Name: 在使用高通量微孔板测定水，土壤，沉积物和微生物测定胞外酶活性的 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-01T09:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 23 s
Description: 了解如何使用高通量微孔板测定水、土壤和沉积物中的微生物胞外酶活性。该方法采用比色法或荧光法快速分析多种环境样本中的酶活性差异。

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本研究的部分经费由多个来源提供，包括美国农业部特定合作协定 58-6408-1-595 和美国国家科学基金会（资助号 1049911）。

土壤和沉积物中胞外酶活性的比色分析
1. 酶活性比色分析用底物和缓冲溶液的制备
<ol>
	<li>通过混合以下成分制备 50 mM 乙酸盐缓冲液（pH 5.0–5.5）：50 ml 0.1 M 乙酸（将 2.87 ml 冰乙酸溶于 500 ml 水中）、150 ml 0.1 M 乙酸钠和 200 ml 蒸馏水 H₂O2O. 如有需要，用 0.1 M 乙酸将 pH 调至 5.0–5.5。</li>
	<li>配制1 M氢氧化钠（NaOH）的蒸馏水溶液2O.</li>
	<li>准备 p50 mM 乙酸盐缓冲液中的 NP-偶联底物溶液。为检测磷酸酶，配制 5 mM p50 mM 乙酸盐缓冲液中的NP-磷酸盐；用于检测 &beta;-葡萄糖苷酶，配制5 mM pNP-&beta;-葡萄糖吡喃糖苷；为检测NAG酶活性，配制2 mM pNP-&beta;-N-乙酰氨基葡萄糖苷。所有底物溶液均应在无菌的15 ml或50 ml离心管中配制。溶液可于4℃保存 &deg;2-3 周，4°C</li>
</ol>
2. 确定将吸光度转换为标准的换算标准 pNP 浓度
<ol>
	<li>配制标准溶液 p50 mM 乙酸盐缓冲液中的硝基苯酚。浓度范围应为 0.025–1 mM。</li>
	<li>转移三份100 &mu;将各浓度溶液各取 l 加入透明 96 孔微孔板中。加入 10 &mu;1 M NaOH 和 190 &mu;l 蒸馏水2O至每孔。</li>
	<li>使用酶标仪在410 nm处记录吸光度。</li>
	<li>将标准曲线中的浓度乘以 0.3 以获得 &mu;摩尔 pNP 每 300 &mu;l 反应体积。绘制吸光度随浓度变化的曲线。 &mu;摩尔 pNP。曲线的斜率作为转换因子（C），用于关联吸光度与 &mu;摩尔 p每次酶反应中的 NP。</li>
</ol>
3. 进行酶活性测定
<ol>
	<li>对于土壤样品，在无菌的15 ml离心管中制备每份待测样品的悬液，浓度约为1 g/ml-1 使用50 mM乙酸盐缓冲液。对于沉积物，加入足量的乙酸盐缓冲液，使其成为易于移液的浆液。所需浆液的准确体积取决于所测定的酶种类数量，但建议最少使用5 ml。涡旋振荡每份浆液，直至土壤或沉积物中的所有团块完全分散，并记录最终体积。</li>
	<li>重新涡旋每种悬液，并立即用移液器吸取150 &mu;l 加入至 96 孔深孔板的六个孔中（图1）。为保持土壤颗粒悬浮，必须充分且频繁地涡旋振荡。每个板块至少留出两个孔作为空白底物对照。注意：由于土壤悬液容易堵塞吸头，在移液前需用剪刀剪去移液器吸头的尖端。每种待测酶需准备一个96孔板。</li>
