Name: 干细胞衍生的抗原特异性调节性T细胞对自身免疫的发展 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: 了解利用诱导多能干细胞生成抗原特异性调节性T细胞的方法，用于自身免疫性关节炎的免疫治疗。该技术可产生均一的功能性Treg细胞，为细胞治疗研究提供新途径。

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本项目部分资金来自美国国立卫生研究院（R01AI121180、R21AI109239 和 K18CA151798）、美国糖尿病协会（1-16-IBS-281）以及宾夕法尼亚州卫生部（烟草和解资金），资助对象为 J.S.。

所有动物实验均经宾夕法尼亚州立大学医学院动物护理委员会（IACUC 方案编号 #45470）批准，并严格按照实验室动物护理与使用评估认证协会的指南进行。
1. 干细胞培养
<ol>
	<li>将10 ml 0.1% 明胶加入10 cm培养皿中，于37 °C（培养箱）孵育至少30分钟，以包被培养皿。</li>
	<li>移除培养皿中的明胶，接种3 × 106 照射处理的SNL76/7细胞，并在37 °C（培养箱）下用含10% FBS和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基培养一天。</li>
	<li>移除培养基，将解冻的iPSCs接种于SNL76/7细胞饲养层上，使用iPSC培养基（含15%胎牛血清、0.1 mmol/L非必需氨基酸、1 mmol/L L-谷氨酰胺和0.1 mmol/L β-巯基乙醇的DMEM培养基）进行培养9。小鼠iPS-MEF-Ng-20D-17细胞系由小鼠胚胎成纤维细胞经逆转录病毒转染Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc诱导获得，由日本京都大学前沿医学研究所Shinya Yamanaka博士提供。</li>
	<li>第3天更换新鲜培养基，并在显微镜下观察iPSC克隆。 
	注意：这些克隆呈小而闪亮的细胞簇或圆形细胞，边界清晰，在荧光显微镜下可见GFP表达。</li>
</ol>
2. 体外 Ag特异性iPSC-Treg的分化
<ol>
	<li>通过将OT-II TCR基因和FoxP3亚克隆至MiDR质粒中，并利用自切割肽2A连接，构建用于逆转录病毒转导的MiDR-TCRα-2A-TCRβ-2A-FoxP3载体10。</li>
	<li>使用Plat E细胞作为包装细胞系，对iPSCs进行逆转录病毒转导9。</li>
	<li>第0天，使用OP-9培养基（含20%胎牛血清和2.2 g/L碳酸氢钠的α-MEM培养基），以不低于104 个细胞/cm2的密度接种OP9-DL1-DL4-I-Ab细胞，每10 cm培养皿接种1 × 106个细胞。</li>
	<li>第3天，当OP9-DL1-DL4-I-Ab细胞达到80–90%汇合度时，吸除培养基，并在OP9-DL1-DL4-I-Ab细胞上接种0.5–1 × 105个iPSCs，使用OP-9培养基。 
	注：此步骤建立iPSCs与OP9-DL1-DL4-I-Ab细胞的共培养体系，定义为分化的第0天9。</li>
	<li>第5天，用移液器吸除10 cm培养皿中的培养基，用10 ml 1× PBS洗涤细胞，随后吸除PBS。加入4 ml 0.25%胰蛋白酶，于37 °C孵育10分钟。再加入8 ml iPSC培养基终止消化，重悬细胞后，在室温下以400 × g离心5分钟。
	<ol>
		<li>吸除上清液，将细胞重悬于10 ml iPSC培养基中。将重悬的细胞接种至新的10 cm培养皿中，放入培养箱孵育30分钟。 
		注：此步骤可去除OP9-DL1-DL4-I-Ab饲养层细胞，使正在分化的iPSCs保持悬浮状态。同时需持续培养OP9-DL1-DL4-I-Ab细胞，使其维持80–90%汇合度，用于后续共培养。</li>
		<li>30分钟后，收集悬浮细胞，经70 µm细胞筛过滤，并使用血细胞计数板计数细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将5 × 105个iPSCs接种至含80–90%汇合度OP9-DL1-DL4-I-Ab细胞的新鲜培养皿中，使用OP9培养基，并补充mFlt-3L至终浓度5 ng/ml。</li>
	<li>第8天，使用10 ml移液管吸取培养皿中原有培养基冲洗细胞。再加入5 ml OP-9培养基，轻柔而有力地吹打，以洗脱半贴壁细胞，注意避免破坏培养皿底部的OP9单层细胞。随后用10 ml PBS重复冲洗一次，以收集所有半贴壁的分化细胞。
	<ol>
		<li>合并两次冲洗液，于室温下以400 × g离心5分钟，将细胞重悬于含mFlt-3L（5 ng/ml）和mIL-7（1 ng/ml）的10 ml OP9培养基中，经70 µm细胞筛过滤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将细胞转移至含有80–90%汇合度OP9-DL1-DL4-I-Ab细胞的6孔板中，操作同步骤1.1。将一个10 cm培养皿收获的细胞转移至6孔板的一个孔中。</li>
	<li>第10天，更换一半培养基为新鲜OP9培养基，补充mFlt-3L（5 ng/ml）和mIL-7（1 ng/ml）。此后每两天重复一次此操作。</li>
	<li>根据细胞生长情况，每4–6天将正在分化的iPSCs重新接种至铺有新鲜OP9-DL1-DL4-I-Ab细胞层的培养皿中，操作如步骤1.1所述。</li>
</ol>
3. 评估 体外 调节性T细胞的分化与成熟
<ol>
	<li>不同分化阶段iPSCs的形态学变化
	<ol>
		<li>监测iPSCs与OP9-DL1-DL4-I-A的共培养b 每天在20倍明场显微镜下观察活细胞。第5天时，观察具有中胚层样特征的克隆集落，例如扁平状细胞。第8天时，观察小的、圆形的细胞簇，这些代表正在分化的细胞。</li>
		<li>使用台盼蓝排斥法对细胞进行计数，以检测活细胞的数量和百分比。细胞活力的计算方法为：将血细胞计数板四个计数区域内的活细胞总数除以细胞总数。若细胞吸收了台盼蓝，则视为死亡或无活力。记录从培养物中收获的活细胞数量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>诱导多能干细胞分化过程的流式细胞术分析
	<ol>
		<li>在共培养的第5、7、11、15、19、21和28天，按照步骤25使用0.25%胰蛋白酶消化收集细胞。</li>
		<li>在使用不同荧光素偶联抗体进行表面染色之前，将1 × 10⁶个细胞与Fc受体阻断剂共同孵育6 在4 °C下，用100 µl以PBS稀释的Fc阻断剂2.4G2（终浓度为10 µg/ml）孵育细胞20分钟，以防止抗体与细胞表面Fc受体结合。</li>
		<li>在第5、7、11、15、19、21和28天，使用1 x 106 使用不同荧光素标记的抗体对细胞进行流式细胞术分析，以检测细胞表面标志物，包括 CD3、TCRβ、CD4、CD8、CD25 和 CTLA4。</li>
		<li>Fc阻断后，用10 ml PBS洗涤细胞，并在4 °C下用不同荧光素偶联的抗体孵育20分钟，随后使用15色流式细胞仪进行流式细胞术分析。每106 用100 µl PBS稀释的细胞</li>
