Name: 使用高解析度电脑断层可视化的三维结构和功能的植物血管 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: 了解高分辨率X射线计算机断层扫描技术用于植物维管系统三维结构功能研究的方法。该技术可无损成像木质部网络，揭示水分运输细节，为植物生理学和抗逆性研究提供重要工具。

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作者谨此感谢 S Castorani、AJ Eustis、GA Gambetta、CM Manuck、Z Nasafi 和 A Zedan。本研究由以下机构资助：美国农业部-农业研究局当前研究信息系统资助（研究项目编号 5306-21220-004-00；先进光源项目由美国能源部科学办公室、基础能源科学办公室根据合同号 DE-AC02-05CH11231 支持）；以及美国国家食品与农业研究所（NIFA）特色作物研究计划向 AJM 提供的资助。

以下所述的实验方案细节专为先进光源8.3.2光束线的工作而编写。在其他同步辐射设施上工作时，可能需要进行相应调整。使用这些设施前必须接受适当的安全培训和辐射防护培训。
1. 活体植物样品制备
<ol>
 <li>将植物种植在直径约10 cm的花盆中，并确保主茎（或待扫描的植物部分）尽可能居中并垂直于花盆中。先进光源（Advanced Light Source）处高分辨率计算机断层扫描（HRCT）仪器舱的物理尺寸限制了活体植物的高度约为1 m。因此，活体植物的成像最适合在小花盆中生长的幼苗/小树苗上进行。根据实验需求，可使用不同类型的土壤以控制土壤含水量（例如在干旱实验中）；对于一些茎秆较柔韧的植物（例如藤本植物），较长的茎可小心地卷入下文所述的丙烯酸管中（见图1和图2）。</li>
 <li>将带盆的活体植物固定在定制的刚性铝制花盆支架上。顶板高度可调节，以适应不同高度的花盆。顶板设计为与土壤表面齐平，植物从双片式顶板的中心伸出。花盆支架的作用是牢固固定植物茎秆，以最大限度减少振动或样品移动。在扫描过程中最大限度减少样品移动至关重要。</li>
 <li>将植物安装在支架上后，分别使用Scholander型压力室或夹式叶片气孔计测量茎水势或叶片蒸腾速率，以确定扫描前植物的生理状态。</li>
 <li>将一个薄壁丙烯酸圆筒罩在植物上方，并放置于铝制植物支架顶部，用黏土腻子将其固定，以稳定样品（图2）。上部枝叶的任何振动或移动都会沿茎秆传导，导致扫描区域内的植物组织发生位移，最终引起图像失真。该圆筒用于容纳植物枝叶，防止叶片在扫描过程中与其他设备部件摩擦而产生振动。应额外使用塑料薄膜、纸巾和胶带进一步减少植物各部分的振动和移动（参见图4中与样品移动相关的问题）。为降低X射线吸收（这会降低给定曝光时间下的图像质量），该容纳圆筒应尽可能采用薄壁设计，同时保持足够的刚性以实现其功能。</li>
 <li>将定制花盆支架连接至气浮载物台，并将其（通过螺钉）锁紧固定在X射线源与成像传感器及摄像设备之间。尽可能使茎秆保持垂直，并在磁性卡盘底座上居中定位，以确保样品在旋转过程中始终处于视场范围内。</li>
</ol>
2. 新鲜离体植物组织的样品制备
<ol>
 <li>通常取茎或叶柄等新鲜植物材料，在从活体植物上立即取下后即可进行扫描。若实验目的是观察整个木质部网络，则必须将导管内的水分排出并替换为空气。为此，将样品安装在肖兰德式压力室中，以低压（&lt; 0.05 MPa）通入压缩空气或氮气，持续约 5 分钟。不同物种完成导管网络排气所需时间有所不同。若目的是评估新鲜植物组织中栓塞形成的程度，则应使用锋利的剃刀片在水下切割的方式从植株上切取样品。</li>
 <li>用一层 Parafilm 膜包裹样品，以防止扫描过程中样品失水干燥。</li>
 <li>将样品固定于安装在金属板上的钻夹头中，该金属板已旋紧至气浮载物台上。如前所述，将样品居中并垂直定向，以确保其始终处于视野范围内。</li>
</ol>
3. 干燥木材组织的样品制备
<ol>
 <li>为了获得最佳的组织样本可视化效果和图像对比度，必须缓慢地对整个木本组织样本进行脱水处理。将样本切成约6 cm长，选择在目标扫描区域尽可能笔直且直径≤1 cm的样本。</li>
 <li>将木本组织样本放入低温干燥箱中，缓慢干燥样本，避免组织出现开裂或劈裂。此过程可能因物种和组织类型而异。对于木本茎，通常在40 °C烘箱中干燥12小时即可获得良好的对比度，同时不会引起茎物理结构的显著变化（参见图3中快速干燥导致的问题）。</li>