	<li>将约 5 ml 醋酸盐缓冲液倒入多通道移液器储液槽中，使用 8 通道移液器加入 150 &mu;将缓冲液加入每个样本的最后两个孔（这些孔作为样本缓冲液对照）以及两个底物对照孔图1)</li>
	<li>加入约10 ml相应的 p将NP-底物溶液加入移液管储液槽中，并使用8通道移液器加入150 &mu;将底物溶液加入每个样本的前四个孔以及两个底物对照孔中（图1记录时间，因为加入底物溶液后反应立即开始。</li>
	<li>在室温（22 ℃）下孵育培养板 &deg;C）孵育0.5–4小时。确切的孵育时间将根据样品中酶的活性水平及待测酶的种类而有所不同。对于大多数土壤和沉积物，磷酸酶和 &beta;-葡萄糖苷酶需要0.5–1.5小时的孵育时间，而NAG酶及其他酶则需要孵育时间 &gt;2 小时</li>
	<li>孵育检测反应的同时，准备透明的96孔微孔板用于测定吸光度。每个深孔板对应准备一块微孔板。即 （针对每种测定的酶）。用移液器加入10 &mu;1 M NaOH 和 190 &mu;将适量蒸馏水加入微孔板的每个孔中。注意：NaOH 会减缓酶促反应，同时提高 pH，从而增强显色效果 p反应过程中释放的NP。</li>
	<li>孵育后，以2,000–5,000 × g离心96孔板5分钟，使土壤颗粒沉淀。</li>
	<li>使用多通道移液器吸取 100 &mu;从每个孔中小心吸取上清液，避免触及沉淀物，并将其转移至已准备好的透明96孔微孔板中对应的孔内。</li>
	<li>打开酶标仪并设置必要的软件。在410 nm波长下测定吸光度。如果某个孔的吸光度超过酶标仪的线性检测范围，用纯水对该孔样品进行1:1稀释后重新测定。若吸光度仍然过高，则应缩短孵育时间后重新进行检测。</li>
</ol>
4. 样品干重的测定
<ol>
	<li>用移液器将每种样品悬液各1 ml加入已预先称重的铝盘中。</li>
	<li>在75 °C的干燥箱中干燥48小时，然后称重。从该重量中减去铝盘的重量，得到1 ml悬液中土壤或沉积物的干重。将此值乘以0.15的系数，以确定在酶活性测定中加入每个孔的150 μl样品中的干重。</li>
</ol>
5. 每克土壤或沉积物干重的酶活性计算
<ol>
	<li>通过从样品检测吸光度中减去样品对照吸光度，计算每个样品的最终吸光度。如果底物对照的吸光度较高（大约 &gt;0.060），也需减去其吸光度。</li>
	<li>根据以下公式计算酶活性，单位为 μmoles hr-1 g 干重-1：</li>
</ol>
酶活性 = 最终吸光度 / (C × 孵育时间 × 样品干重)
天然水体中胞外酶活性的荧光分析
1. 酶活性荧光分析用底物、标准品和缓冲液溶液的制备
<ol>
	<li>制备 200 &mu;MUB连接底物的M溶液（例如 4-MUB-&beta;-葡萄糖吡喃糖苷，4-MUB-磷酸盐，4-MUB-N-乙酰基&beta;-D-葡萄糖胺）溶解于无菌（高压灭菌）蒸馏H2在无菌的15 ml或50 ml离心管中。用铝箔包裹管子以避光，并在使用前冷藏保存。若按此方式储存，底物至少可保持稳定1周。</li>
	<li>通过配制100的储备液来制备MUB标准品 &mu;无菌蒸馏水中的4-甲基伞形酮2O. 储存于棕色瓶或铝箔包裹的瓶中，冷藏。使用前立即稀释100 &mu;将 M 储备液按 1/10 比例稀释至无菌 H2O 以配制 10 的工作液 &mu;用于酶活性测定的 M。</li>