		<li>第28天，通过流式细胞术分析细胞11 CD4上的与门+ CD8+ 使用CD4和CD8荧光染料偶联染色标记细胞；检测TCRVα2、TCRVβ5、CD25、CTLA-4和FoxP3的表达情况（图1）。对于FoxP3染色，固定细胞并进行透膜处理，然后进行抗体染色11.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>体外 iPSCs的抗原刺激
	<ol>
		<li>在共培养的第28天，通过收集悬浮细胞收获iPSC-Treg。用0.25%胰蛋白酶对剩余贴壁细胞进行消化（同步骤2.5），并将细胞重悬于8 ml iPSC培养基中。室温下400 × g离心5 min，吸除上清液，再将细胞重悬于10 ml培养基中。
		<ol>
			<li>将重悬的细胞在新的10 cm培养皿中于37 °C孵育30分钟，收集悬浮细胞。用预冷的PBS洗涤细胞。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>孵育 3 x 106 来自C57BL/6 Rag1-/-小鼠脾脏的脾细胞，用200 µl含5 μM卵清蛋白肽的培养基处理（OVA323-339在96孔板中，4 °C下孵育30分钟11.</li>
		<li>将Tregs与OVA混合323-339-脉冲 脾细胞与靶细胞以1:4的比例混合（使用0.75 × 10⁶个脾细胞）6 Tregs）。在37 °C的CO₂培养箱中孵育2 在培养箱中培养40小时。在最后4小时内，向培养物中加入4 µl稀释的布雷菲德菌素A（实际浓度为1,000倍，用1×培养基稀释）。</li>
		<li>用0.25%胰蛋白酶消化收集细胞（同步骤2.5），用10% NaN洗涤3 以及0.5 M EDTA溶液（FACS缓冲液），用100 µl稀释后的（终浓度为10 µg/ml）Fc阻断剂2.4G2进行封闭，然后按照步骤3.2.3–3.2.4的方法对表面标志物CD4、CD8、TCRVα2和TCRVβ5进行染色。</li>
		<li>用 PBS 中的 4% 多聚甲醛溶液固定细胞，在细胞表面染色后，加入 100 µl 1x 透化缓冲液进行透化处理。 注意！ 多聚甲醛具有致敏性、致癌性和毒性。</li>
		<li>用荧光染料标记的 TGF-β 和 IL-10 抗体在避光条件下染色 20 分钟。每 10⁶ 个细胞使用 0.200 µg 抗体6 细胞用100 µl PBS稀释。使用15色流式细胞仪检测细胞内TGF-β和IL-10的产生。图2).</li>
		<li>在流式细胞术分析前，用预冷的FACS缓冲液洗涤细胞三次11.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在体 Ag特异性iPSC-Treg的持久性
	<ol>
		<li>在OP9-DL1-DL4-I-A上共培养8天后b 细胞，将步骤 3.3.1 中获得的诱导多能干细胞来源的前体调节性 T 细胞（Thy1.2）转移至 Thy 1.1 同源嵌合小鼠（4–6 周龄）&#160;通过尾静脉注射，无需麻醉。在进行尾静脉注射前，使用红外灯照射尾部5分钟以扩张尾静脉。尾静脉扩张后，将小鼠置于固定器中，并过继转移3 x 106 细胞用200 μl PBS重悬，通过尾静脉注射。</li>
		<li>Treg 转移6周后，通过CO2&#160;窒息&#160;随后进行颈椎脱位，确认小鼠已停止呼吸。使用剪刀和镊子剪开腹膜外层皮肤，并轻轻向后拉开，以暴露衬于腹腔内的内层腹膜。分离注射过的Thy 1.1同源小鼠的脾脏和外周淋巴结。</li>
		<li>从脾脏和淋巴结中通过机械破碎法收集细胞，制备单细胞悬液。加入5 ml ACK裂解缓冲液，室温孵育5分钟，以裂解红细胞。离心收集细胞，用10 ml预冷的FACS缓冲液洗涤脾细胞或淋巴细胞。</li>
		<li>洗涤后，按照步骤 3.2.2 的方法，在 4 °C 下用 Fc 阻断剂 2.4G2 处理细胞 20 分钟，并加入 100 µl 稀释的荧光染料标记的抗 Thy 1.2 抗体进行染色。</li>
		<li>用10 ml FACS缓冲液洗涤细胞，随后进行流式细胞术分析11.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 体内 自身免疫性关节炎的成熟与抑制
<ol>
	<li>按照步骤 2.1 构建质粒。</li>
	<li>按照步骤 2.2 进行逆转录病毒转导9。</li>
	<li>体内小鼠T细胞分化及关节炎诱导。
	<ol>
		<li>在含有细胞因子 mFlt-3L 和 mIL-7 的条件下，将转导了 OT-II TCR/FoxP3 的诱导性多能干细胞（OT-II-FoxP3/iPSCs）、仅转导 FoxP3 的诱导性多能干细胞以及转导 DsRed 的诱导性多能干细胞，在 OP9-DL1-DL4-I-Ab 基质细胞上共培养 8 天，具体操作参见步骤 2.1 - 2.6。</li>
		<li>用胰蛋白酶消化 10 cm 培养皿中的三类细胞，将每块培养皿的细胞重悬于 10 ml 新鲜培养基中，转移至新的 10 cm 培养皿，放回培养箱孵育 30 分钟。30 分钟后，收集悬浮细胞。</li>
		<li>将细胞通过 70 µm 细胞筛网以去除细胞团块，并使用血细胞计数板计数。用预冷的 PBS 将细胞浓度调整至 1.5 × 107 个细胞/ml，必要时再次过滤。细胞置于冰上保存，直至进行过继性细胞转移至小鼠体内。</li>
		<li>通过尾静脉向三组 4 - 6 周龄雌性 C57BL/6 小鼠分别注射 200 µl 细胞悬液（含 3 × 106 个细胞），具体操作参见步骤 3.4.1。</li>
		<li>细胞转移后第 10 天，使用 1 ml 注射器在小鼠尾根部皮下注射 100 µg 以弗氏完全佐剂乳化的 mBSA。</li>
		<li>第 17 天，使用异氟烷麻醉机（依据 IACUC 指南）对小鼠进行麻醉，诱导浓度为 4 - 5%，维持浓度为 1 - 2%。通过关节内注射方式诱导关节炎：向左侧膝关节注射含 20 µg mBSA 的 10 µl PBS，向右侧膝关节注射含 20 µg mBSA 和 100 µg 全长 OVA 的 10 µl PBS。关节炎发生后，可在垫料中放置食物和凝胶补给包。&#160;小鼠安乐死标准如下：体况评分（BCS）为 2/5 或濒死状态、严重恶病质和/或持续卧床不起（持续 24 小时&#160;），或疾病严重程度评分为 4 分。&#160; 4 分表示红斑和严重肿胀累及踝关节、足部及脚趾，或肢体发生关节强直。&#160;</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对转导 OT-II TCR/FoxP3 的诱导性多能干细胞进行表征。
	<ol>
		<li>使用荧光显微镜（20X）观察未固定的活体 DsRed+ GFP+ 细胞。</li>
		<li>通过 Western blot 和流式细胞术11 检测基因整合与表达情况。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Treg 细胞的发育与成熟。
	<ol>
		<li>细胞转移后第 2、4 和 6 周处死小鼠。安乐死时，首先在每笼中使用 1 - 2 L CO2 进行第一阶段处理；待动物意识丧失后，将 CO2 流速提高至 4 - 5 L/min，通过 CO2 吸入法完成安乐死。剪开腹膜外层皮肤，用镊子轻轻向后牵拉以暴露腹腔内壁，取出脾脏并分离引流淋巴结。</li>