 <li>在某些情况下，希望在样本中设置一个基准标记，以便后续通过扫描电子显微镜进行解剖和观察时，能够与HRCT图像中的特定位置相对应。为此，可使用Parafilm将金属或玻璃珠或金属丝固定在茎的外部。另一种方法是注射硅胶树脂（例如 RTV-141，Bluestar Silicones，East Brunswick，NJ）至单个木质部导管中（参见Brodersen 等 2010年的示例）。硅胶树脂固化后在样本中清晰可见，并可与其它充满空气的导管 easily 区分开来。利用此标记可精确定位样本中的特定区域。</li>
 <li>按照上述方法将样本安装在钻夹头上并进行中心对齐。</li>
</ol>
4. 用于二维（2D）放射成像的叶片组织样品制备
<ol>
 <li>为了近实时地观察叶片中的维管组织内容，可对叶片进行扫描以生成二维放射图像，类似于牙科X光片。将叶片夹在两片薄丙烯酸塑料板之间，并用夹子固定边缘。然后将装好的样品连接到支架系统上，并将光学面包板放置在成像系统和X射线源旁边。</li>
</ol>
5. 在8.3.2实验站中扫描样品
<ol>
 <li>根据您的应用需求确定最合适的放大倍数。ALS 8.3.2 光束线可使用 2x、5x 和 10x 放大倍数的镜头进行扫描，对应的图像像素尺寸分别为 4.5、2.25 和 0.9 μm。由于视场随放大倍数的增加而减小，因此需根据所选放大倍数选择合适尺寸的样品。有关相机与镜头选择及其对应图像参数的详细信息，请参见表 1。</li>
</ol>
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td> </td>
 <td colspan="2">PCO.4000 (4008x2672)</td>
 <td colspan="2">PCO.Edge (2560x2160) (Optique Peter)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>物镜</td>
 <td>像素 (μm)</td>
 <td>视场 (mm)</td>
 <td>像素 (μm)</td>
 <td>视场 (mm)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10x</td>
 <td>0.9</td>
 <td>3.6</td>
 <td>0.65 (0.69)</td>
 <td>1.7 (1.7)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5x (4x)</td>
 <td>1.8</td>
 <td>7.2</td>
 <td>1.3 (1.72)</td>
 <td>3.3 (4.4)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2x</td>
 <td>4.5</td>
 <td>18</td>
 <td>3.25 (3.44)</td>
 <td>8.3 (8.8)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1x</td>
 <td>9</td>
 <td>36</td>
 <td>6.5 (-)</td>
 <td>16.6 (-)</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
表1. ALS 8.3.2 可用相机和镜头的详细信息。
<ol start="2">
 <li>将X射线能量设置为15 keV。研究表明，该能量对大多数植物应用可提供优异的图像对比度（参见Brodersen et al. 2010, 2011, 2012a,b）。曝光时间通常取决于样品的厚度和密度（以及所用放大倍数），范围在100至1,000毫秒之间。较长的曝光时间（只要探测器像素未饱和）通常会提高信噪比，但会增加扫描时间。</li>
 <li>选择适合您应用的角步长。扫描过程中样品旋转180°，旋转期间采集的图像数量会对数据集大小、扫描时间长度以及最终图像质量产生显著影响，但图像质量的提升通常呈现边际递减趋势。典型的扫描以0.25°为步长，每次扫描生成721幅图像。将步长减小至0.125°可获得更优图像，有助于观察细微结构，但会产生1,440幅图像，从而导致数据集显著增大（对于典型感兴趣区域，数据量约为10–30 GB，而非常规的5 GB）。然而，信噪比通常有所改善，因此增加的扫描时间和数据量往往是值得的。对于在扫描过程中不太可能发生变形或收缩的干燥茎秆，可采用更长的扫描间隔（更小的角步长）而不会造成不利影响。在对活体植物成像时，由于生物学过程（例如栓塞修复）在较短时间内发生，建议选择较短的扫描间隔，以尽量减少X射线辐射对组织的潜在损伤——尽管这可能伴随图像质量的下降。可通过“连续断层扫描”模式实现更短的扫描间隔，该模式下样品在图像采集过程中持续旋转。</li>