	<li>通过将 8.4 g NaHCO₃ 溶于水中，配制 100 mM 碳酸氢盐缓冲液的储备液。3 到 1 L H2O 和高压灭菌。将该储备液按 1/20 比例稀释至无菌 H2必要时加入 O，配制 5 mM 的工作液用于酶活性测定。</li>
</ol>
2. 在96孔黑色微孔板中排列水样
<ol>
	<li>按照 图2 所示示例，为每种酶准备一块微孔板。请注意，考虑到足够的重复、标准品和对照，本实验方法可在一块96孔黑色微孔板上同时检测一种酶在多达九个水样中的活性。</li>
	<li>将第一个样品约5 ml倒入移液槽中，使用8通道移液器将200 μl样品加入微孔板中第1列的所有孔内。丢弃已使用的吸头，并根据需要为每个水样重复操作，依次填充第1至第9列。</li>
</ol>
3. 设置样品、标准品、淬灭和底物对照
<ol>
	<li>在同一块黑色微孔板上设置对照，以同时考虑样品、标准品、底物和淬灭的影响（图2）。</li>
	<li>样品对照包含样品水和碳酸氢盐缓冲液，不用于活性计算，但可用于评估整个实验过程中读数的一致性。淬灭对照由样品水和固定量的荧光标记物组成，用于测量样品水中荧光的散射情况。底物对照和标准品对照则分别由底物连接的荧光标记物或标准荧光标记物与碳酸氢盐缓冲液组成。</li>
	<li>将约5 ml的5 mM碳酸氢盐缓冲液倒入洁净的移液槽中。用移液器向D行和E行的第1至第9号孔中各加入50 μl缓冲液，为每个样品设置两个重复的样品对照孔。更换移液器吸头后，向A行和H行的第10至第12号孔中各转移200 μl碳酸氢盐缓冲液。</li>
	<li>调暗或关闭光源以降低环境光照，因为荧光标准品对光敏感。</li>
	<li>将约5 ml的10 μM 4-甲基伞形酮（4-methylumbelliferone）倒入洁净的移液槽中。用移液器向H行的第1至第12号孔以及G行和F行的第1至第9号孔中各加入50 μl，为每个样品设置三个重复的淬灭对照孔，并设置总体标准品对照。将微孔板置于避光环境中或用不透光盖板覆盖，以减少MUB的光降解。</li>
	<li>打开荧光计，并设置好必要的软件，确保在加入底物前已准备就绪，可立即进行读数。注意：某些荧光计灯泡可能需要3分钟或更长时间的预热。</li>
	<li>将约5 ml适当种类的MUB连接底物（例如 4-MUB-磷酸盐）倒入洁净的移液槽中。使用12通道移液器向A行的第1至第12号孔以及B行和C行的第1至第9号孔中各加入50 μl，为每个样品设置三个重复检测孔，并设置三个底物对照孔。随后立即进入步骤4.1，开始记录荧光值。</li>
</ol>
4. 荧光记录
<ol>
	<li>在向微孔板中加入底物后，立即读取初始荧光值。读取荧光值后，将微孔板在室温（22 °C）下避光孵育，或用不透光的盖子覆盖，以减少MUB的光降解。</li>
	<li>测定水样中最大潜在酶活性所需的孵育时间取决于样品中酶的浓度。由于在完成检测前该浓度未知，因此需要在多个时间点读取微孔板。通常情况下，对于许多酶而言，在1小时内每隔10-15分钟读数一次是可接受的，但对于某些酶活性极高的样品，可能在10分钟内即达到峰值。</li>
	<li>按照设定的时间间隔持续读取微孔板中的荧光值，至少持续1小时。两次读数之间务必保持微孔板处于覆盖状态或避光保存。</li>
</ol>
5. 每单位体积水中酶活性的计算
<ol>