		<li>使用细胞筛网和 1 ml 注射器通过机械法将脾脏和淋巴结组织研磨成单细胞悬液，溶于 1% iPSC 培养基中。将含有细胞悬液的离心管在 400 g 条件下离心 5 分钟。弃上清后，用 5 ml ACK 裂解缓冲液重悬细胞沉淀以裂解红细胞，再次以 1,000 rpm 离心 5 分钟。重悬细胞沉淀，并用预冷的 FACS 缓冲液洗涤剩余的脾细胞或淋巴细胞。随后按照步骤 3.4.4 - 3.4.5 进行流式细胞分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>胞内染色。
	<ol>
		<li>免疫攻击后第 50 天，通过 CO2 吸入法安乐死小鼠并进行颈椎脱位，随后取出脾脏并分离引流淋巴结（操作同步骤 4.5.1）。</li>
		<li>使用细胞筛网和 1 ml 注射器通过机械法将脾脏和淋巴结组织制成单细胞悬液。室温下用 5 ml ACK 裂解缓冲液孵育脾细胞 5 分钟以裂解红细胞。收集并用预冷的 FACS 缓冲液洗涤剩余的脾细胞或淋巴细胞。按照步骤 3.2.3 - 3.2.4 操作，但表面标记物染色使用 CD4、CD8、CD25 和 TCRVβ5 抗体。</li>
		<li>继续进行胞内染色固定操作（参见步骤 3.3.5 - 3.3.7），检测 iPSC 来源的 Treg 细胞内细胞因子（TGF-β 和 IL-10）的产生情况，并圈选活的 CD4+ CD25+ 细胞进行分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>抗原特异性 Treg 细胞向膝关节浸润及其对关节炎的抑制作用。
	<ol>
		<li>在关节炎诱导后第 7 - 14 天，按照步骤 (4.3 - 4.3.6) 对小鼠实施 CO2 吸入安乐死并进行颈椎脱位（依据 IACUC 指南）。使用电动剃毛器去除膝关节区域毛发，通过外科手术切除膝关节组织。</li>
		<li>使用钝头剪刀在后肢做切口，沿大腿横切至踝部，剥离皮肤以暴露肌肉组织。小心去除腿部肌肉，避免损伤膝关节。
		<ol>
			<li>在骨盆/髋关节上方切断后肢，并使用锋利的解剖剪刀切断胫骨。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将膝关节组织置于 4% 甲醛中固定 48 小时。使用 2.5 M 甲酸进行脱钙；随后依次用二甲苯冲洗三次（每次 3 分钟），100% 乙醇冲洗两次，95% 乙醇冲洗两次，去离子水冲洗两次（每次 2 分钟），再用 1 mM EDTA 进行脱钙处理，并在亚沸温度（90 °C）下处理 20 分钟。</li>
		<li>将固定组织冷却 30 分钟，用 1x PBS 冲洗 4 分钟后包埋于石蜡中。通过一系列梯度乙醇脱水以置换组织中的水分，随后用石蜡浸润组织，最后将浸润后的组织包埋成石蜡块。进行纵向和横向切片以便染色，使用滑动式切片机制备 4 µm 厚的切片。</li>
		<li>按照标准程序使用二甲苯和乙醇进行脱蜡和复水后，对切片进行免疫荧光染色12。</li>
		<li>抗原修复后，将切片浸入足量的 3% 过氧化氢溶液中 3 分钟，以封闭内源性过氧化物酶活性。随后在湿润盒中，室温下用含 3% BSA 的 PBS 封闭 60 分钟，以阻断非特异性结合。</li>
		<li>使用封闭液将荧光标记的 TCRVβ5 抗体按 1:100 稀释，每张切片加入 200 µl，于 75 - 100% 湿度的湿润盒中室温孵育 2 小时，之后用 1x PBS 洗涤 5 次，每次 5 分钟。</li>
		<li>使用含 DAPI 的抗荧光淬灭试剂对切片进行核复染。在盖玻片上滴加约 300 μl 稀释后的 DAPI 染色液（300 nM 溶于 1x PBS），确保完全覆盖整个盖玻片。染色完成后，将切片置于 4 °C 避光保存，待荧光显微镜下观察分析（图 3）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>关节炎抑制实验
	<ol>
		<li>在诱导关节炎前，使用数显卡尺测量小鼠双侧膝关节的肿胀程度，作为基线值。</li>
		<li>按照步骤 (4.3 - 4.3.6) 诱导关节炎并进行 Treg 细胞转移，之后使用数显卡尺测量小鼠膝关节直径。</li>
		<li>计算膝关节直径增加的百分比：膝关节直径增加百分比 = （第 1 天膝关节直径 - 第 0 天膝关节直径）/ 第 0 天膝关节直径。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过组织学方法评估膝关节破坏程度及炎性细胞浸润情况（图 4）。
	<ol>
		<li>关节炎诱导后第 7 天，按照前述方法处死小鼠，并通过外科手术切除膝关节组织。参见步骤 4.7.1 - 4.7.2。</li>
		<li>将膝关节组织置于 4% 甲醛中固定，EDTA 脱钙后包埋于石蜡中。参见步骤 4.7.3。</li>
		<li>取出双侧膝关节，10% 甲醛固定，Formical-4 脱钙，石蜡包埋，切片厚度为 4 µm，进行苏木精-伊红（H &amp;#38; E）染色或番红 O 染色（操作同步骤 4.7.7），并在显微镜下观察。</li>
		<li>采用半定量评分系统通过 H &amp;#38; E 染色评估骨侵蚀程度（0 分：无侵蚀；4 分：广泛侵蚀及骨质破坏）。采用番红 O 染色评估蛋白聚糖丢失情况，并使用半定量评分系统评分（0 分：无蛋白聚糖丢失；3 分：蛋白聚糖染色完全消失）。
		<ol>
			<li>采用半定量评分系统对 H &amp;#38; E 染色切片中的炎性细胞浸润进行评分（0 分：无细胞浸润；4 分：大量细胞浸润）。双侧膝关节切片应采用盲法独立评分。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 使用高分辨率微型计算机断层扫描（micro-CT）系统测量膝关节骨量丢失
<ol>
	<li>关节炎诱导后第10天，使用2%异氟烷麻醉小鼠，并准备进行成像。</li>
	<li>将小鼠置于腔室内，使其膝关节朝上。</li>
	<li>使用高分辨率显微CT系统进行采集 体内 小鼠膝关节周围骨结构的成像。</li>
	<li>使用以下参数对包含小鼠膝关节的样本进行微计算机断层扫描（micro-CT），扫描长度为2.2 mm：体素尺寸10.5 µm，电压55 kV，电流145 µA，积分时间200 msec，采集图像211张。</li>
	<li>导入显微CT图像，并在进一步图像处理（体渲染和转换）后获取冠状面图像图5).</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在此方案中，一个关键步骤是 体外 TCR/FoxP3基因转导的iPSCs的分化 体外 Notch 信号通路诱导细胞向 T 细胞谱系发育。将诱导多能干细胞分化为 CD4+FoxP3+ Tregs，我们使用了 OP9-DL1/DL4/I-Ab 高表达MHC II（I-A）的细胞b）分子。大多数iPSCs会分化为CD4+ 细胞。然而，在表面TCR表达后，许多已分化的前体T细胞会失去进一步分化的能力，并最终死亡。因此，诱导性多能干细胞来源的功能性调节性T细胞在四周后细胞数量显著减少 体外 分化。为避免此情况，可在这些时间点添加IL-2以提高细胞存活率。另一种促进抗原特异性前体调节性T细胞（pre-Tregs）成熟与存活的方法是，将已分化的pre-Tregs进行过继转移 体外 持续一周向小鼠体内给予。这些前体调节性T细胞可继续分化并成熟 体内 再持续三周。利用该方法，可从诱导性多能干细胞（iPSCs）生成具有功能性的抗原特异性调节性T细胞（Treg）...

