）与移植患者中常见的免疫特征（如淋巴细胞浸润、水肿和组织坏死）相似，但由于直接注射可能导致受者对供体抗原致敏并引发移植物丢失，因此该方法在移植患者中并非可行的诊断技术。为避免这一问题，研究人员开发了人源化小鼠“跨体”（trans-vivo）DTH检测方法1,2。该检测本质上是一种转移性DTH试验，将人类外周血单个核细胞（PBMCs）和特异性抗原皮下注射至未致敏小鼠的耳廓或足垫，18–24小时后测量类似DTH的肿胀反应3。在血管丰富的小鼠组织中，由人类抗原呈递细胞（如巨噬细胞或树突状细胞）向T细胞呈递抗原，可触发炎症级联反应，并募集小鼠免疫细胞，从而引起肿胀反应。该反应具有抗原特异性，且依赖于先前的抗原致敏状态。Tv-DTH检测中出现阳性供体反应性DTH反应，表明该移植患者已对移植物同种异体抗原产生促炎性免疫倾向。
该实验最重要的特点是还可用于检测引起旁观者抑制的调节性T细胞。在存在供体抗原的情况下，对DTH回忆反应的旁观者抑制是移植后移植物被接受的受者的典型特征2,4-14。通过Tv-DTH对移植受者进行同种反应性和免疫调节的监测，可能识别出一部分患者，这些患者可在不增加排斥反应风险或肾功能恶化的情况下受益于免疫抑制剂的减量。
一个有前景的领域是Tv-DTH检测在自身免疫15,16监测以及肿瘤免疫学17中的应用。

1. 使用 Tv-DTH 检测法评估肾移植受者对供体抗原的特异性反应
为了检测肾移植受者对供体反应的细胞免疫，我们将这些患者的外周血单个核细胞（PBMC）分别与供体抗原单独孵育，或同时与供体抗原和回忆抗原破伤风类毒素（TT）共同孵育。作为阳性对照，细胞仅与TT孵育。我们在移植受者中观察到三种主要的迟发型超敏反应模式（图1）。所有患者均对回忆抗原（TT）表现出强烈反应。患者#62呈现调节性模式，其特征是对供体抗原的反应较弱，且在供体抗原存在时对回忆抗原的反应出现显著的关联性抑制（67%）。该模式已被发现与器官同种异体移植物耐受相关。患者#48表现为非调节性模式，其特征是对供体抗原反应较弱，但无关联性抑制（或关联性抑制&lt;50%）。此模式在使用免疫抑制药物的患者中较为常见。然而，部分仍在接受移植后免疫抑制治疗的患者仍可能表现出供体抗原相关的DTH反应抑制。患者#8表现为供体致敏模式，其特征是对供体抗原反应强烈，且无关联性抑制。临床病例研究显示，此类反应与移植物排斥相关8。
2. 肾移...

我们介绍了一种有价值的诊断检测方法，该方法有可能用于决定在移植后撤除免疫抑制剂，而不会增加移植物排斥的风险。该检测利用迟发型超敏反应的原理，能够准确评估受者针对供体产生的特异性效应免疫应答和调节性免疫应答。

迟发型超敏反应（DTH）是机体对既往接触过的外来抗原（Ag）所产生的一种由T细胞介导的免疫反应的快速体内表现，该反应发生在宿主……

本实验的总体目标是利用体内转移DTH（迟发型超敏反应）检测方法，监测人体内针对抗原的促炎性和抗炎性特异性免疫应答。首先，从受试者的外周血中分离外周血单个核细胞（PBMC）。然后将PBMC悬液与磷酸盐缓冲液（PBS）混合。回忆抗原检测抗原以及检测抗原加回忆抗原。进行足垫预注射测量，并将制备好的混合物注射到小鼠足垫中。24小时后重复测量足垫厚度。三。确定的DTH反应模式可能包括调节性、非调节性和致敏性。体内转移延迟型超敏反应检测可用于确定临床参数，例如同种反应性，其中抗原来源为移植供体的细胞。与现有的体外方法相比，该技术的主要优势在于，使用单一检测系统即可轻松检测针对同种抗原、自身抗原或肿瘤抗原的促炎性和调节性反应。我实验室的研究人员 Egon 现在将演示该实验步骤：使用采集于酸性柠檬酸葡萄糖管中的新鲜人外周血，以避免血小板活化。采用淋巴细胞分离液，按照标准方法分离外周血单个核细胞（PBMC）。用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤 PBMC 制剂，以去除污染的血小板。如果存在明显的红细胞污染，则使用CK裂解缓冲液裂解红细胞。随后用PBS Resus再洗涤两次。将PBMC重悬于PBS中，用于同种异体抗原实验时，浓度为每毫升1000万个PBMC。从供体外周血中分离出P BMCs，分离方法采用前文所示步骤。随后重悬。将供体细胞重悬于PBS中，浓度为每毫升1.2亿个细胞，并加入1微摩尔的PMSF以防止蛋白质降解。现在使用2毫米探头超声仪，以七次每次一秒的脉冲处理细胞悬液。使用血细胞计数板验证细胞破碎率是否超过90%。接下来，在 4 °C 条件下以 14,000 RPM 离心混合物 20 分钟。小心将上清液转移至两个安全锁管中，并采用标准方法测定每次注射的蛋白浓度。将七份各含 10⁶ 个 P BMCs 的样品分装至 2 毫升中。使用安全锁管通过离心沉淀细胞。首先，用35 µL PBS制备PBMC的阴性对照悬液。然后，对于阳性对照，加入25 µL回忆性抗原（破伤风类毒素、白喉类毒素），并用PBS调整注射体积至35 µL。根据评估供体特异性反应的实验设计，将细胞沉淀重悬于10微升供体抗原和25微升磷酸盐缓冲液（PBS）中，总体积为35微升。为评估实验性供体抗原特异性调节，将细胞沉淀重悬于35微升溶液中，其中加入10微升供体抗原和25微升回忆性破伤风类毒素-白喉类毒素（TT DT）抗原。麻醉小鼠后，使用异氟烷维持麻醉状态，将弹簧加载的卡尺置于足垫中心，卡尺一端接触足部最后一个行走垫，以此作为基准，确保在读数稳定时测量位置的一致性。记录足垫注射前的足垫基础厚度。将注射器针头朝向脚趾方向，针尖斜面向上。随后，开始将每种细胞悬液分别皮下注射至小鼠后肢足垫。第一步，向右侧足垫缓慢注射阴性对照制剂。接着，向左侧足垫注射PBMC加TT dt的阳性对照。然后将小鼠放回笼中。第二步，将PBMC加同种异

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