	<li>在每个时间点，针对每个样本计算以下指标：初始样本荧光均值（D和E孔）、最终样本荧光均值（A-C孔）、标准荧光均值（H10-11孔）以及淬灭对照荧光均值（F-G孔）。</li>
	<li>在每个时间点，根据以下公式计算酶活性，单位为nmoles hr-1 ml-1：</li>
</ol>
酶活性 = (样品平均荧光值 - 样品初始平均荧光值) / ((标准品平均荧光值 / 0.5 mol) × (淬灭对照平均荧光值 / 标准品平均荧光值) × (0.2 ml) × (反应时间，单位为小时))
<ol start="3">
	<li>检查每个时间步长计算出的活性值。根据活性最高的时间步长确定最终潜在活性。如果活性值持续上升，则可能需要更晚的时间点；如果活性值在运行过程中持续下降，则应使用更短的时间步长重新运行实验。最终活性单位为每小时每毫升消耗的纳摩尔底物（nmoles hr-1 ml-1），但可换算为每小时每升消耗的微摩尔（μmoles hr-1 L-1）来表示。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性财务利益。

测定土壤和沉积物中多种微生物胞外酶的活性，可为养分矿化速率和有机质降解过程提供有价值的见解17。然而，土壤的含水量可能存在差异，因此有必要将酶活性标准化为土壤干重。这需要在测定酶活性的基础上额外增加一个干燥步骤（通常为两天）。因此，与能够快速获得结果的水样酶活性检测不同，土壤和沉积物中酶活性的可靠测定通常需要数天时间。对于某些土壤，以每克有机质或无灰干重表示酶活性可能更为合适，这就需要在干燥步骤之外再增加一个灰化步骤（通常为500 °C下灼烧2小时）。无论采用何种表示方式，土壤或沉积物酶活性比色测定中最关键的步骤是在孵育结束后，通过离心使深孔板中的样品沉降，然后从深孔板中吸取上清液。由于该方法依赖吸光度测定，最终微孔板中即使存在少量游离土壤颗粒，也可能导致错误结果。提高离心速度（&gt;5,000 × g）可能有助于缓解这一问题，但根据我们的经验，能够容纳微孔板的离心机转子通常旋转速度上限低于该值，且深孔板本身可能无法耐受更高的转速。因此，这一特定的移液步骤需要操作者兼顾谨慎与速度，使用多通道移液器迅速将所需量的上清液从深孔板转移至微孔板中。
水样中胞外酶活性...

细菌和真菌等微生物通过产生胞外酶，从复杂的有机化合物中获取营养物质和碳源。这些酶通常将聚合物水解为较小的亚单位，以便细胞吸收。因此，在生态学层面，这些微生物胞外酶负责了自然环境中大部分的养分矿化和有机物分解过程。纤维二糖水解酶（CBH）和β-葡萄糖苷酶在纤维素降解过程中起重要作用，它们协同催化纤维素水解为葡萄糖1,2，从而为微生物的吸收与同化提供可利用的碳源。磷酸酶能从有机磷酸酯中释放出可溶性的无机磷酸根，实质上实现了磷的矿化，使其可供大多数生物利用3。其他酶类，如N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（NAGase），在几丁质降解中具有重要作用，能够释放碳和氮，供微生物获取利用4。
自然环境中微生物胞外酶活性检测的方法之一是使用人工底物 p-硝基苯基（p与纳米颗粒（NP）偶联的底物，该方法最初用于检测土壤磷酸酶活性5该方法依赖于对有色终产物的检测， p-硝基苯酚，当人工底物被相应酶水解时会释放该产物。 p硝基苯酚可通过在约400-410 nm处测量其吸光度进行比色定量。该方法随后已被用于检测其他酶，如NAGase。6，并已用于多种研究中，以检测土壤和沉积物中微生物胞外酶活性7-9.
