干细胞衍生的抗原特异性调节性T细胞对自身免疫的发展

本实验的总体目标是开发一种产生干细胞衍生的发炎关节相关调节性 T 细胞的新方法，用于自身免疫性关节炎的免疫治疗。这种方法可以帮助回答自身免疫领域关于自身免疫性关节炎潜在免疫疗法的关键问题。该技术的主要优点是干细胞衍生的调节性 T 细胞是 nyped 且属于单一类型。

首先在 OP9 培养基中将感兴趣的饲养层细胞稀释至最小密度为每平方厘米第四个细胞的 10 倍，然后每 10 厘米培养皿接种 1 乘以 10 至第六个饲养层细胞。当细胞达到 80% 至 90% 汇合时，从培养物中取出培养基，并在每个培养皿的 OP9 培养基中接种 0.5 至 1 次 10 至第 5 个逆转录病毒转导的诱导型多能干细胞或 IPSC。5 天后，吸出培养基并用 10 ml PBS 洗涤细胞。

然后，在 37 摄氏度下，每皿用 4 毫升胰蛋白酶分离细胞。10 分钟后，用 8 mL IPSC 培养基终止反应，并拉动细胞进行离心。将沉淀重悬于 10 mL 新鲜 IPSC 培养基中，并将细胞重新接种到新的 10 cm 培养皿上。

让饲养层细胞在细胞培养箱中粘附在板上 30 分钟。然后，收集漂浮的 IPSC 并通过 70 微米过滤器过滤转导的细胞进行计数。在补充有 Murine-Flt3-配体的 OP9 培养基中，将 10 至 5 个 IPSC 接种到新鲜的 80% 至 90% 饲养层细胞汇合板上，然后将培养物放回培养箱中。

三天后，使用 10 毫升移液器用培养基清洗培养皿。然后，向培养皿中加入 5 mL 新鲜的 OP9 培养基，小心、有力地移液轻轻洗去任何半贴壁的 IPSC，不要破坏饲养层。用 10 毫升 PBS 重复洗涤以收获最后一个半贴壁细胞，将每个培养皿中的洗涤液拉入每个培养物的一个锥形管中。

离心细胞后，将沉淀重悬于 10 毫升补充有 Murine-Flt3-Ligand 和 IL-7 的 OP9 培养基中，并通过 70 微米过滤器过滤细胞。将每孔一种 IPSC 培养物接种到含有 80% 至 90% 汇合饲养层细胞单层的六孔培养板中，并将共培养物放回培养箱中。每两天用补充有 Murine-Flt3-Ligand 和 IL-7 的新鲜 OP9 培养基替换一半的培养基，每 4 到 6 天，根据需要将分化的 IPSCs 重新接种到带有新鲜饲养层细胞的新平板上。

首先用胰蛋白酶分离目标细胞培养物，并将每种细胞类型重悬于 10 mL 新鲜培养基中。将每种细胞培养物接种在一个新的 10 cm 培养皿中，并让饲养层细胞粘附在细胞培养箱中。30 分钟后，收集漂浮的 IPSC，并将培养物通过单独的 70 微米细胞过滤器，以去除细胞簇进行计数。

在冷 PBS 中以 1.5 倍/mL 浓度重悬每毫升 10 至第七个细胞，必要时再次过滤。然后，将 4 至 6 周龄的雌性 C57BL/6 小鼠一次一只放入小动物限制器中，并将每只小鼠 200 微升一种细胞过序转移到每只动物的尾静脉中。使用千分表卡尺测量双膝肿胀，以建立基线测量值。

细胞转移后 10 天，使用一毫升注射器在每只实验动物的尾巴基部向小鼠注射 100 微克在完全弗氏佐剂中乳化的甲基化 BSA。细胞转移后 17 天，通过关节内注射 20 μg 甲基化 BSA 和 100 μg 甲基化 BSA 和 100 μg 全卵清蛋白到左膝关节中诱导关节炎在 10 微升 PBS 中注入每个麻醉过继转移动物的右膝关节。诱发关节炎后 7 天，再次测量膝盖以计算膝关节直径增加的百分比，并手术切除髌骨。

用福尔马林固定关节。然后，在 EDTA 中脱钙后，将膝盖包埋在石蜡中，并获得四个微米切片用于组织化学染色和分析。第 28 天，抗原特异性 T 调节细胞表达高水平的 CD3 和抗原特异性 T 细胞受体。

这些细胞中的大多数还表达 CD25、CD127 和 CTLA-4，所有这些细胞在天然存在的 T 调节细胞中通常以较高的水平表达。事实上，FoxP3 在 IPSC 衍生的 T 调节细胞中仍然存在，即使在用 Notch 配体进行长期体外刺激后，如细胞内染色所检测到的那样。此外，这些抗原特异性 IPSC T 调节细胞在体外受到抗原脉冲脾细胞刺激时会产生抑制性细胞因子，表明这些细胞具有潜在的抑制性表型。

在 OVA 处理的膝关节中观察到 FoxP3 阳性细胞，在接受对照载体转导的 IPSC 的膝关节中没有明显的 FoxP3 阳性细胞。此外，与单独使用 FoxP3 载体相比，在接受 TCR-FoxP3 载体转导的 IPSC 的小鼠的膝盖中可以看到更多的 CD4 阳性、FoxP3 阳性、TCR3 Beta 5 阳性细胞，这表明抗原特异性 IPSC-Treg 细胞在过继转移到受体动物后迁移到抗原诱导的关节炎膝关节。当 OVA 存在时，IPSC 衍生的细胞过继转移也影响炎性膝关节肿胀的显着减少，但对对照甲基化 BSA 注射膝关节没有影响。

高分辨率 Micro-CT 成像进一步证实了肿胀减轻的积极效果，与仅注射 MBSA 的对照动物相比，在细胞转移治疗的膝关节中观察到的骨质流失减少。一旦集合起来，如果执行得当，这些深入的程序可以在六周内完成。在尝试这种技术时，重要的是要记住诱导 TCR-FoxP3 抗原转导的 IPSC 的灌注分化。

在此程序之后，还可以考虑抑制细胞因子的不同化合物，以回答有关抗原特异性 IPSC T reg 细胞的存活和质量的其他问题。开发后，这项技术为基于细胞的治疗领域的研究人员探索抗原特异性调节性 T 细胞在自身免疫性疾病中的作用铺平了道路。不要忘记，使用直接自动车身执行器可能非常危险，并且在执行程序时应始终采取预防措施，例如在基本的两个设施中工作。

感谢您的观看，祝您的实验好运。