使用一个荧光显微镜进行多种成像模式
October 28th, 2018
在这里, 我们提出了一个实用的指南, 建立一个综合显微镜系统, 合并传统的 epi 荧光成像, 单分子检测的超分辨率成像和多色单分子检测, 包括单分子荧光共振能量转移成像, 成一种以经济高效的方式进行设置。
此方法可以帮助回答光学显微镜领域的关键问题，例如如何使用同一显微镜拍摄超分辨率图像和 FRET 图像。该技术的主要优点是，我们可以将三个不同的成像模块组合成一台显微镜，从而显著降低总体成本。该方法的可视化演示至关重要，因为激励路径的组装很难学习。
它们需要正确选择零件和敏感的光学校准。首先，通过 PCI 接口安装数据采集卡，并用它来将激光器连接到计算机。通过晶体管-晶体管逻辑输出控制激光的开、关行为，通过该卡的模拟输出控制激光的功率调整。
接下来，准备一个振动隔离光学表与反射镜和分束器，如这里所示，并随附文本协议中所述。通过将光纤适配器板首先安装在 z 轴转换支架中，将激光束组合成单模光纤。接下来，在笼板中安装无色双片镜头。
使用延长杆连接适配器和镜头以形成保持架。然后，使用一英寸厚的光学柱将笼子安装在光学桌子上。通过调整元件来对齐 647 纳米激光器，通过光纤获得最大的激光功率输出。
第一个激光器的对齐完成后，临时安装一对虹膜，然后一个一个地对齐其余的激光器。使用功率计检查每个激光器的对齐效率。请务必在适配器板前面留一个光圈，以减少激光的反射。
接下来，设计和安装放大镜，如随附的文本协议中所述。为了创造提取每个分子的 z 坐标所必需的散光效果，请将具有 10 米焦距的 3D 镜头放入盒式磁带中，并将其插入发射光束路径中。为了最大限度地减少连续多色荧光成像期间的振动，请使用放置在显微镜旁边的屏障滤镜轮中的发射过滤器。
在单分子 FRET 实验中，为了同时进行多色检测，请将另一个滤波器集放在发射分路器中。要使用光能激发设置衍射受限成像，首先将激发激光器的偶发角调整为照明臂的光显模式。接下来，分离 3D 镜头，并将旁路立方体插入发射分路器。
然后，插入磁镜，以扩大照明。设置完成后，根据预期结果拍摄样品的多通道、z 堆栈和/或时间失效的图像。要建立表面固定分子的多色单分子检测，首先将滤芯滚轮移动到空位置。
这将允许激光通过。然后，将激发激光的杂角调整到草皮角度，并分离磁光和 3D 镜头。接下来，首先将旁路立方体替换为校准立方体，使所有光线都通过所有通道，从而在发射分路器中使用三通道模式。
然后，在 DIC 下打开相机，并调整发射分路器的光圈，直到屏幕上出现三个完全分离的通道。转动发射分路器上的垂直水平调节控制旋钮，大致对齐三个通道。接下来，关闭相机，将校准立方体替换为三立方。
放置100纳米多通道珠的样品。在488纳米的激发下，100纳米多通道珠发出不同波长的光，实现三通道对齐。然后，打开相机和 488 纳米激光器，放大其中一个明亮的磁珠，最后通过再次转动调节控制旋钮来对齐三个通道。
现在样品就位后，使用弱激光，导航到具有合理点密度的区域，并调整激光功率和曝光时间，以实现可接受的信噪和光漂白水平。然后使用成像软件拍摄延时图像。对于超高分辨率成像，请首先插入 3D 镜头并移除磁镜镜头。
然后确定最佳激发激光的偶发角为草皮角度。为了找到SR成像的正确目标高度，使用DIC成像来查找细胞的中间平面。按单元格变为透明的高度确定平面。
确定所需的焦平面后，开始超高分辨率成像。在成像时，改变 405 纳米激光的功率，以保持闪烁点的合理密度。无需紫罗兰激光电源即可开始成像。
计算特定时间段的闪烁点数，并增加紫罗兰激光功率，使闪烁点的数量保持在视野中用户定义的计数阈值以上。通过检测成像帧中每个点的质心来分析数据，并从 X 和 Y 宽度提取每个点的 z 值。构建重建的图像，并在 3D 中可视化对象。
这种显微镜设置允许在不同的成像方法之间灵活且可重复切换，包括传统的荧光成像、基于单分子检测的超分辨率成像和多色单分子检测。为了在分子组合中揭示更精细的细节，超分辨率显微镜结合了数千个图像，如这个图像。然后重建这些图像以生成最终的超分辨率图像。
超分辨率技术允许高空间分辨率，提供其他技术无法看到的细节。这突出显示在此处显示的两个图像中。超分辨率图像显示与荧光图像相同的细菌调节 RNase，但允许单分子检测。
SmFRET 是另一种能够对纳米分辨率产生焦虑的方法。在这里，折叠的RNA分子被标记为绿色供体染料和红色接受染料。荧光强度轨迹可以从单个单个分子中提取，从而产生F FRET效率作为时间函数。
不要忘记，使用激光可能很危险，在执行此过程时，应始终采取佩戴眼罩或降低激光功率等预防措施。
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概述
本文提供了一个实用指南，用于构建一个集成显微镜系统，该系统结合了常规的表面荧光成像、超分辨率成像和多色单分子检测。该方法旨在降低成本，同时提供先进的成像能力。
关键研究组成部分
科学领域
- 光学显微镜
- 荧光成像
- 超分辨率技术
背景
- 结合不同的成像技术可以增强研究能力。
- 单分子检测对于先进成像至关重要。
- 显微镜需要成本效益的解决方案。
- 激发路径的组装是复杂的，需要仔细的对准。
研究目的
- 提供组装集成显微镜系统的指南。
- 展示如何使用相同的设置捕获超分辨和FRET图像。
- 简化显微镜研究人员的学习过程。
使用的方法
- 通过PCI接口安装数据采集卡。
- 将激光器连接到计算机以进行控制。
- 使用晶体管-晶体管逻辑进行激光控制。
- 模拟输出用于激光器的功率调节。
主要结果
- 集成系统允许成本效益的成像解决方案。
- 组装技术的演示有助于理解。
- 成功地将多个成像模块组合成一个显微镜。
- 增强了进行超分辨和FRET成像的能力。
结论
- 集成显微镜系统是研究人员的宝贵工具。
- 成本降低是可以实现的，而不会影响成像质量。
- 视觉演示对于有效学习至关重要。
常见问题
Executive Industry Relevance
Integrating multiple fluorescence imaging modalities into a single microscope reduces capital expenditure and laboratory footprint while expanding analytical capabilities for target validation and mechanistic studies. This approach supports early discovery workflows by enabling reproducible switching between conventional, super-resolution, and single-molecule FRET imaging without requiring dedicated instruments. The resulting platform enhances predictive confidence in molecular interaction studies and conformational analysis, directly informing lead identification and preclinical de-risking decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through angstrom-resolution conformational tracking and molecular interaction dynamics via smFRET.
- Operational Value: Provides reproducible, label-compatible readouts for target engagement and binding kinetics in native cellular contexts.