自身免疫性关节炎是一种系统性疾病，其特征是滑膜组织增生以及关节软骨、骨和韧带的进行性破坏1。在自身免疫性关节炎中，调节性T细胞（Tregs）的生成或功能缺陷导致慢性炎症和组织损伤，因为Tregs在防止自身反应性免疫细胞的产生中起着关键作用。
调控调节性T细胞（Tregs）是开发能够在抗原依赖性条件下抑制炎症的治疗策略的理想途径。对于基于Tregs的免疫治疗而言，所转移Tregs的特异性在控制正在进行的自身免疫反应中至关重要2。为了发挥抑制功能，Tregs需要迁移并滞留在病变部位，而这一过程可通过其T细胞受体（TCR）对该部位抗原的特异性来引导3。尽管多克隆Tregs中可能含有少量具有该抗原特异性的细胞亚群，但这类抗原特异性Tregs的数量通常较低。因此，使用多克隆Tregs治疗自身免疫性疾病时，往往需要进行大量Tregs的过继性转移4,5。由于多能干细胞（PSCs）具有分化为任何细胞类型的潜能，抗原特异性的PSC来源Tregs（PSC-Tregs）可能成为基于Tregs的免疫治疗的理想候选细胞。先前的研究已成功实现了由PSCs分化为T细胞，包括Tregs6-8。
本文介绍了一种制备抗原特异性诱导多能干细胞来源的调节性T细胞（Ag-specific iPSC-Tregs）的实验方案。我们进一步描述了在小鼠模型中利用此类Treg细胞治疗自身免疫性关节炎的细胞疗法。该方法基于将具有抗原特异性的T细胞受体（TCR）和转录因子FoxP3的基因导入小鼠诱导多能干细胞（iPSCs）中进行遗传修饰。经基因工程改造的iPSCs在表达Notch配体DL1、DL4和MHC-II（I-Ab）分子的OP9基质细胞上，并在细胞因子mFlt3L和mIL-7存在条件下，可分化为抗原特异性的Tregs。当受到相应抗原刺激时，这些抗原特异性的iPSC-Tregs能够分泌抑制性细胞因子，如TGF-β和IL-10；将此类Tregs进行过继性转移后，可在小鼠模型中有效抑制抗原诱导性关节炎（AIA）的发展。本方案可用于制备干细胞来源的抗原特异性Tregs，为潜在的治疗干预提供可能。

