利用高通量微孔板法测定水体、土壤和沉积物中微生物胞外酶活性

以下实验方案的总体目标是快速检测多种自然环境中微生物的胞外酶活性。该方法首先将水样或土壤悬液加入微孔板中，以实现充分的重复。第二步，向微孔板的孔中加入人工比色或荧光底物，以允许酶促反应发生。接下来，通过测定吸光度或荧光强度，确定反应过程中释放的终产物量。

结果显示，不同样品之间的胞外酶活性存在差异，该差异基于最终反应产物的吸光度或荧光强度。今天我们将演示如何在自然环境中测定胞外酶活性。该方法有助于回答微生物生态学中的关键问题，例如土壤、沉积物和水体中有机质降解速率以及养分矿化过程。通常，初次使用该方法的研究人员会遇到一定困难，尤其是在将颗粒物与反应液分离时，当需要处理大量样品时这一问题尤为突出。

该实验步骤的可视化演示至关重要，因为酶标板布局可能较难掌握，且在多个时间点进行测量会增加操作难度。土壤和沉积物中胞外酶活性的比色分析首先需按照土壤实验方案中的描述，配制底物缓冲液和标准溶液。将待测样品在无菌的15毫升离心管中制成悬浊液。对于沉积物，使用50毫摩尔的乙酸盐缓冲液，按每毫升约含1克样品的浓度进行制备。

加入足够的乙酸盐缓冲液，使泥浆易于泵送。所需泥浆的确切体积将根据检测的酶种类数量而变化，但建议最少使用五毫升。涡旋振荡每份泥浆，直至所有土壤或沉积物团块完全分散。

并记录最终体积。在移液前，用剪刀剪掉移液器吸头的末端。由于土壤悬液容易堵塞吸头，需重新涡旋振荡每种悬液，然后立即向六个孔中各加入150 µL。

在96孔深孔板上进行操作。必须充分且频繁地涡旋振荡。为了使土壤颗粒保持悬浮状态，每个板至少留出两个孔作为空白对照。

为每种待检测的酶准备一个96孔板。将约五毫升乙酸盐缓冲液倒入移液槽中，并使用八通道移液器向每个样品的最后两孔各加入150微升缓冲液。

向样品缓冲液对照以及两个底物对照孔中加入。将约10毫升适当的对硝基苯酚（p-nitrophenyl, PNP）底物溶液倒入移液槽中，使用八通道移液器向每份样品的前四个孔以及两个底物对照孔中各加入150 µL底物溶液。一旦加入底物溶液，反应即开始，此时应记录时间。

将培养板在室温下孵育0.5至4小时。确切的孵育时间将根据样品中的活性水平以及待检测的酶而有所不同。在孵育检测反应的同时，准备一块透明的96孔微孔板。

为了读取每个深孔板的吸光度，需向微孔板的每个孔中加入190微升蒸馏水和10微升1摩尔氢氧化钠。氢氧化钠可减缓酶促反应并提高pH值，从而增强反应孵育后释放的PNP显色效果。将96孔板在2000至5,000 ×g条件下离心5分钟，以沉淀土壤颗粒。

在不扰动沉淀物的情况下移除液体可能具有挑战性。最初必须避免使用过多的土壤样品。确保离心时间足够长，并以谨慎而果断的动作吸取上清液。

使用多通道移液器从每个样品中吸取100 µL，注意避免触碰沉淀。将液体转移至已准备好的透明96孔微孔板的对应孔中，开启酶标仪并设置必要的软件，按照文本方案中所述测定样品干重后，在410 nm处记录吸光度，通过从样品检测吸光度中减去样品对照吸光度，计算每个样品的最终吸光度。

如果底物对照组的吸光度较高，大于0.060，则需减去该值。接着使用此公式计算酶活性，单位为每小时每克干重的微摩尔数。按照文本方案中所示示例，为每种酶准备一块黑色微孔板，将约五毫升第一个水样倒入移液器储液槽中，使用八通道移液器向所有孔中各加入200微升。

在微孔板的第一列丢弃使用过的移液枪头，并根据需要为每个水样重复此操作，以填满第一至第九列。在同一块黑色微孔板上设置对照，以校正样品、标准品、底物和淬灭的影响。样品对照包含样品水和碳酸氢盐缓冲液，虽不用于活性计算，但可显示整个实验过程中读数的一致性。

淬灭对照组包含样品水和一定标准量的荧光标记物，用于测量荧光的衍射。样品水中的底物对照组和标准对照组分别由连接底物或标准荧光标记物以及碳酸氢盐缓冲液组成。将约五毫升的5毫摩尔碳酸氢盐缓冲液倒入干净的移液管储液槽中。