- Strategic Value: Supports target de-risking by correlating structural changes with functional outcomes, improving go/no-go criteria in lead optimization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers quantitative, single-molecule-level data for assay standardization and hit confirmation in phenotypic screening campaigns.
- Operational Value: Enables multiplexed detection of molecular species and interactions, increasing information density per assay well.
- Strategic Value: Reduces false positives through direct visualization of target binding events, improving hit-to-lead transition efficiency.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates biomarker validation by co-localizing therapeutic targets with functional readouts in disease-relevant models.
- Operational Value: Ensures imaging continuity from discovery through preclinical validation using a standardized, reusable platform.
- Strategic Value: Supports mechanism-based go/no-go decisions by providing structural and dynamic insights into target behavior in complex systems.
Pipeline & Workflow Integration
The system bridges early discovery and lead identification by delivering structural and dynamic data that inform target confidence and compound mechanism of action.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of molecular conformations and interactions through smFRET and super-resolution readouts.
- Screening: Provides assay-ready, quantitative single-molecule outputs for compound screening and counter-screening applications.
- Analytics: Generates FRET efficiency trajectories and z-coordinate-resolved reconstructions for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects in vitro target validation to preclinical models through consistent imaging readouts across scales.
- Enterprise Reuse: Functions as a shared core capability across target biology, assay development, and preclinical teams, reducing redundant equipment investment.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct observation.
- Operational Value: Delivers standardization and reproducibility across imaging modes via switchable optical elements.
- Strategic Value: Improves capital efficiency and reduces late-stage biological risk through early, multi-modal target characterization.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on structural and functional validation data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical alignment, laser safety, and fluorescence microscopy principles.
- Depends on vibration-isolated optical tables, precision translation stages, and sensitive detection hardware.
- Necessitates cross-team standardization of filter sets, laser lines, and calibration protocols for reproducible results.
- Involves adaptation considerations for different sample types, including live cells, fixed tissues, and purified complexes.
- Limited by the need for careful optical alignment during mode switching, which impacts throughput if not standardized.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:37
Microscope Design: Assembly of the Excitation Path
2:18
Microscope Design: Assembly of the Emission Path
2:59
Diffraction-limited Imaging with Epi-excitation
3:36
Multi-channel Single-molecule Imaging Including smFRET
5:37
SR Imaging
6:59
Results: Multiple High Resolution Imaging Modes on a Single Fluorescence Microscope
8:11
Conclusion