一种最初用于评估水生环境中胞外糖苷酶活性的替代方法10,11 采用了与4-甲基伞形酮（MUB）连接的底物。反应释放的终产物（4-甲基伞形酮）具有强荧光性，可使用激发/发射波长约为360/460 nm的荧光计进行检测。目前已有多种MUB标记的人工底物，使得至少可检测与使用pNP-底物比色法相当数量的酶活性（例如 β-葡萄糖苷酶、纤维二糖水解酶、N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶、磷酸酶）。其他微生物胞外酶，如降解蛋白质的亮氨酸氨肽酶，也可利用与7-氨基-4-甲基香豆素（COU）连接的底物通过荧光法进行测定。MUB和COU标记的底物均已用于测定多种陆地和水环境样品中的酶活性12,13。
尽管以往的研究已描述了采用荧光法或比色法微孔板方法来测定胞外酶活性14，但仍需要清晰地展示此类测定实验的具体操作流程。本文演示了使用比色法pNP标记底物测定土壤和沉积物中胞外酶活性，以及使用荧光MUB标记底物测定天然水体中胞外酶活性的高通量微孔板技术。我们重点关注β-葡萄糖苷酶、N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶（NAGase）和磷酸酶活性的测定，因为这些酶分别与碳、氮和磷的循环密切相关。然而，本文所述方法也可通过使用其他人工底物，应用于其他胞外酶活性的测定。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;试剂与材料&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>冰乙酸</td><td></td><td></td><td>多家供应商</td></tr><tr><td>乙酸钠</td><td></td><td></td><td>多家供应商</td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td></td><td></td><td>多家供应商</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;p&lt;/em&gt;-硝基苯酚</td><td>Fisher</td><td>BP612-1</td><td>可选用其他替代品</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;p&lt;/em&gt;-硝基苯基（&lt;em&gt;p&lt;/em&gt;NP）-磷酸盐</td><td>Sigma</td><td>N3234</td><td>&lt;em&gt;p&lt;/em&gt;NP-底物</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;p&lt;/em&gt;NP-&amp;#946;-葡萄糖苷</td><td>Sigma</td><td>N7006</td><td>&lt;em&gt;p&lt;/em&gt;NP-底物</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;p&lt;/em&gt;NP-&amp;#946;-&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-乙酰氨基葡萄糖苷</td><td>Sigma</td><td>N9376</td><td>&lt;em&gt;p&lt;/em&gt;NP-底物</td></tr><tr><td>透明96孔微孔板</td><td>Fisher</td><td>12-563-301</td><td>可选用其他替代品</td></tr><tr><td>96孔深孔板</td><td>Costar</td><td>3958</td><td>可选用其他替代品</td></tr><tr><td>铝制称量盘</td><td></td><td></td><td>多家供应商</td></tr><tr><td>无菌15 ml离心管</td><td></td><td></td><td>多家供应商</td></tr><tr><td>无菌50 