<table><tbody><tr><td>C57BL/6j 小鼠</td><td>杰克逊实验室</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>B6.129S7 Rag1tm1Mom/J</td><td>杰克逊实验室</td><td>2216</td><td></td></tr><tr><td>抗CD3（2C11）抗体</td><td>BD Pharmingen</td><td>553058</td><td></td></tr><tr><td>抗CD28（37.51）抗体</td><td>BD Pharmingen</td><td>553295</td><td></td></tr><tr><td>抗CD4（GK1.5）抗体</td><td>Biolegend</td><td>100417</td><td></td></tr><tr><td>抗-CD8（53&amp;ndash;6.7）抗体</td><td>Biolegend</td><td>100714</td><td></td></tr><tr><td>抗CD25（3C7）抗体</td><td>Biolegend</td><td>101912</td><td></td></tr><tr><td>抗TCR-&amp;beta; (H57597) 抗体</td><td>Biolegend</td><td>109220</td><td></td></tr><tr><td>抗IL10</td><td>Biolegend</td><td>505010</td><td></td></tr><tr><td>抗TGF&amp;beta;</td><td>Biolegend</td><td>141402</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>ABCD1234</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>A10490-01</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH3007.01</td><td></td></tr><tr><td>布雷菲德菌素A</td><td>Sigma</td><td>B7651</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma</td><td>107689</td><td></td></tr><tr><td>Genejammer</td><td>综合科学</td><td>204130</td><td></td></tr><tr><td>ACK裂解缓冲液</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td></td></tr><tr><td>mFlt-3L</td><td>peprotech</td><td>250-31L</td><td></td></tr><tr><td>mIL-7</td><td>peprotech</td><td>217-17</td><td></td></tr><tr><td>明胶</td><td>Sigma</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma</td><td>P6148-500G</td><td>警告：致敏性、致癌性、毒性</td></tr><tr><td>透化缓冲液</td><td>Biolegend</td><td>421002</td><td></td></tr><tr><td>mBSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>卵清蛋白</td><td>Avantor</td><td>0440-01</td><td></td></tr><tr><td>CFA</td><td>Difco</td><td>2017014</td><td></td></tr><tr><td>尾静脉固定器</td><td>布雷因特里科学公司</td><td>RTV 150-STD</td><td></td></tr></tbody></table>