 <li>每次扫描均需校正“明场”和“暗场”图像。明场图像是指样品未置于光束中时采集的图像，通常通过将样品水平移出光路，在扫描前和扫描后分别采集。暗场图像则通过关闭X射线快门获得，用于测量无X射线照射时相机本身的信号水平。</li>
</ol>
6. 数据处理
<ol>
 <li>将从采集计算机导出的“原始”二维 .TIF 图像传输至文件服务器，再将其复制到数据处理计算机上。如果计算机具有足够的内存（RAM），可将数据复制到所谓的“内存盘”（RAM Drive）中（即一部分内存被模拟为硬盘驱动器）。这样，软件无需访问机械硬盘进行读写，而机械硬盘的速度相比固态硬盘或闪存而言较慢。此步骤可显著缩短数据集的处理时间。</li>
 <li>必须将图像转换为透射率百分比尺度。8.3.2 光束线配备了一个自定义的背景归一化插件，可下载并用于免费软件 ImageJ 或 Fiji（<a href="http://fiji.sc/" target="_blank">http://fiji.sc/</a>）。该插件从图像中减去暗电流信号，并通过亮场图像对样品图像进行归一化，从而生成以百分比透射率表示的图像。将归一化后的图像载入 Octopus 软件包（<a href="http://www.inct.be/en/software/octopus" target="_blank">http://www.inct.be/en/software/octopus</a>），并使用指定的处理步骤（图像归一化、环状伪影去除、Sinogram 生成、平行束重建）从二维原始 .TIF 文件重建三维数据集。该过程最终生成一系列由“体素”（voxels，即体积像素单元）组成的 .TIF 横断面（截面）图像，每个体素均具有 x、y、z 坐标以及代表 X 射线线性吸收系数的强度值。</li>
</ol>
7. 可视化
<ol>
 <li>在多种软件包中可视化图像堆栈。免费软件（例如 德里斯hti <a href="http://anusf.anu.edu.au/Vizlab/drishti/index.shtml" target="_blank">http://anusf.anu.edu.au/Vizlab/drishti/index.shtml</a>) 可用于可视化体积数据或单个图像及图像堆栈例如 ImageJ 或 FIJI）。其他软件包也可用于三维可视化。我们的研究团队使用 Avizo 软件包（<a href="http://www.vsg3d.com/avizo/overview" target="_blank">http://www.vsg3d.com/avizo/overview</a>），但其他软件如 Amira（<a href="http://www.amira.com/" target="_blank">http://www.amira.com/</a>）和 VGStudioMax（<a href="http://www.volumegraphics.com/" target="_blank">http://www.volumegraphics.com/</a>也常被使用。</li>
 <li>将数据集加载到系统内存中，并以虚拟的横断面、纵向或径向切片方向显示样本。由于数据集具有三维属性，可对样本进行任意平面的虚拟切片旋转，以对齐感兴趣区域，相较于传统的连续光学显微镜技术具有显著优势（详见视频1-3的详细示例）。</li>
 <li>为了根据需要以三维形式可视化样本，使用 Avizo 中提供的多种半自动和手动例程对样本进行“分割”，以分离血管管腔或其他结构与周围组织。分割是指界定感兴趣对象之间的边界，从而将其分离或划分为不同的区域。三维体积的渲染由可视化软件完成。其中一种方法是直接体绘制，该方法假设体积中的每个点均会发射和吸收光线；发射与吸收的强度及颜色可通过“颜色映射表”（colormap）进行定义，并将沿特定方向的最终投影显示于屏幕。另一种方法是构建代表分割边界的线框或三维网格表面，以展示感兴趣结构的三维模型。该三维网格由多边形元素构成，元素总数将同时影响结构重建的保真度以及相应数据文件的大小。即 更多元素可提高保真度，但也会增加文件大小。可视化软件内置多种图像处理模块，可用于控制体渲染输出，以及调节图像亮度、对比度、透明度和降噪等参数。 等等。</li>
</ol>
8. 定量分析
<ol>
 <li>一旦完成分割，即可对目标植物结构或其功能变化进行量化，包括体积、长度、宽度，以及水分或空气的存在与否。 等等。 例如，Brodersen 等 (2010) 使用 Avizo 软件量化葡萄藤导管再填充过程中水滴体积的变化。每30分钟对植株进行一次扫描，持续四至八小时，从而生成导管再填充的时间序列图像。每次扫描数据均被重建并导入 Avizo，在其中随时间测量单个水滴体积的增加情况。</li>
</ol>