ml离心管</td><td></td><td></td><td>多家供应商</td></tr><tr><td>4-甲基伞形酮</td><td>Sigma</td><td>M1381</td><td></td></tr><tr><td>4-甲基伞形基（MUB）-磷酸盐</td><td>Sigma</td><td>M8883</td><td>MUB-底物</td></tr><tr><td>4-MUB-葡萄糖苷</td><td>Sigma</td><td>M3633</td><td>MUB-底物</td></tr><tr><td>4-MUB-&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-乙酰氨基葡萄糖苷</td><td>Sigma</td><td>M2133</td><td>MUB-底物</td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td></td><td></td><td>多家供应商</td></tr><tr><td>黑色96孔微孔板</td><td>Costar</td><td>3792</td><td></td></tr><tr><td>移液管储液槽</td><td></td><td></td><td>多家供应商</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;仪器&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>离心机转子</td><td>Eppendorf</td><td>A-4-81</td><td>适用于微孔板/深孔板</td></tr><tr><td>微孔板读板仪</td><td>BioTek</td><td>Synergy HT</td><td>可选用其他替代品</td></tr><tr><td>微孔板荧光计</td><td>BioTek</td><td>FLx 800</td><td>可选用其他替代品</td></tr><tr><td>8通道移液器</td><td></td><td></td><td>多家供应商</td></tr></tbody></table>

利用高通量微孔板法测定水体、土壤和沉积物中微生物胞外酶活性

Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays

自然环境中大部分的养分循环和碳素转化过程是通过微生物释放的胞外酶活性实现的。因此，测定这些胞外酶的活性可以揭示生态系统层面过程的速率，例如有机质分解、氮和磷的矿化作用。环境样品中胞外酶活性的测定通常涉及将样品暴露于人工比色或荧光底物，并追踪底物水解的速率。本文描述了基于微孔板的方法，可实现短时间内对大量样品进行分析。样品在96孔微孔板或深孔微孔板中与人工底物发生反应，随后通过常规微孔板读数仪或荧光计检测反应终产物的吸光度或荧光强度，从而确定酶活性。这类高通量方法不仅有助于对空间上相隔的不同地点或生态系统进行比较，还通过显著减少每个样品所需的试剂总体积，大幅降低了测定成本。

土壤和水体沉积物通常具有显著的胞外酶活性，这是由于微生物群落（生物膜）附着在颗粒表面生长所致。图3展示了从美国密西西比州北部一条三级溪流表层沉积物中获取的不同粒径颗粒上，这种酶活性如何随颗粒大小而变化。先前一项研究表明，通过对群落结构进行分子分析，可将该溪流沉积物颗粒上的细菌群落分为三个明显不同的类群：附着在0.063 mm颗粒上的群落、附着在0.125、0.25和0.5 mm颗粒上的群落，以及附着在1 mm颗粒上的群落15。胞外酶活性分布模式的分析支持了这一结论；使用pNP标记底物法测定时，磷酸酶活性（图3A）在0.125、0.25和0.5 mm颗粒上相近，但在1 mm和0.063 mm组分上显著更高。其他酶类如β-葡萄糖苷酶（图3B）和N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶（NAGase，图3C）在最细颗粒上也表现出类似的活性峰值，但在1 mm颗粒上并未升高，这表明不同酶类可能具有不同的环境分布特征，而本实验方法有助于揭示这些差异。相对较小的误差棒表明，对沉积物中酶活性...

本文描述了基于微孔板的胞外酶活性比色法或荧光法分析流程。这些方法可在合理的时间范围内，对大量环境样品中的酶活性进行快速测定。

自然环境中大部分的养分循环和碳元素转化过程是通过微生物释放的胞外酶活性实现的。