开发源自干细胞的抗自身免疫抗原特异性调节性t细胞

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

自身免疫性疾病源于免疫耐受的丧失。调节性T细胞（Tregs）在免疫耐受中发挥重要的介导作用。Tregs约占成熟CD4+ 小鼠和人类体内的T细胞亚群中，约有1-2%的调节性T细胞（Tregs）在外周血中循环。诱导性多能干细胞（iPSCs）可分化为具有功能的调节性T细胞，有望用于自身免疫性疾病的细胞治疗。本文介绍一种从iPSCs制备抗原（Ag）特异性Tregs的方法即，iPSC-Tregs）。该方法基于将转录因子FoxP3和一种抗原特异性T细胞受体（TCR）导入iPSCs，随后在表达Notch配体delta-like（DL）1和DL4的OP9基质细胞上进行分化。继而 体外 分化后，iPSC-Tregs 表达 CD4、CD8、CD3、CD25、FoxP3 以及抗原特异性 TCR，并能够响应抗原刺激。该方法已成功应用于小鼠模型中自身免疫性关节炎的细胞治疗。将这些抗原特异性的 iPSC-Tregs 过继转移至抗原诱导性关节炎（AIA）小鼠体内，可减轻关节炎症与肿胀，并防止骨质流失。

如图所示，在第28天，抗原特异性调节性T细胞（Tregs）显著表达CD3和抗原特异性TCR，这两种T细胞标志物。CD3+TCRVβ5+ 群体表达CD4。大多数CD3+TCRVβ5+CD4+ 细胞还表达 CD25、CD127 和 CTLA-4，这些分子在天然存在的 T 细胞中通常呈高水平表达调节性T细胞 (nTregs) 以及异位表达 FoxP3 的 T 细胞中。在 iPSC 来源的细胞中，FoxP3 的表达即使在长期培养后仍持续存在 体外 通过流式细胞术分析的细胞内染色检测到的Notch配体刺激 （图1）此外，抗原特异性的iPSC-Treg在受到刺激时能够产生抑制性细胞因子，如TGF-β和IL-10。 体外 用抗原致敏的脾细胞 （图2），表明iPSC-Tregs具有潜在的抑制活性。荧光显微镜显示，FoxP3阳性细胞数量增多+</s...