<ol><li>Brodersen, C. R., McElrone, A. J., Choat, B., Matthews, M. A., Shackel, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+of+embolism+repair+in+xylem%3A+in+vivo+visualizations+using+high+resolution+computed+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">The dynamics of embolism repair in xylem: in vivo visualizations using high resolution computed tomography.</a> Plant Physiology. 154, 1088-1095 (2010).</li>
<li>Brodersen, C. R., Lee, E., Choat, B., Jansen, S., Phillips, R. J., Shackel, K. A., McElrone, A. J., Matthews, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+analysis+of+3D+xylem+networks+using+high+resolution+computed+tomography+%28HRCT%29%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Automated analysis of 3D xylem networks using high resolution computed tomography (HRCT).</a> New Phytologist. 191 (4), 1168-1179 (2011).</li>
<li>Brodersen, C., Roark, L., Pittermann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physiological+implications+of+primary+xylem+organization+in+two+ferns%5BTitle%5D)+AND+%22Plant%2C+Cell+%26+Environment%22%5BJournal%5D)">The physiological implications of primary xylem organization in two ferns.</a> Plant, Cell & Environment. , (2012).</li>
<li>Brodersen, C., Choat, B., Chatelet, D., Shackel, K. A., Matthews, M. A., McElrone, A. J. Conductive xylem bridges contribute differentially to radial connectivity in grapevine stems (Vitis vinifera and V. arizonica). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrodersen%2C+C+%22American+Journal+of+Botany%22">American Journal of Botany</a>. , In Press (2012).</li>
<li>McElrone, A. J., Jackson, S., Habdas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydraulic+disruption+and+passive+migration+by+a+bacterial+pathogen+in+oak+tree+xylem%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Hydraulic disruption and passive migration by a bacterial pathogen in oak tree xylem.</a> Journal of Experimental Botany. 59, 2649-2657 (2008).</li>
<li>McElrone, A. J., Grant, J., Kluepfel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+ethylene-induced+tyloses+in+canopy+hydraulic+failure+of+mature+walnut+trees+afflicted+with+apoplexy+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Tree+Physiology%22%5BJournal%5D)">The role of ethylene-induced tyloses in canopy hydraulic failure of mature walnut trees afflicted with apoplexy disorder.</a> Tree Physiology. 30, 761-772 (2010).</li>
<li>Tyree, M., Sperry, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vulnerability+of+xylem+to+cavitation+and+embolism%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Vulnerability of xylem to cavitation and embolism.</a> Annual Review of Plant Biology. 40 (1), 19-36 (1989).</li>
<li>Tyree, M., Zimmermann, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTyree%2C+M+%22Xylem+structure+and+the+ascent+of+sap%22">Xylem structure and the ascent of sap</a>. , Springer Verlag. Berlin. (2002).</li>
<li>Holbrook, N. M., Zwienieck, M. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHolbrook%2C+NM+%22Vascular+Transport+in+Plants%22">Vascular Transport in Plants</a>. , Elsevier. Amsterdam. (2005).</li>
<li>Mayo, S. C., Chen, F., Evans, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micron-scale+3D+imaging+of+wood+and+plant+microstructure+using+high-resolution+x-ray+phase-contrast+microtomography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Micron-scale 3D imaging of wood and plant microstructure using high-resolution x-ray phase-contrast microtomography.</a> Journal of Structural Biology. 171, 182-188 (2010).</li>
<li>Mannes, D., Marone, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+areas+of+synchrotron+radiation+tomographic+microscopy+for+wood+research%5BTitle%5D)+AND+%22Wood+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Application areas of synchrotron radiation tomographic microscopy for wood research.</a> Wood Science and Technology. 44, 67-84 (2010).</li>