以下实验方案的总体目标是快速检测多种自然环境中微生物的胞外酶活性。该方法首先将水样或土壤悬液加入微孔板中，以实现充分的重复。第二步，向微孔板的孔中加入人工比色或荧光底物，以允许酶促反应发生。接下来，通过测定吸光度或荧光强度，确定反应过程中释放的终产物量。结果显示，不同样品之间的胞外酶活性存在差异，该差异基于最终反应产物的吸光度或荧光强度。今天我们将演示如何在自然环境中测定胞外酶活性。该方法有助于回答微生物生态学中的关键问题，例如土壤、沉积物和水体中有机质降解速率以及养分矿化过程。通常，初次使用该方法的研究人员会遇到一定困难，尤其是在将颗粒物与反应液分离时，当需要处理大量样品时这一问题尤为突出。该实验步骤的可视化演示至关重要，因为酶标板布局可能较难掌握，且在多个时间点进行测量会增加操作难度。土壤和沉积物中胞外酶活性的比色分析首先需按照土壤实验方案中的描述，配制底物缓冲液和标准溶液。将待测样品在无菌的15毫升离心管中制成悬浊液。对于沉积物，使用50毫摩尔的乙酸盐缓冲液，按每毫升约含1克样品的浓度进行制备。加入足够的乙酸盐缓冲液，使泥浆易于泵送。所需泥浆的确切体积将根据检测的酶种类数量而变化，但建议最少使用五毫升。涡旋振荡每份泥浆，直至所有土壤或沉积物团块完全分散。并记录最终体积。在移液前，用剪刀剪掉移液器吸头的末端。由于土壤悬液容易堵塞吸头，需重新涡旋振荡每种悬液，然后立即向六个孔中各加入150 µL。在96孔深孔板上进行操作。必须充分且频繁地涡旋振荡。为了使土壤颗粒保持悬浮状态，每个板至少留出两个孔作为空白对照。为每种待检测的酶准备一个96孔板。将约五毫升乙酸盐缓冲液倒入移液槽中，并使用八通道移液器向每个样品的最后两孔各加入150微升缓冲液。向样品缓冲液对照以及两个底物对照孔中加入。将约10毫升适当的对硝基苯酚（p-nitrophenyl, PNP）底物溶液倒入移液槽中，使用八通道移液器向每份样品的前四个孔以及两个底物对照孔中各加入150 µL底物溶液。一旦加入底物溶液，反应即开始，此时应记录时间。将培养板在室温下孵育0.5至4小时。确切的孵育时间将根据样品中的活性水平以及待检测的酶而有所不同。在孵育检测反应的同时，准备一块透明的96孔微孔板。为了读取每个深孔板的吸光度，需向微孔板的每个孔中加入190微升蒸馏水和10微升1摩尔氢氧化钠。氢氧化钠可减缓酶促反应并提高pH值，从而增强反应孵育后释放的PNP显色效果。将96孔板在2000至5,000 ×g条件下离心5分钟，以沉淀土壤颗粒。在不扰动沉淀物的情况下移除液体可能具有挑战性。最初必须避免使用过多的土壤样品。确保离心时间足够长，并以谨慎而果断的动作吸取上清液。使用多通道移液器从每个样品中吸取100 µL，注意避免触碰沉淀。将液体转移至已准备好的透明96孔微孔板的对应孔中，开启酶标仪并设置必要的软件，按照文本方案中所述测定样品干重后，在410 nm处记录吸光度，通过从样品检测吸光度中减去样品对照吸光度，计算每个样品的最终吸光度。如果底物对照组的吸光度较高，大于0.060，则需减去该值。接着使用此公式计算酶活性，单位为每小时每克干重的微摩尔数。按照文本方案中所示示例，为每种酶准备一块黑色微孔板，将约五毫升第一个水样倒入移液器储液槽中，使用八通道移液器向所有孔中各加入200微升。在微孔板的第一列丢弃使用过的移液枪头，并根据需要为每个水样重复此操作，以填满第一至第九列。在同一块黑色微孔板上设置对照，以校正样品、标准品、底物和淬灭的影响。样品对照包含样品水和碳酸氢盐缓冲液，虽不用于活性计算，但可显示整个实验过程中读数的一致性。淬灭对照组包含样品水和一定标准量的荧光标记物，用于测量荧光的衍射。样品水中的底物对照组和标准对照组分别由连接底物或标准荧光标记物以及碳酸氢盐缓冲液组成。将约五毫升的5毫摩尔碳酸氢盐缓冲液倒入干净的移液管储液槽中。用移液器将50微升缓冲液加入D行和E行的第1至第9号微孔板孔中，为每个样本设置两个重复的样本对照孔，每次更换移液器吸头；然后将200微升碳酸氢盐缓冲液转移至A行和H行的第10至第12号孔中。尽管本演示中为拍摄需要保持光线明亮，但由于荧光标准品对光敏感，实际操作中应调暗或关闭光源以降低环境光照。将约5毫升10微摩尔的4-甲基伞形酮-β-D-吡喃葡萄糖苷酸（MUB）倒入洁净的移液器储液槽中，用移液器吸取50微升加入H行第1至第12号微孔板孔中。再用移液器吸取50微升分别加入G行和F行的第1至第9号孔中，为每个样本设置三个重复的淬灭对照孔，并设置总体标准对照孔。