用移液器将50微升缓冲液加入D行和E行的第1至第9号微孔板孔中，为每个样本设置两个重复的样本对照孔，每次更换移液器吸头；然后将200微升碳酸氢盐缓冲液转移至A行和H行的第10至第12号孔中。尽管本演示中为拍摄需要保持光线明亮，但由于荧光标准品对光敏感，实际操作中应调暗或关闭光源以降低环境光照。将约5毫升10微摩尔的4-甲基伞形酮-β-D-吡喃葡萄糖苷酸（MUB）倒入洁净的移液器储液槽中，用移液器吸取50微升加入H行第1至第12号微孔板孔中。再用移液器吸取50微升分别加入G行和F行的第1至第9号孔中，为每个样本设置三个重复的淬灭对照孔，并设置总体标准对照孔。将微孔板置于避光环境中或用不透光盖板覆盖，以减少MUB的光降解。开启荧光计，并设置好所有必要的软件，确保在加入底物前已准备就绪，可立即进行读数。

取约五毫升适当的MUB标记底物加入洁净的移液槽中，使用12通道移液器将50微升底物加入微孔板A行第1至第12孔，以及B行和C行第1至第9孔，为每个样本建立三个重复检测，并设置三个底物对照，随后立即开始记录荧光。在将底物加入微孔板后，立即读取初始荧光值。读数后，将微孔板在室温下避光孵育，或用不透光盖板覆盖孵育。

为了减少MUB的光降解。测定最大潜在酶活性所需的孵育时间取决于样品中酶的浓度。由于该浓度未知，在对样品进行检测之前，需要在多个时间点读取微孔板。

对于大多数酶而言，在一小时内每隔10至15分钟读取一次数据是合适的，尽管某些高浓度样品可能在10分钟内即达到峰值。请在至少一小时的时间内，按照指定的时间间隔持续读取微孔板中的荧光信号。两次读数之间务必保持微孔板覆盖或避光存放。

针对每个时间点的每份样品，计算该时间点的平均初始样品荧光值、平均最终样品荧光值、平均标准荧光值以及平均淬灭对照荧光值。根据文本方案中提供的公式，计算酶活性，单位为每小时每毫升毫摩尔（m/h/mL）。

检查每个时间步长计算出的活性值，根据活性最高的时间步长确定最终的潜在活性。如果活性值持续上升，则可能需要更晚的时间步长。如果活性值在运行过程中持续下降，则应使用更短的时间步长重新运行。

土壤和水体沉积物通常具有显著的胞外酶活性，这是由于微生物群落在颗粒表面生长并附着所致。该图展示了从美国密西西比州北部一条三级溪流表层沉积物中获取的不同粒径颗粒的酶活性变化情况。此前一项研究显示，通过对其群落结构进行分子分析，可将该溪流沉积物颗粒上的细菌群落分为三个不同的类群。

分别位于0.063毫米颗粒、0.125毫米、0.25毫米和0.5毫米颗粒，以及1毫米颗粒上的微生物群落。胞外酶活性模式的分析支持了这一结论：使用对硝基苯磷酸酯（PNP）底物法测定时，磷酸酶在0.125毫米、0.25毫米和0.5毫米颗粒上的活性相似，但在1毫米和0.063毫米颗粒组分中显著更高。其他酶类如β-葡萄糖苷酶和N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（n AGAs）在最细小的颗粒上也表现出类似的活性峰值，但在1毫米颗粒上并未升高。

强调不同酶可能表现出不同的环境分布特征，而这些特征可通过本实验方法加以阐明。相对较小的误差线表明，对沉积物中酶活性的胆碱测定法具有良好的可重复性，因此适用于统计分析。在比较不同环境样品时，天然水体每毫升的胞外酶活性通常低于土壤或沉积物每克的胞外酶活性。

因此，应使用与MUB连接的底物通过荧光定量法对它们进行测定。该图显示了磷酸酶、β-葡萄糖苷酶和N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶（NGA）的活性随深度的变化情况。在美国密西西比州北部的一个浅水湖泊中，该湖以养分贫乏著称，这一点也通过磷酸酶以及微生物为从有机化合物中获取磷酸盐而产生的酶的相对较高活性得到印证。

对于这三种酶，在水面和50厘米深度采集的检测样品显示出相似的活性。而在100厘米深度采集的样品中，酶活性升高，但该样品实质上取自水-沉积物界面，样品中存在沉积物颗粒可能是导致其活性较高的原因，尤其是β-葡萄糖苷酶和N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶（n AGAs）。与PNP底物类似，较小的误差棒表明，即使仅进行三次重复测定，使用MUB底物的荧光检测法仍具有很高的可重复性。

请注意，水样中酶活性的单位为底物消耗的纳摩尔（nmol），而沉积物颗粒上酶活性的单位为底物消耗的微摩尔（µmol），尽管单位量级相近。这突显了土壤和沉积物的胞外酶活性通常远高于天然水体。同时也表明MUB标记底物技术具有更高的灵敏度，因此在测定水样中的胞外酶活性时，必须采用该技术，一旦掌握该方法，即可有效应用。

该技术可用于在略多于一小时内对九个水样中的多达多种酶进行检测。在尝试将此方法用于土壤和沉积物时，重要的是使用已知质量的干物质，以便能够以干重为基础表示酶活性。观看本视频后，您应能够很好地掌握如何利用比色法或荧光法技术，在多种自然环境中测定胞外酶活性。