利用高分辨率计算机断层扫描技术可视化植物维管系统的三维结构与功能

本实验的总体目标是利用基于同步辐射的X射线显微断层成像技术，研究植物中维管组织运输的结构与功能。首先，需将样品制备并安装到卡盘夹具或活体植物夹具中，确保待扫描部分尽可能垂直，并完成必要的初步生理学测量。第二步是将制备好的样品或活体植物放入ALS光束线8.3.2实验站舱内，并固定舱体以进行扫描。接下来。

在正确放置样品后，启动扫描。最后一步是利用工作站计算机对扫描数据进行归一化、重建，并评估其质量，然后将数据导入VISO进行三维可视化处理。最终，X射线显微断层扫描技术可用于揭示植物中水分传导维管系统连接结构的精细特征及其功能状态。

与现有的连续切片和光学显微镜等方法相比，该技术的主要优势在于能够以前所未有的分辨率在任意方向上对植物组织进行观察。该方法有助于我们理解植物生物学领域中的关键问题，从植物水分运输的基本机制，到抗旱性、抗冻性，以及病原体在寄主植物体内的系统性移动过程。本方案所述内容专为先进光源设施中的工作而设计。

8.3 0.2. 在其他同步辐射设施上工作时，可能需要对光束线进行调整。在开始活体植物样品制备之前，务必遵守这些设施所要求的安全和辐射培训规定。

首先将植物种植在直径约10厘米的花盆中，确保待扫描的主茎或其他植物部位尽可能居中，并在花盆中保持垂直方向。由于高分辨率计算机断层扫描（HRCT）仪器舱体的物理尺寸限制，活体植物的高度需控制在约一米以内。因此，对活体植物的成像最适合在幼苗或小树苗阶段进行。

将植物种植在小花盆中，使用定制的刚性铝制花盆支架来固定活体盆栽植物。顶板高度应可调节，以适应不同高度的花盆。此处，顶板设计为与土壤表面顶端齐平，植物从两片式顶板的中心位置伸出。

将植物固定在样品架上后，使用SHO Lander型压力室或夹式叶片参数仪测量茎水势，以确定扫描前植物的生理状态。取一小段铜线缠绕在茎上作为标记物，以确保对需要重复扫描的植物保持一致的扫描位置。然后，将一个薄壁丙烯酸圆筒套在植物上方的铝制植物架上，并用螺丝固定，以稳定样品。

应使用额外的塑料保鲜膜、纸巾和胶带进一步减少植物部分的振动和移动，以避免造成图像失真。将定制的样品 holder 固定在气浮载物台上，并锁定在 X 射线源与成像传感器及相机设备之间的位置。务必尽可能使茎秆保持垂直，并将样品居中放置于磁性卡盘基座上，以确保其在旋转过程中始终处于视野范围内。新鲜植物材料（通常为茎或叶柄）可在从活体植物上立即取下后进行扫描。

如果实验目的是可视化整个木质部网络，则必须首先将导管内的水分排出并替换为空气。为此，将样品置于细长型压力室中，并以低压通入压缩空气或氮气，持续约五分钟。不同物种所需排出导管网络内水分的时间会有所不同。

如果目的是评估新鲜植物组织中栓塞形成的程度，需使用锋利的剃刀片在水下对植物进行取样切割。接着，用一层帕拉福尔膜包裹样品，以防止扫描过程中样品失水；然后将样品固定在安装于金属板上的钻夹头中，该金属板通过螺钉固定在空气轴承载台中心，并按照前述方法将样品垂直定向，以确保样品始终位于视野范围内。对于干燥的木质组织样品，首先将其切割至长约六厘米。

选择在目标扫描区域内尽可能笔直且直径约为一厘米的样品。下一步是缓慢地对整个样品进行脱水，以确保最佳的组织样品可视化效果和图像对比度。将木质组织样品放入低温干燥箱中，缓慢干燥样品，避免组织出现开裂或分裂。

在某些情况下，可能需要在样本上附着一个定位标记。这可以确保后续利用扫描电子显微镜进行解剖和观察时，能够与高分辨率计算机断层扫描（HRCT）图像中的特定位置相对应。为此，可使用石蜡将金属或玻璃珠、丝线固定在茎的外部。

最后，在扫描前按照上述方法将样品安装到钻孔检测装置中并进行居中调整。确定最适合您应用的放大倍数。此处使用的ALS同步辐射8.3.2光束线具备使用2×、5×和10×放大倍数物镜进行扫描的能力。

将X射线能量设置为15千电子伏特。曝光时间通常取决于样品的厚度和密度，范围为100至1000毫秒。选择适合您应用的角步进增量。

扫描过程中样品旋转180度，旋转期间采集的图像数量会显著影响数据集的大小、扫描时间间隔的长短以及最终的图像质量。通常以0.25度为增量进行扫描，每次扫描可获得513幅图像。通过使用连续断层扫描模式，可在样品持续旋转的同时连续采集每幅图像，从而实现更短的扫描间隔。此外，还需采集明场和暗场图像。

明场图像是指在光束中无样品时采集的图像。这些图像通常通过水平平移样品，在扫描样品之前和之后进行采集。暗场图像则通过关闭X射线快门来采集。

这用于测量在没有X射线时相机显示的信号量。扫描完成后，将采集计算机中的原始2D TIFF图像传输至文件服务器，然后导出到用于数据处理的计算机上。接下来，必须将图像转换为百分比透射率尺度。

光束线8.3.0.2配备了一个定制的背景归一化插件，可下载并用于免费提供的软件包。使用ImageJ或Fiji将归一化图像载入octopus软件包，然后通过指定的处理步骤，从2D原始TIFF图像文件重建3D数据集。接下来，图像堆栈可在多种软件包之一中进行可视化。

此处使用 aviso 软件包将数据集加载到系统内存中，并以虚拟的横断面、纵向或径向切片方向显示样品。由于数据集具有三维属性，因此可通过任意平面旋转虚拟切片，以对准感兴趣区域。完成分割后，即可对目标植物结构或其功能变化进行定量分析，包括体积、长度、宽度，以及水分、空气等的存在或缺失情况。利用 8.3.2 光束线，同步辐射高分辨率计算机断层扫描（HRCT）已成功应用于多种植物组织和物种，以前所未有的三维分辨率揭示了植物木质部结构与功能的新见解。

如图所示，三维重建所提供的可视化与探索功能，能够精确定位和确定离体样本及活体植物中木质部网络内结构的位置与取向。此处展示的是经受干旱胁迫的红杉茎部的三维重建图像，其中同时显示出充满空气和水的导管。一旦掌握该技术，若操作得当，可在数分钟内完成。此外，还可采用扫描电子显微镜等其他方法验证植物内部观察到的结构，并确定尺寸阈值，随后将这些阈值输入数据处理程序用于后续分析。