<li>Maeda, E., Miyake, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-destructive+tracing+with+an+x-ray+micro+ct+scanner+of+vascular+bundles+in+the+ear+axes+at+the+base+of+the+lower+level+rachis-branches+in+japonica+type+rice+%28oryza+sativa%5BTitle%5D)+AND+%22Japanese+Journal+of+Crop+Science%22%5BJournal%5D)">A non-destructive tracing with an x-ray micro ct scanner of vascular bundles in the ear axes at the base of the lower level rachis-branches in japonica type rice (oryza sativa.</a> Japanese Journal of Crop Science. 78 (3), 382-386 (2009).</li>
<li>Steppe, K., Cnudde, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+x-ray+computed+microtomography+for+non-invasive+determination+of+wood+anatomical+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Use of x-ray computed microtomography for non-invasive determination of wood anatomical characteristics.</a> Journal of Structural Biology. 148 (1), 11-21 (2004).</li>
<li>Zimmermann, M. Dicotyledonous wood structure (made apparent by sequential sections). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZimmermann%2C+M+%22Encyclopaedia+Cinematographica%22">Encyclopaedia Cinematographica</a>. , Institut für den Wissenschaftlichen Film. Gottingen, Germany. (1971).</li>
<li>Lee, E. F., Brodersen, C. R., McElrone, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+HRCT-derived+xylem+network+reveals+reverse+flow+in+some+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Analysis of HRCT-derived xylem network reveals reverse flow in some vessels.</a> , In review (2013).</li>
<li>McDowell, N. G., Pockman, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+plant+survival+and+mortality+during+drought%3A+why+do+some+plants+survive+while+others+succumb%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of plant survival and mortality during drought: why do some plants survive while others succumb.</a> New Phytologist. 178, 719-739 (2008).</li>
<li>McElrone, A. J., Brodersen, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrifuge+technique+consistently+overestimates+vulnerability+to+water-stress+induced+cavitation+in+grapevines+as+confirmed+with+high+resolution+computed+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Centrifuge technique consistently overestimates vulnerability to water-stress induced cavitation in grapevines as confirmed with high resolution computed tomography.</a> New Phytologist. , (2012).</li>
<li>Lee, K., Avondo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+plant+development+and+gene+expression+in+three+dimensions+using+optical+projection+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Visualizing plant development and gene expression in three dimensions using optical projection tomography.</a> Plant Cell. 18, 2145-2156 (2006).</li>
<li>Truernit, E., Bauby, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+whole-mount+imaging+of+three-dimensional+tissue+organization+and+gene+expression+enables+the+study+of+phloem+development+and+structure+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution whole-mount imaging of three-dimensional tissue organization and gene expression enables the study of phloem development and structure in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 20, 1494-1503 (2008).</li>
<li>Jahnke, S., Menzel, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+MRI-PET+dissects+dynamic+changes+in+plant+structures+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Combined MRI-PET dissects dynamic changes in plant structures and functions.</a> The Plant Journal. 59, 634-644 (2009).</li>
<li>Iyer-Pascuzzi, A. S., Symonova, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+and+analysis+platform+for+automatic+phenotyping+and+trait+ranking+of+plant+root+systems%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Imaging and analysis platform for automatic phenotyping and trait ranking of plant root systems.</a> , (2010).</li>
</ol>

