使用高解析度电脑断层可视化的三维结构和功能的植物血管

该程序的总体目标是利用基于同步加速器的 X 射线微断层扫描技术来探索植物中维管运输的结构和功能。这是通过首先准备样品以安装在卡盘支架或活体植物支架中，确保要扫描的部分尽可能垂直并进行必要的初步生理测量来实现的。第二步是将准备好的样品或活植物放入 A LS Beamline 8.3 0.2 牛舍中，并固定牛舍进行扫描。下一个。

正确定位样品后，开始扫描。最后一步是利用工作站计算机对扫描质量进行标准化、重建和评估，然后将数据传递到 VISO 进行 3D 可视化过程。最终，X 射线显微断层扫描用于揭示植物中水传导脉管系统的互连和功能状态的精细细节。

与连续切片和光学显微镜等现有方法相比，该技术的主要优点是可以以前所未有的分辨率在任何方向上探索植物组织。这种方法可以帮助我们了解植物生物学领域的关键问题，从植物中水分运输的基本方面到干旱，从耐冻性到病原体如何在寄主植物中内吸移动。如前所述，该协议专为在高级光源下工作而设计。

8.3 0.2.在其他同步加速器设施工作可能需要光束线适应。请务必遵循使用这些设施所需的安全和辐射培训，以开始活植物的样品制备。

首先在直径约为 10 厘米的花盆中种植植物，确保要扫描的植物的主茎或其他部分在花盆中尽可能居中并垂直定向。HRCT 仪器 Hutch 的物理尺寸将活植物的高度限制在一米左右。因此，最好在幼苗或树苗上对活植物进行成像。

在小花盆中种植，使用定制的刚性铝制花盆架来安装活的盆栽植物。应调整顶板高度以适应一系列花盆高度。在这里，板的顶部设计为与土壤表面的顶部对齐，植物从两部分板的中心突出。

安装到支架中后，使用 SHO 着陆器式压力室或夹式叶参数测量茎水势，以便在扫描前确定植物的生理状态。在茎上缠绕一小块铜线作为受托人，以确保在将被重复扫描的植物上保持一致的扫描位置。现在，将一个薄壁丙烯酸圆柱体放在铝制植物支架顶部的植物上，并用螺钉将其固定到位以稳定样品。

应使用额外的保鲜膜纸巾和胶带，以进一步减少植物部件的振动和移动，这可能会导致图像失真。将定制罐架连接到空气轴承载物台上，并将其锁定在 X 射线源和成像传感器和相机设备之间的位置。确保将茎尽可能垂直放置，并将样品放在电磁吸盘底座的中心，以确保其保持在视野中。在旋转过程中，新鲜的植物材料，通常是茎或宠物，可以在立即从活植物中取出后进行扫描。

如果实验的目的是可视化整个木质部网络，则必须首先将容器内的水排空并替换为空气。为此，将样品安装在 slander 型压力室中，并在低压下将压缩空气或氮气推入样品约 5 分钟。物种撤离船舶网络所需的时间会有所不同。

如果目的是评估新鲜植物组织中栓塞形成的程度，请使用新鲜的剃须刀片从植物中切除样品，在水下进行切割。接下来，将样品包裹在一层多聚形式中，以防止在扫描过程中干燥，将样品安装在固定在拧入空气轴承载物台中心的金属板上的钻夹头中，并如前所述垂直定向样品，以确保样品保持在视野中。要从干燥的木质组织中制备样品，首先将样品切割成大约 6 厘米长。

选择在目标扫描区域中尽可能笔直且直径约为 1 厘米的样品。下一步是缓慢脱水整个样品，以确保最佳的组织样品可视化和图像对比度。将木质组织样品放入低温烘箱中，缓慢干燥样品，而不会导致组织开裂或分裂。

在某些情况下，可能需要将受托标记贴在样品上。这确保了随后利用扫描电子显微镜进行的解剖和可视化可以定向到 HRCT 图像中的特定点。为此，使用香水将金属或玻璃珠或金属丝固定在茎的外部。

最后，在扫描之前，如上所述将样品安装在钻头检查和中心。确定最适合您的应用的放大倍率。这里使用的 A LS Beamline 8.3 0.2 能够使用放大倍数为 2 x 5 x 和 10 x 的镜头进行扫描。

将 X 射线能量设置为 15 千克电子伏特。曝光时间通常取决于样品的厚度和密度，范围为 100 至 1000 毫秒。选择适合您的应用程序的角度增量。

在扫描过程中，样本会旋转 180 度，旋转期间拍摄的图像数量会对数据集的大小、扫描间隔的长度和最终图像质量产生重大影响。典型扫描以 0.25 度的增量执行，每次扫描产生 513 张图像。使用连续断层扫描设置可以实现更短的扫描间隔，在此期间，样品连续旋转，同时为每次扫描捕获图像，还必须收集明场和暗场图像。

明场图像是光束中没有样品的图像。这些通常是在扫描样品之前和之后通过水平平移样品来收集的。通过关闭 X 射线快门来收集暗场。

该指标测量相机在没有 X 射线的情况下显示的信号量。扫描完成后，将原始 2D TIFF 图像从采集计算机传输到文件服务器，然后导出到计算机以用于数据处理。接下来，必须将图像转换为透射百分比刻度。

Beamline 8.3 0.2 有一个自定义背景归一化插件，可以下载并与免费提供的软件包一起使用。图像 J 或 Fiji 将标准化图像加载到 octopus 软件包中，然后使用指定的处理步骤从 2D 原始 TIFF 图像文件重建 3D 数据集。接下来，可以在各种软件包之一中可视化图像堆栈。

这里使用 aviso 软件包，将数据集加载到系统内存中，并以虚拟横向、纵向或径向切片方向显示样品由于数据集的 3D 属性，穿过样品的虚拟切片可以在任何平面上旋转以与感兴趣区域对齐。一旦完成分割，就可以量化目标植物结构或体积、长度、宽度、存在或不存在水、空气等的功能变化。同步辐射 HRCT 扫描已使用 Beamline 8.3 0.2 在各种植物组织和物种上成功实施，并以前所未有的 3D 分辨率为植物木质部的结构和功能提供了新的见解。

如图所示，3D 重建提供的可视化和勘探功能允许使用 Xylem 网络精确确定切除样本和活体植物上结构的位置和方向。在这里，我们看到红杉树干的 3D 重建受到干旱胁迫，并表现出充满空气和水的气管。一旦掌握了，如果作得当，这项技术可以在几分钟内完成。扫描电子显微镜等其他方法可用于验证我们在植物内部看到的结构，并得出大小阈值，然后将其输入到我们用于数据分析的处理程序中。