跨体内迟发型变态反应检测方法的抗原特异性调节

该程序的总体目标是使用跨体内 DTH 测定来监测人类受试者的促炎和抗炎抗原特异性反应。首先，从人类受试者的外周血中分离外周血单核细胞。然后将 PBMC 制备物与 PBS 混合。

召回抗原检测抗原和检测抗原加召回抗原。继续进行脚垫 prem 测量并将准备好的混合物注入滑橇小鼠中。脚垫在 24 小时后重复测量。三。

DTH 反应的明确模式可能是调节性的、非调节性的和敏感的。反体内迟发型超敏反应测定可用于确定临床参数，如同种异体反应反应，其中抗原来源是移植供体的细胞。与现有的体外方法相比，该技术的主要优点是，可以使用单个检测系统轻松检测对同种异体抗原、自身抗原或肿瘤抗原的促炎和调节反应。

我实验室的研究人员 Egon 现在将演示使用收集在柠檬酸葡萄糖管中的新鲜人外周血来避免血小板活化的程序。根据标准方法使用淋巴细胞分离培养基分离 PBMC。用 PBS 洗涤 PBMC 制剂以去除污染的血小板。

如果存在明显的红细胞污染，请使用 CK 裂解缓冲液进行红细胞裂解。然后用 PBS Resus 再进行两次洗涤。将 PBMC 悬浮在 PBS 中，浓度为每毫升 1000 万个 PBMC，用于同种异体抗原。

从 P BMC 开始，使用前面显示的程序从供体外周血中分离。然后复苏。将供体细胞悬浮在浓度为每毫升 1.2 亿个细胞的 PBS 中，并添加 1 微摩尔 PMSF 以防止蛋白质降解。

现在使用 7 个 1 秒脉冲和 2 毫米探针 sonica 对细胞悬液进行超声处理。使用血细胞计数器。验证超过 90% 的细胞的破坏。

接下来，在 4 摄氏度下以 14， 000 RPM 的速度离心混合物 20 分钟。小心地将上清液转移到两个安全的锁定管中，并通过标准方法测定每次注射的蛋白质浓度。将 7 乘以 10 分装到第六个 P BMC 中，分装成 2 毫升。

Safe lock 管通过离心沉淀细胞。首先，在 35 微升 PBS 中制备 PBMC 的阴性对照悬浮液。然后对于阳性对照，加入 25 微升 A 召回抗原、破伤风、类毒素、白喉、类毒素，并用 PBS 将注射量调节至 35 微升。

根据评估供体特异性反应的实验设计，将细胞沉淀重悬于 10 μL 供体抗原和 25 μL PBS 中，总体积为 35 μL。为了评估实验供体抗原特异性调节，通过添加 10 微升供体抗原和 25 微升召回 TT DT 抗原，复苏将细胞沉淀悬浮在 35 微升中。麻醉后，带有 isof fluorine 的滑移鼠标将弹簧加载的卡尺放在脚垫的中心，其一侧接触脚的最后一个步行垫，以提供基准，以便在仪表读数稳定时保持测量点一致。

记录脚垫注射的基线脚垫厚度。放置注射器时，针头指向脚趾，斜面朝上。现在开始将每个细胞悬液皮下注射到鼠标的后脚垫中。

第一，慢慢地在右脚垫上注射阴性对照制剂。接下来，用 PBMC 加 TT dt 的阳性对照注射左脚垫。现在将鼠标返回到其固定架上。

第二步，在右脚垫上注射 PBMC 加同种异体抗原，在左脚垫上注射 PBMC 加同种异体抗原加 TT dt。确保注射后 18 至 24 小时左右没有渗漏。用 isof fluorine 麻醉每只小鼠并重复测量脚垫肿胀。

从注射后值中减去注射前每个脚垫的厚度，得到脚垫膨胀值。然后通过从治疗中获得的脚垫肿胀值中减去对照脚垫肿胀值来计算抗原特异性净肿胀。验证阳性对照读数阳性对照对召回抗原 TT DT 的反应大于或等于 25 乘以 10 到负 4 英寸以上。

需要对 PBS 的背景反应才能使测试被视为有效。接下来，确定在供体抗原存在下对回忆反应的抑制。该实验评估肾移植受者的供体抗原特异性反应和调节。

移植受者迟发型超敏反应主要有三种模式，调节型、非调节型和敏化型。所有患者都对回忆抗原 tt 的阳性对照反应强烈。第 62 号患者表现出调节模式，其特征是对供体抗原的反应较弱，并且在供体抗原存在的情况下与回忆抗原反应有明显的连锁抑制。

这是已发现与器官同种异体移植物耐受性相关的模式。48 号患者表现出非调节模式，其特征是对供体的反应较弱，但没有连锁抑制。这种模式在服用免疫抑制药物的患者中经常观察到。

第 8 号患者表现出供体致敏模式，其特征是对供体抗原的高反应且无连锁抑制。这种反应与移植物排斥有关。在临床案例研究中，对参加观察性试验的受试者的 P BMC 进行供体特异性间接通路、T 效应和 T 调节反应的分析，以评估供体特异性调节在临床耐受性中的作用。

对供体抗原的间接 tector 反应揭示了不同入组组的不同谱系。随着患者的临床状态从耐受状态转变为长期排斥状态，脚垫肿胀会增加。在这里，连锁抑制测定测量 T 调节反应的抗供体间接途径。

这些数据显示，从最耐受的患者到中等到最低的慢性排斥患者，监管反应都有所减少。综合起来。通过跨体内 DTH 测定测量的免疫调节似乎是肾同种异体移植物接受的重要机制。

一个有前途的领域是 TDTH 测定在自身免疫监测中的应用。我们对 5 型胶原蛋白在毛细支气管炎 OBL 综合征病理过程中的作用的研究显示，在对胶原蛋白有阳性反应的患者中观察到 BOS 发展的相对风险最高。5 例 PBMC 来自肺移植受者，但未来自健康对照或胶原蛋白。

肾移植后 4 反应性好牧场综合征患者经常是胶原蛋白 5 反应性。TDTH 检测还可用于检测癌症患者 PBMC 对肿瘤特异性抗原的反应性。例如，前列腺癌患者中存在 PAP 特异性 T 调节细胞可能会限制对 PAP 抗原疫苗接种的反应。

德兰士瓦 DTH 检测是一种新型诊断测试，具有临床应用，用于评估移植癌症和自身免疫患者的细胞介导的免疫反应。它很有价值，因为它不仅可用于监测 t 效应器召回反应，而且还可用于检测 T 调节反应，因为它不依赖于特定的细胞因子测量来检测效应或调节性 T 细胞。它非常灵活且适用广泛。