我们没有需要披露的内容。

同步辐射高分辨率计算机断层扫描（HRCT）为植物生物学家提供了一种强大且非破坏性的工具，可用于极其详细地探索植物维管系统内部的运作机制。该技术最近已被用于鉴定葡萄藤木质部中先前未被描述的解剖结构，这些结构在不同葡萄藤物种中差异性地改变了木质部网络的连通性（Brodersen et al. 2012b, in press）——这种连通性的变化会显著影响维管病原体和栓塞在木质部网络中的破坏性扩散能力。对活体植物的首次成功扫描还揭示了栓塞传播与修复等动态过程的精细尺度细节（Brodersen et al 2010；McElrone et al 2012，《新植物学家》196(3):661-665），并帮助确认了一类特定活细胞在栓塞修复中的作用——ALS 8.3.2线站HRCT所提供的空间分辨率使得这些发现成为可能。然而，关于这些过程及其他木质部网络特征的具体机制仍不明确——HRCT在未来的持续探索中可能发挥关键作用，特别是当其与其他高分辨率技术（例如激光捕获显微切割）结合使用时，也可与近年来开发的其他先进可视化技术联合应用于植物生物学研究（例如 Lee ...

水分通过一种称为木质部的维管组织从植物根部运输到叶片——木质部是由相互连接的导管、纤维以及具有代谢活性的活细胞组成的网络结构。为了向叶片提供光合作用、生长乃至植物最终存活所需的水分和养分，必须维持植物木质部的运输功能。当木质部网络受到病原生物侵袭而受损时，木质部导管中的水分运输可能被中断。作为应对这类感染的机制，植物常产生凝胶、黏液和侵填体，以限制病原体的扩散（例如 McElrone 等，2008；2010）。干旱胁迫也会限制木质部中的水分运输。在长期干旱过程中，植物不断失水，导致木质部汁液中的张力增加。处于张力下的水处于亚稳态（即 当张力达到某一阈值时，足以使木质部导管内的水柱发生空穴化）。空穴化发生后，可能形成气泡（栓塞），并充满导管，从而有效阻断水分的移动（Tyree 和 Sperry，1989），这一现象类似于深海潜水员所患的减压病（即 “减压症”）。
尽管大量历史和现代文献已证明木质部水分运输对植物正常功能的重要性（Tyree &amp; Zimmermann, 2002；Holbrook et al., 2005），但木质部网络的某些方面仍不明确。近年来，多个研究团队开始利用高分辨率X射线显微计算机断层扫描技术（HRCT）来评估木材解剖结构和维管组织的更精细细节（例如 Mayo 等人，2010，2008；Mannes et al. 2010；Brodersen et al. 2010, 2011, 2012a,b；Maeda 和 Miyake, 2009；Steppe et al. 2004）。HRCT是一种非破坏性技术，用于可视化固体内部特征，并获取其三维结构特性的数字信息。与传统的医学CAT扫描相比，HRCT能够分辨出小至微米级别的细节，即使对于高密度物体也是如此。近年来同步辐射HRCT技术的进步显著提高了图像分辨率和信噪比，使得植物导管网络及导管间连接得以被可视化，赋予三维坐标，并导出用于水力模型模拟。Brodersen et al.（2011）通过将同步辐射HRCT生成的三维重建图像与Fortran模型相结合，进一步推动了该技术的发展，该模型能以前所未有的高分辨率自动提取木质部网络中的数据，远超传统解剖学方法（即 使用切片机进行连续切片，并通过光学显微镜成像，例如 Zimmermann 1971）。这项工作还被用于优化木质部系统的水力模型，并识别出运输过程中的独特特征（即 在蒸腾作用高峰期某些导管中出现反向流动）（Lee et al.，正在审稿中）。
同步辐射高分辨率计算机断层扫描（HRCT）现可用于观察木质部功能、空穴化的易感性以及植物修复栓塞导管的能力。若栓塞导管中无法恢复水流，则会降低植物的水分运输能力，限制光合作用，在极端情况下导致植物死亡（McDowell et al. 2008）。植物可通过邻近功能导管之间由纹孔连接形成的旁路绕行水流，以及生成新的木质部以弥补损失的水分运输能力，从而应对栓塞。部分植物具备修复水柱断裂的能力，但长期以来，木质部在张力条件下实现这一修复过程的具体机制仍不明确。Brodersen et al.（2010）近期利用HRCT在活体葡萄藤中实现了对导管再灌注过程的可视化与定量分析。导管成功再灌注依赖于来自木质部导管周围活细胞的水分流入，单个水滴随时间逐渐扩张，充满导管，并促使被困气体溶解。目前，不同植物修复受损木质部导管的能力及其调控机制正在被深入研究。
ALS 设施 8.3.2 光束线的描述
迄今为止，我们的工作均在美国加利福尼亚州伯克利劳伦斯伯克利国家实验室先进光源（Advanced Light Source）的硬X射线微断层成像光束线8.3.2上进行。植物样品被放置在距离X射线源20米远的铅衬屏蔽舱内，X射线由先进光源电子储存环中一个工作在11.5 keV临界能量下的6特斯拉超导弯转磁铁二极子产生。图1展示了终端站的示意图。X射线以40 × ~4.6 mm的光束尺寸进入屏蔽舱，穿过安装在电动旋转台上的样品。透射的X射线照射到晶体闪烁体上（常用材料为LuAG或CdWO4），将X射线转换为可见光，并通过透镜系统传递至CCD相机进行图像采集。相机、闪烁体和光学元件均封装在一个密闭避光箱体内，该箱体安装在导轨上，可调节样品与闪烁体之间的距离，以优化相位衬度成像效果。
所有样品均安装在直径为10 cm的旋转台上，该旋转台又安装在水平和垂直平移台上，用于样品定位。图2展示了一个活体植物样品，其根系固定在定制的植物花盆支架中，地上部分则置于丙烯酸管内。通常使用10–18 keV能量时，单次曝光时间范围为0.1–1秒，扫描持续时间根据特定样品优化的设置不同，介于5–40分钟之间。对于较高的样品（如典型的植物木质部网络），可通过自动控制样品在不同高度位置重复扫描，实现数据拼接，从而沿最大约10 cm的样品高度获得无缝的连续断层图像。当以4.5 μm分辨率成像时，若样品接近完美的垂直取向，其最大成像宽度约为1 cm。数据的采集与处理均按照下述方案完成。由于空气与水对X射线的衰减差异显著，因此在植物成像中无需使用医学CT系统常用的对比剂溶液，即可获得优异的图像对比度。在充分水合的植物中，充满空气的导管腔可清晰地与周围充满水的组织区分开来。

<table><tbody><tr><td colspan="4">有关先进光源8.3.2线站设备的具体信息，请参见上述内容</td></tr></tbody></table>

