抗原特异性调节的跨体迟发型超敏反应检测

本实验的总体目标是利用体内转移DTH检测方法，监测人类受试者体内针对抗原的促炎性和抗炎性特异性免疫应答。首先，从人类受试者的外周血中分离外周血单个核细胞。然后将PBMC悬液与PBS混合。

回忆抗原检测抗原以及检测抗原加回忆抗原。进行足垫预处理测量，并将制备好的混合物注射到小鼠足垫中。24小时后重复测量足垫厚度。三。

确定的DTH反应模式可能包括调节性、非调节性和致敏性。体内转移延迟型超敏反应检测可用于确定临床参数，例如同种反应性，其中抗原来源为移植供体的细胞。与现有的体外方法相比，该技术的主要优势在于，可利用单一检测系统轻松检测针对同种抗原、自身抗原或肿瘤抗原的促炎性和调节性反应。

我实验室的研究人员 Egon 现在将演示该实验步骤：使用酸性柠檬酸葡萄糖抗凝管采集的新鲜人外周血，以避免血小板活化。采用淋巴细胞分离液按标准方法分离外周血单个核细胞（PBMC）。用 PBS 洗涤 PBMC 制备物，以去除污染的血小板。

如果存在明显的红细胞污染，则使用CK裂解缓冲液裂解红细胞。随后用PBS Resus再洗涤两次。将PBMC重悬于PBS中，用于同种异体抗原实验时，浓度为每毫升1000万个PBMC。

从供体外周血中分离出P BMCs，分离方法采用前文所示步骤。随后重悬。将供体细胞重悬于PBS中，浓度为每毫升1.2亿个细胞，并加入1微摩尔的PMSF以防止蛋白质降解。

现在使用2毫米探头超声仪，以七次每次一秒的脉冲处理细胞悬液。使用血细胞计数板验证细胞破碎率是否超过90%。

接下来，在4 °C条件下以14,000 RPM离心混合物20分钟。小心将上清液转移至两个安全锁管中，并通过标准方法测定每次注射样品的蛋白浓度。将七份各含10的6次方个P BMCs的细胞分装至2毫升中。

使用安全锁管通过离心沉淀细胞。首先，用35 µL PBS制备PBMC的阴性对照悬液。然后，对于阳性对照，加入25 µL回忆性抗原（破伤风类毒素、白喉类毒素），并用PBS调整注射体积至35 µL。

根据评估供体特异性反应的实验设计，将细胞沉淀重悬于10微升供体抗原和25微升磷酸盐缓冲液（PBS）中，总体积为35微升。为评估实验性供体抗原特异性调节，将细胞沉淀重悬于35微升溶液中，其中加入10微升供体抗原和25微升回忆性破伤风类毒素-白喉类毒素（TT DT）抗原。麻醉后，将异氟烷处理的小鼠足垫置于弹簧加载的卡尺中心，卡尺一端接触足部最后一个行走垫，以此作为基准，确保在读数稳定时测量位置的一致性。

记录足垫注射前的足垫基础厚度。将注射器针头朝向脚趾方向，针尖斜面向上。随后，开始将每种细胞悬液皮下注射至小鼠后足垫。

首先，向右侧足垫缓慢注射阴性对照制剂。接着，向左侧足垫注射含 TT dt 的 PBMC 阳性对照。然后将小鼠放回笼中。

第二步，将PBMC加同种异体抗原注射至右侧足垫，将PBMC加同种异体抗原及TT dt注射至左侧足垫。注射后18至24小时内确保无渗漏。用异氟烷麻醉每只小鼠，并重复测量足垫肿胀程度。

注射前从注射后的数值中减去每个足垫的厚度，以获得足垫肿胀值。然后通过从各处理组获得的足垫肿胀值中减去对照组足垫肿胀值，计算抗原特异性净肿胀值。验证阳性对照组对回忆抗原TT DT的反应，其读数应大于或等于25乘以10的负四次方英寸。

测试要被视为有效，必须存在对 PBS 的背景反应。接下来，确定在供体抗原存在下对回忆反应的抑制情况。本实验对肾移植受者进行供体抗原特异性反应及免疫调节功能的评估。

移植受者中存在三种主要的迟发型超敏反应模式：调节型、非调节型和致敏型。所有患者对回忆抗原tt这一阳性对照均表现出强烈反应。患者62号显示为调节型模式，其特征是对供体抗原反应较弱，且在供体抗原存在时，对回忆抗原的反应出现显著的关联性抑制。

这种模式已被发现与器官同种异体移植物耐受性相关。患者48表现出一种非调节性模式，其特征是对供体的反应较弱，但无关联性抑制。这种模式在服用免疫抑制药物的患者中经常被观察到。

8号患者表现出供体致敏模式，其特征是对供体抗原反应强烈，且无关联性抑制现象。该反应与移植物排斥相关。在临床病例研究中，对纳入观察性试验的受试者外周血单个核细胞（P BMCs）检测了针对供体特异性间接途径、效应T细胞及调节性T细胞反应，以评估供体特异性免疫调节在临床耐受中的作用。

对供体抗原的间接T细胞反应在不同入组群体中呈现出不同的谱型。随着患者的临床状态从耐受转变为慢性排斥，足垫肿胀程度逐渐增加。在此，连锁抑制实验用于检测调节性T细胞应答中针对供体抗原的间接途径反应。

这些数据显示，从耐受性最高的患者到耐受性中等，再到耐受性最低的慢性排斥患者，其免疫调节反应呈逐渐下降趋势。综合来看，通过体内转移性迟发型超敏反应（trans vivo DTH）实验所检测的免疫调节作用似乎是肾同种异体移植物得以接受的重要机制。

一个有前景的研究方向是将TDTH检测法应用于自身免疫的监测。我们对V型胶原在闭塞性细支气管炎（BOS）病理过程中的作用的研究发现，在肺移植受者中，对V型胶原呈阳性反应的患者发生BOS的相对风险最高，而健康对照者或对其他胶原呈阳性反应的患者则未观察到这一现象。

四例肾移植后出现Goodpasture综合征的患者常对V型胶原产生反应。TDTH试验还可用于检测癌症患者外周血单个核细胞（PBMC）对肿瘤特异性抗原的反应性。例如，前列腺癌患者体内若存在PAP特异性的调节性T细胞，可能会限制其对PAP抗原疫苗接种的免疫应答。

TRANSVAAL DTH 检测是一种新型诊断试验，在评估移植、癌症和自身免疫性疾病患者的细胞介导免疫反应方面具有临床应用价值。该检测不仅可用于监测 T 效应细胞的回忆反应，还可用于检测调节性 T 细胞反应，因其不依赖特定细胞因子的测定来识别效应 T 细胞或调节性 T 细胞，因此具有重要价值。该方法灵活性高，适用范围广泛。