本文介绍一种利用诱导性多能干细胞（iPSCs）在小鼠模型中生成具有功能性的抗原（Ag）特异性调节性T细胞（Tregs）的方法，用于自身免疫性关节炎的免疫治疗。

开发源自干细胞的抗自身免疫抗原特异性调节性T细胞

自身免疫性疾病源于免疫自体耐受的丧失。调节性T细胞（Tregs）是免疫调节的重要介导者。

本实验的总体目标是开发一种新方法，用于生成源自干细胞的、与炎症关节相关的调节性T细胞，以用于治疗自身免疫性关节炎的免疫疗法。该方法有助于解答自身免疫领域中的一个关键问题，即自身免疫性关节炎潜在的免疫治疗手段。该技术的主要优势在于，所获得的干细胞来源的调节性T细胞具有表型均一且为单一细胞类型的特点。首先将感兴趣的饲养细胞用OP9培养基稀释至最低密度为每平方厘米1×10⁴个细胞，并在每个10厘米培养皿中接种1×10⁶个饲养细胞。当细胞融合度达到80%至90%时，吸除培养皿中的培养基，并在每个培养皿中加入0.5×10⁵至1×10⁵个经逆转录病毒转导的可诱导多能干细胞（iPSCs），使用OP9培养基进行接种。5天后，吸除培养基，并用10 mL PBS洗涤细胞。然后，每皿加入 4 毫升胰蛋白酶，在 37 摄氏度下消化细胞。10 分钟后，加入 8 毫升 IPSC 培养基终止反应，并将细胞收集进行离心。将细胞沉淀重悬于 10 毫升新鲜 IPSC 培养基中，接种至新的 10 厘米培养皿中。将饲养细胞置于细胞培养孵育箱中，使其贴附于培养板上30分钟。随后，收集悬浮的诱导多能干细胞（IPSCs），并通过70微米细胞筛网过滤转导后的细胞，以进行计数。将5 × 10⁵个IPSCs接种至含OP9培养基的新鲜饲养细胞培养板上，饲养细胞密度为80%至90%融合度，培养基中需添加小鼠Flt3配体（Murine-Flt3-Ligand），然后将培养物放回孵育箱中继续培养。三天后，用10毫升移液管以培养基冲洗培养皿。然后向培养皿中加入5毫升新鲜OP9培养基，通过小心而有力的移液操作轻轻冲洗掉任何半贴壁的iPSCs，注意不要破坏饲养细胞层。再用10毫升PBS重复冲洗一次，以收集残留的半贴壁细胞，将每块培养皿的冲洗液收集至一个锥形管中，每份培养对应一个锥形管。离心细胞后，将沉淀重悬于10毫升添加了小鼠Flt3配体（Murine-Flt3-Ligand）和IL-7的OP9培养基中，并通过70微米细胞筛过滤。将一个iPSC培养物接种至六孔板的每一孔中，每孔含有80%至90%融合度的饲养细胞单层，然后将共培养体系放回培养箱。每隔两天，用新鲜的添加小鼠Flt3配体和IL-7的OP9培养基更换一半培养液；每隔四到六天，根据需要将正在分化的iPSC重新接种至含有新鲜饲养细胞层的新培养板中。首先用胰蛋白酶消化目标细胞培养物，并将每种细胞类型重悬于 10 毫升新鲜培养基中。将每种细胞培养物接种至新的 10 厘米培养皿中，置于细胞培养箱内使饲养细胞贴壁。30 分钟后，收集未贴壁的悬浮诱导多能干细胞（IPSCs），并将细胞悬液分别通过 70 微米细胞筛网，以去除细胞团块，随后进行细胞计数。用预冷的PBS将每种培养物重悬，浓度为每毫升1.5 × 10⁷个细胞，必要时再次过滤。然后，将4至6周龄的雌性C57BL/6小鼠逐只放入小动物固定器中，每只小鼠尾静脉接种200 µL一种类型的细胞。使用千分表卡尺测量两只膝盖的肿胀程度，以建立基线值。细胞转移后第10天，使用1毫升注射器将100微克甲基化BSA溶于完全弗氏佐剂中，在每只实验动物尾根部进行皮下注射。细胞转移后第17天，通过关节内注射的方式诱导关节炎：向每只经麻醉的过继转移动物的左膝关节注射含20微克甲基化BSA的10微升PBS溶液，向右膝关节注射含20微克甲基化BSA和100微克全卵白蛋白的10微升PBS溶液。诱导关节炎7天后，再次测量膝关节直径以计算膝关节直径的百分比增加，并手术切除髌骨。用甲醛固定关节。然后，经EDTA脱钙后，将膝关节包埋于石蜡中，并制备4微米切片用于组织化学染色与分析。第28天时，抗原特异性调节性T细胞表达高水平的CD3和抗原特异性T细胞受体。这些细胞大多还表达CD25、CD127和CTLA-4，这些分子通常在天然存在的调节性T细胞中高水平表达。事实上，通过细胞内染色检测发现，诱导多能干细胞来源的调节性T细胞在体外经Notch配体长期刺激后，仍持续表达FoxP3。此外，这些抗原特异性的诱导多能干细胞来源的调节性T细胞在体外受到抗原脉冲处理的脾细胞刺激时，能够产生抑制性细胞因子，表明这些细胞具有潜在的抑制性表型。在经OVA处理的膝关节中可观察到FoxP3阳性细胞，而在接受对照载体转导的IPSCs的膝关节中则无明显FoxP3阳性细胞。此外，在接受TCR-FoxP3载体转导IPSCs的小鼠膝关节中，可见到更多CD4阳性、FoxP3阳性、TCR3 Beta 5阳性细胞，较仅接受FoxP3载体转导IPSCs的小鼠更多，提示抗原特异性的IPSC-Treg细胞在过继转移后会迁移至抗原诱导的关节炎膝关节。当存在OVA时，IPSC来源细胞的过继转移还可显著减轻炎症性膝关节肿胀，但对注射对照甲基化BSA的膝关节无此效应。通过高分辨率显微CT成像可进一步证实肿胀减轻的积极效果，与仅注射MBSA的对照组动物相比，细胞移植治疗的膝关节中观察到的骨量丢失明显减少。一旦准备就绪，若操作得当，这些深入的实验步骤可在六周内完成。在实施该技术时，重要的是要记住诱导经TCR-FoxP3抗原转导的iPSCs发生特异性分化。采用该方案后，还可考虑使用不同类型的抑制性细胞因子，以进一步探究抗原特异性诱导多能干细胞来源的调节性T细胞（iPSCs T reg cells）的存活能力及其功能特性。该技术建立后，为细胞治疗领域的研究人员探索抗原特异性调节性T细胞在自身免疫性疾病中的作用开辟了道路。需要注意的是，操作直接作用的自身抗体因子具有极高危险性，进行相关实验时必须采取预防措施，例如在二级生物安全实验室中操作。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