利用高分辨率计算机断层扫描技术可视化植物维管系统的三维结构与功能

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

高分辨率X射线计算机断层扫描（HRCT）是一种具有亚微米级分辨率能力的非破坏性诊断成像技术，目前正被用于三维（3D）评估植物木质部网络的结构与功能（e.g. Brodersen et al. 2010; 2011; 2012a,b）。HRCT成像基于与医学CT系统相同的原理，但高强度的同步辐射X射线源可实现更高的空间分辨率并缩短图像采集时间。本文详细展示了如何结合使用在美利坚合众国加利福尼亚州伯克利市劳伦斯伯克利国家实验室先进光源（Advanced Light Source-LBNL）进行的同步辐射HRCT，以及Avizo软件（VSG Inc.，伯灵顿，马萨诸塞州，美国），对离体组织和活体植物中的植物木质部进行研究。这一新型成像工具使研究人员能够突破传统静态二维光学或电子显微图像的局限，利用虚拟连续切片在任意平面上对样品进行研究。在同一标本上可生成任意方向的无限数量切片，而这一功能在传统显微镜方法中是无法实现的。
结果表明，高分辨率计算机断层扫描（HRCT）可应用于草本和木本植物物种，以及多种植物器官（即叶片、叶柄、茎、树干、根）。本文展示的图像有助于说明代表性植物维管系统解剖结构的多样性，以及从HRCT数据集中提取的细节类型，包括对海岸红杉（Sequoia sempervirens）、胡桃（Juglans spp.）、橡树（Quercus spp.）和枫树（Acer spp.）的幼苗，以及向日葵（Helianthus annuus）、葡萄藤（Vitis spp.）和蕨类植物（Pteridium aquilinum 和 Woodwardia fimbriata）的扫描结果。来自木本植物的离体干燥样品最容易扫描，通常也能获得最佳图像。然而，近年来的技术改进（即更快的扫描速度和样品稳定技术）使得该可视化技术也可用于绿色组织（例如叶柄）甚至活体植物。偶尔，含水的绿色植物组织会发生收缩，导致图像模糊，本文也描述了避免这些问题的方法。这些HRCT技术的最新进展为研究植物维管功能提供了令人期待的新视角。

利用8.3.2光束线（图5），同步辐射高分辨率计算机断层扫描（HRCT）已成功应用于多种植物组织和物种，并以前所未有的三维分辨率揭示了植物木质部结构与功能的新见解。通过三维重建所提供的可视化与探索能力（如图6-8及影片1-3所示），可精确定位离体样品及活体植物中木质部网络内结构的位置与取向。
在某些情况下，样品移动或意外振动会导致最终图像出现畸变，从而使扫描结果无法使用例如 图4），但通过连续断层扫描缩短扫描时间的改进措施，已将此类数据丢失的不利影响降至最低，因为现在可在分配给每位用户的有限束流时间内完成更多扫描。更短的扫描时间还使得能够在一段时间内对同一个样本进行重复测量，从而捕捉到诸如栓塞扩散与修复等过程的动态变化。
<img src="/files/ftp_upload/50162/50162fig1.jpg" alt="示意图...

高分辨率X射线计算机断层扫描（HRCT）是一种非破坏性诊断成像技术，可用于三维研究植物维管系统结构与功能。我们展示了HRCT如何促进对多种植物组织和物种中木质部网络的探索。

高分辨率X射线计算机断层扫描（HRCT）是一种具有亚微米级分辨率能力的非破坏性诊断成像技术，目前正被……

本实验的总体目标是利用基于同步辐射的X射线显微断层成像技术，研究植物中维管组织运输的结构与功能。首先，需将样品制备并安装到卡盘夹具或活体植物夹具中，确保待扫描部分尽可能垂直，并完成必要的初步生理学测量。第二步是将制备好的样品或活体植物放入ALS光束线8.3.2实验站舱内，并固定舱体以进行扫描。接下来。在正确放置样品后，启动扫描。最后一步是利用工作站计算机对扫描数据进行归一化、重建，并评估其质量，然后将数据导入VISO进行三维可视化处理。最终，X射线显微断层扫描技术可用于揭示植物中水分传导维管系统连接结构的精细特征及其功能状态。与现有的连续切片和光学显微镜等方法相比，该技术的主要优势在于能够以前所未有的分辨率在任意方向上对植物组织进行观察。该方法有助于我们理解植物生物学领域中的关键问题，从植物水分运输的基本机制，到抗旱性、抗冻性，以及病原体在寄主植物体内的系统性移动过程。本方案所述内容专为先进光源设施中的工作而设计。8.3 0.2. 在其他同步辐射设施上工作时，可能需要对光束线进行调整。在开始活体植物样品制备之前，务必遵守这些设施所要求的安全和辐射培训规定。首先将植物种植在直径约10厘米的花盆中，确保待扫描的主茎或其他植物部位尽可能居中，并在花盆中保持垂直方向。由于高分辨率计算机断层扫描（HRCT）仪器舱体的物理尺寸限制，活体植物的高度需控制在约一米以内。因此，对活体植物的成像最适合在幼苗或小树苗阶段进行。将植物种植在小花盆中，使用定制的刚性铝制花盆支架来固定活体盆栽植物。顶板高度应可调节，以适应不同高度的花盆。此处，顶板设计为与土壤表面顶端齐平，植物从两片式顶板的中心位置伸出。将植物固定在样品架上后，使用SHO Lander型压力室或夹式叶片参数仪测量茎水势，以确定扫描前植物的生理状态。取一小段铜线缠绕在茎上作为标记物，以确保对需要重复扫描的植物保持一致的扫描位置。然后，将一个薄壁丙烯酸圆筒套在植物上方的铝制植物架上，并用螺丝固定，以稳定样品。应使用额外的塑料保鲜膜、纸巾和胶带进一步减少植物部分的振动和移动，以避免造成图像失真。将定制的样品 holder 固定在气浮载物台上，并锁定在 X 射线源与成像传感器及相机设备之间的位置。务必尽可能使茎秆保持垂直，并将样品居中放置于磁性卡盘基座上，以确保其在旋转过程中始终处于视野范围内。新鲜植物材料（通常为茎或叶柄）可在从活体植物上立即取下后进行扫描。如果实验目的是可视化整个木质部网络，则必须首先将导管内的水分排出并替换为空气。为此，将样品置于细长型压力室中，并以低压通入压缩空气或氮气，持续约五分钟。不同物种所需排出导管网络内水分的时间会有所不同。如果目的是评估新鲜植物组织中栓塞形成的程度，需使用锋利的剃刀片在水下对植物进行取样切割。接着，用一层帕拉福尔膜包裹样品，以防止扫描过程中样品失水；然后将样品固定在安装于金属板

