同时捕获实时图像在两个发射通道采用了双摄像头发射分光系统:应用到细胞粘附

该程序的总体目标是使用双摄像头发射分流系统进行平行板流室粘附测定，以同时记录两种颜色的实时图像序列。为此，首先将成像装置上的两台相机对齐。接下来，制备细胞和反应性底物并设置平行板流通室。

然后，针对双色图像采集校准相机设置，并对相机对准进行任何必要的数字校正。然后捕获图像序列，演示以高时间分辨率采集双色图像。与单相机系统相比，双相机发射分光系统的优势在于，可以为每个相机分配不同的曝光时间，并保留完整的视野。

这项技术可以帮助回答细胞粘附领域的关键问题，例如粘附分子在细胞表面的定位如何影响动态生物过程，例如细胞迁移、炎症和癌症转移。以下程序需要倒置落射荧光显微镜。这应该配备一个与光导耦合的高强度光源、一个组合滤光片立方体和一个双摄像头发射分光相机系统。

显微镜设置应连接到运行成像软件的计算机，该软件能够收集和组合单色 CCD 相机捕获的图像。这里，stream picks five 多相机软件与 simul picks 模块一起使用。首先在任务功能区中打开流选取 5，然后选择工作区。

然后在屏幕的最右侧，打开 workspace manager 并选择 New workspace。命名相机后，按照软件提示从预填充的列表中进行选择，与相机型号匹配的采集器，工作区中将出现一个小相机图标，表示已收到相机源。使用显微镜成像的物体现在可以在屏幕上查看。

对第二个摄像机工作区重复此过程，然后对于合并的工作区，再次重复此过程，所有摄像机都在使用中。将出现错误消息。此消息表示将摄像机从工作区 1 和 2 正常分配到位于查看屏幕右侧的停靠面板中的合并工作区。

工作区 1 和 2 中的图像将作为两个伪彩色图像叠加在合并的工作区中。此过程最困难的方面是相机对齐。为确保成功，我们在严格遵循制造商说明的同时使用制造商幻灯片。

要在双摄像头发射分光系统中对准相机，请将明场或相差光发送到显微镜目镜。将制造商提供的金属涂层校准网格放在显微镜载物台上，并将网格放在显微镜载物台上。显示网格而不进行像素合并和自动缩放，并将其聚焦然后移位，但不要移除二向色外壳以对齐相机 1。

然后使用海山端口 1 上的调焦旋钮，再次对焦图像。接下来，将二向色外壳完全推入双通道采集设备，以便图像被二向色镜分割到两个相机。松开 3 5 60 4 英寸固定螺钉，然后旋转母 CM 卡口 2 上的第二台相机，直到两张图像中的网格方向相同使用 C 卡口 2 上的调焦旋钮，将相机 2 的图像对准焦点。

要完成对齐，请使用 DC 2 右侧的 RL 旋钮调整组合图像位置，直到右提升。图像的垂直边界在合并的工作区中精确对齐。然后使用 UD 旋钮调整第二张图像的上下对齐方式，直到水平网格条正确对齐。

如果在上下对齐过程中出现轻微的摄像机旋转，请松开摄像机 2 的 3 5 60 英寸第四英寸螺钉并旋转直到显示的图像正确对齐，以解决此问题。通过使用 LOR 5、68 和 4 88 二级抗体用抗 CD 24 和 TECA 4 5、2 染色，制备用于平行板流室粘附测定的 BET 20 乳腺癌细胞，如随附文件所述，确保在染色后准备适当的单色对照将细胞分配到平行板流室的储液器中。将两条不同长度的管路连接到流通室的入口和出口。

一根管子将连接到包含悬浮在 DPBS plus 中含有 0.1% PSA 的标记细胞的储液器。将另一根管子连接到注射泵，注射泵将以指定的流速抽出液体。将真空管线连接到流动室，并将流动室放置在 35 毫米组织培养皿上，该培养皿包含单层表达凝集素或 cho e 细胞的中国仓鼠卵巢细胞。

调整流通室和流通室垫圈以确保足够的真空密封。从储液罐中抽出液体，监测流通室组件是否正确密封。最后，将流通室组件放在显微镜上，打开光源和手动检查的显微镜设置。

确保二向色外壳处于正确的压低工作位置，并且未处于旁路模式。手动更改为荧光模式并选择绿色红色荧光滤光片立方体以分别确定曝光时间和增益。在相机 1 中使用红色荧光，在相机 2 中使用绿色荧光对细胞进行成像。

根据需要手动按下二向色性以获取图像。接下来，放置仅用红色菌群染色的 BT 20 细胞悬液。储液槽中的四种偶联抗体连接到平行板流通室的入口。

使用注射泵将 BT 20 细胞灌注在平行板流通室中的 choi 单层上。在成像软件的实时设置中，调整相机 1 的曝光时间以获得红色通道中的图像。将相机 2 的曝光时间与相机 1 的曝光时间相匹配。

如果在绿色通道中观察到图像，则会出现伪像渗出。如果发生这种情况，请保持摄像机 1 和摄像机 2 中的曝光时间相等，并缩短曝光时间，直到渗透伪像在绿色通道中不再可见。如有必要，调整相机 1 的增益以提高红色通道中的图像可见性。

接下来，从储液器中取出任何剩余的 BT 20 细胞悬液，并用 DPBS 替换悬液。使用注射泵将溶液灌注在 choi 单层上，直到 BT 20 细胞在单层上不再可见。用仅用绿色荧光 4 偶联抗体染色的 BT 20 细胞悬液重新填充储液槽。

使用绿色单色控件重复摄像机校准过程。此时间定义摄像机 2 的曝光时间，以对绿色通道中的单元格进行成像，而不会通过摄像机 1 收集的红色通道中的伪影进行渗透。使用成像软件可同时查看从流通室中的两台单色 CCD 相机捕获的图像。实验。

使用 stream picks 的 simul pics 模块合并从两个相机收集的图像。使用模拟图片或其他软件中的数字校正调整，在空间上对齐合并的图像。如有必要，可以使用 simul PIC 模块校正图像，以进行水平、垂直和旋转调整。

该系统现在可用于同时捕获两个彩色图像。平行板流室粘附测定用于演示本视频中描述的双摄像头发射分流系统。如图所示，系统检测到用抗人 CD 24 荧光标记的 BT 20 细胞（红色）和 HECA 4 52，它与 SCO 相关分子结合（绿色）。

一些滚动单元格显示红色信号，但不显示绿色信号。其他单元格显示绿色信号，但不显示红色信号，而其他单元格同时显示红色和绿色信号。这里。这些相机保持了光学和时间分辨率，以跟踪细胞在反应性底物上沿流动方向滚动时的细胞特征合并发射通道揭示了 CD 24 和饱和分子在 BT 20 细胞表面滚动和粘附在 CHO e 单层上的分布和共定位。

这些图像显示了单个 BT 20 单元的缩放，其中 CD 24 和饱和分子共定位，当红色和绿色伪彩色发射通道合并时，显示为黄色到橙色的斑点。综合起来。这些信息表明，双摄像头发射分流系统具有在细胞在视野中快速移动的流式室粘附测定等应用中揭示细胞和分子特征所需的空间、时间和光学分辨率。

观看本视频后，您应该对如何设置和校准双摄像头发射分流系统或以两种颜色实时对平行板流室粘附测定进行成像有很好的了解。该方法可应用于其他使用荧光研究细胞行为的体外检测。