将微孔板置于避光环境中或用不透光盖板覆盖，以减少MUB的光降解。开启荧光计，并设置好所有必要的软件，确保在加入底物前已准备就绪，可立即进行读数。取约五毫升适当的MUB标记底物加入洁净的移液槽中，使用12通道移液器将50微升底物加入微孔板A行第1至第12孔，以及B行和C行第1至第9孔，为每个样本建立三个重复检测，并设置三个底物对照，随后立即开始记录荧光。在将底物加入微孔板后，立即读取初始荧光值。读数后，将微孔板在室温下避光孵育，或用不透光盖板覆盖孵育。为了减少MUB的光降解。测定最大潜在酶活性所需的孵育时间取决于样品中酶的浓度。由于该浓度未知，在对样品进行检测之前，需要在多个时间点读取微孔板。对于大多数酶而言，在一小时内每隔10至15分钟读取一次数据是合适的，尽管某些高浓度样品可能在10分钟内即达到峰值。请在至少一小时的时间内，按照指定的时间间隔持续读取微孔板中的荧光信号。两次读数之间务必保持微孔板覆盖或避光存放。针对每个时间点的每份样品，计算该时间点的平均初始样品荧光值、平均最终样品荧光值、平均标准荧光值以及平均淬灭对照荧光值。根据文本方案中提供的公式，计算酶活性，单位为每小时每毫升毫摩尔（m/h/mL）。检查每个时间步长计算出的活性值，根据活性最高的时间步长确定最终的潜在活性。如果活性值持续上升，则可能需要更晚的时间步长。如果活性值在运行过程中持续下降，则应使用更短的时间步长重新运行。土壤和水体沉积物通常具有显著的胞外酶活性，这是由于微生物群落在颗粒表面生长并附着所致。该图展示了从美国密西西比州北部一条三级溪流表层沉积物中获取的不同粒径颗粒的酶活性变化情况。此前一项研究显示，通过对其群落结构进行分子分析，可将该溪流沉积物颗粒上的细菌群落分为三个不同的类群。分别位于0.063毫米颗粒、0.125毫米、0.25毫米和0.5毫米颗粒，以及1毫米颗粒上的微生物群落。胞外酶活性模式的分析支持了这一结论：使用对硝基苯磷酸酯（PNP）底物法测定时，磷酸酶在0.125毫米、0.25毫米和0.5毫米颗粒上的活性相似，但在1毫米和0.063毫米颗粒组分中显著更高。其他酶类如β-葡萄糖苷酶和N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（n AGAs）在最细小的颗粒上也表现出类似的活性峰值，但在1毫米颗粒上并未升高。强调不同酶可能表现出不同的环境分布特征，而这些特征可通过本实验方法加以阐明。相对较小的误差线表明，对沉积物中酶活性的胆碱测定法具有良好的可重复性，因此适用于统计分析。在比较不同环境样品时，天然水体每毫升的胞外酶活性通常低于土壤或沉积物每克的胞外酶活性。因此，应使用与MUB连接的底物通过荧光定量法对它们进行测定。该图显示了磷酸酶、β-葡萄糖苷酶和N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶（NGA）的活性随深度的变化情况。在美国密西西比州北部的一个浅水湖泊中，该湖以养分贫乏著称，这一点也通过磷酸酶以及微生物为从有机化合物中获取磷酸盐而产生的酶的相对较高活性得到印证。对于这三种酶，在水面和50厘米深度采集的检测样品显示出相似的活性。而在100厘米深度采集的样品中，酶活性升高，但该样品实质上取自水-沉积物界面，样品中存在沉积物颗粒可能是导致其活性较高的原因，尤其是β-葡萄糖苷酶和N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶（n AGAs）。与PNP底物类似，较小的误差棒表明，即使仅进行三次重复测定，使用MUB底物的荧光检测法仍具有很高的可重复性。请注意，水样中酶活性的单位为底物消耗的纳摩尔（nmol），而沉积物颗粒上酶活性的单位为底物消耗的微摩尔（µmol），尽管单位量级相近。这突显了土壤和沉积物的胞外酶活性通常远高于天然水体。同时也表明MUB标记底物技术具有更高的灵敏度，因此在测定水样中的胞外酶活性时，必须采用该技术，一旦掌握该方法，即可有效应用。该技术可用于在略多于一小时内对九个水样中的多达多种酶进行检测。在尝试将此方法用于土壤和沉积物时，重要的是使用已知质量的干物质，以便能够以干重为基础表示酶活性。观看本视频后，您应能够很好地掌握如何利用比色法或荧光法技术，在多种自然环境中测定胞外酶活性。

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