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

使用高解析度电脑断层可视化的三维结构和功能的植物血管

通过微计算机断层扫描进行小动物血管的对比增强成像是一种快速、经济高效且高通量的技术，适用于系列研究 原位...

使用MicroCT进行对比增强血管成像

冠状血管的可视化对于深入理解心血管疾病至关重要。本文介绍一种通过不透射线的硅橡胶（Microfil）灌注小鼠冠状血管的方法，以为微型计算机断层扫描（μCT）成像做好准备。...

小鼠冠状血管逆行灌注与充填作为显微计算机断层扫描成像的制备方法

本方案描述了一种利用市售平板扫描仪快速采集拟南芥幼苗对重力刺激响应图像的方法。该方法能够以较低成本大量获取高分辨率图像，适用于后续分析算法处理。...

利用平板扫描仪采集拟南芥根向重力反应的高分辨率时间序列图像

我们提供了一种新颖的方法，可提高玉米组织的X射线吸收对比度，适用于常规的微型计算机断层扫描。基于CT图像，我们引入了一套针对不同玉米材料的图像处理工作流程，以有效提取玉米维管束的显微表型特征。...

基于X射线显微计算机断层扫描的玉米维管束微米级表型分析技术

观察木质部内的水分分布可为了解木本植物中水分流动动态提供重要信息。本研究展示了原位观察木质部水分分布的实用方法。 通过使用冷冻切片机和冷冻扫描电镜（cryo-SEM），可在样品制备过程中消除水分状态的人为假象变化。...

利用冷冻扫描电子显微镜观察木本植物中木质部的水分分布

该技术旨在通过肺动脉灌注一种基于聚合物的射线不透性化合物，并结合肺组织膨胀，实现对出生后早期及成年小鼠肺动脉网络的离体可视化。本文还讨论了所制备血管铸型组织的潜在应用。...

成年及早期出生后小鼠肺组织的血管铸型用于显微CT成像

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用于基于计算机断层扫描的小鼠后肢血管三维可视化的样本制备

微型计算机断层扫描（Micro-CT）是一种非破坏性工具，可用于三维分析植物结构。本实验方案描述了利用微型计算机断层扫描分析寄生植物结构与功能所需的样品制备方法。通过使用不同物种，展示了该方法在结合特定样品制备技术时的优势。...

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人类心脏多尺度三维解剖研究流程

本文介绍了优化的组织透明化方案，用于对小鼠主动脉进行三维（3D）成像。我们详细阐述了免疫染色、光学透明化和成像的前沿操作步骤，旨在明确在动脉粥样硬化中，外周神经系统与动脉粥样硬化斑块及外膜之间的解剖学邻近关系。...

动脉粥样硬化中主动脉组织的三维成像

本方案介绍了一种利用光片荧光显微镜进行定量整体三维血管成像的快速方法。该方法的有效性通过鸡胚模型的咽弓动脉系统加以验证，并对血流动力学力进行了量化。 通过...

小型动物血管系统的快速全组织高分辨率成像用于定量研究

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利用高分辨率计算机断层扫描技术可视化植物维管系统的三维结构与功能

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