干细胞衍生的抗原特异性调节性T细胞对自身免疫的发展

调节性T细胞：治疗移植排斥和1型糖尿病的潜在前景

我们介绍一种从单一人血供体中分离获得调节性T细胞、记忆性T细胞和初始T细胞的方法。在遗传同质性的条件下，可将极化后的调节性T细胞与其他T细胞亚群在多种遗传学和功能学实验中进行比较，其中包括本文详细描述的抑制功能实验。...

从人初始T细胞和记忆T细胞诱导生成调节性T细胞

由诱导性多能干细胞（iPS细胞）生成T淋巴细胞，为T细胞免疫治疗提供了一种替代使用胚胎干细胞的新途径。该方法表明，通过利用以下任一方式 体外 或 体内...

诱导多能干细胞向T淋巴细胞的定向分化

本视频展示了一种用于小鼠自身免疫性关节炎的细胞治疗法。将表达卵清蛋白特异性受体的诱导多能干细胞（iPSC）来源的调节性T细胞，与乳化于佐剂中的甲基化牛血清白蛋白（mBSA）共同注射。小鼠抗原呈递细胞（APCs）对mBSA进行加工并将其呈递给T细胞，从而促进T细胞活化并迁移至膝关节滑膜。后续注射在左膝关节仅使用mBSA，而在右膝关节则联合使用mBSA和卵清蛋白。在左膝关节，针对mBSA的免疫反应引发关节炎；而在右膝关节，调节性T细胞与卵清蛋白相互作用，减轻炎症反应，从而改善关节炎症状。...

一种用于小鼠模型中自身免疫性关节炎的细胞疗法

利用表达柯萨奇腺病毒受体的转基因技术，通过腺病毒介导的基因转移将外源基因导入初始CD4 T细胞，可实现对调节性T细胞分化的分子机制分析 体外.

腺病毒转导初始CD4 T细胞以研究调节性T细胞分化

本文介绍了一种利用三维（3D）胸腺培养系统生成肿瘤抗原特异性诱导多能干细胞来源的胸腺移行细胞（iTE）的新方法。iTE...

一种用于产生小鼠诱导性多能干细胞来源的肿瘤抗原特异性胸腺移行细胞的三维胸腺培养系统

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用于自身免疫性糖尿病模型功能检测的高效生成抗原特异性原代小鼠细胞毒性T细胞

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利用人诱导性多能干细胞生成肿瘤抗原特异性T细胞

本文介绍了一种通过过继性细胞转移（ACT）将干细胞来源的病毒抗原（Ag）特异性T淋巴细胞移植到小鼠体内，从而有效抑制乙型肝炎病毒（HBV）复制的实验方案。该方法可进一步优化，用于HBV感染的潜在ACT免疫治疗研究。...

干细胞来源的病毒抗原特异性T淋巴细胞抑制小鼠中乙型肝炎病毒复制

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人源嵌合抗原受体调节性T细胞的制备

了解利用诱导多能干细胞生成抗原特异性调节性T细胞的方法，用于自身免疫性关节炎的免疫治疗。该技术可产生均一的功能性Treg细胞，为细胞治疗研究提供新途径。

开发源自干细胞的抗自身免疫抗原特异性调节性T细胞

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