Name: 使用一个荧光显微镜进行多种成像模式 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: 了解如何构建集成式荧光显微镜系统，实现常规落射荧光成像、超分辨率成像和多色单分子检测。该方法通过将三种成像模块整合到一台显微镜中，显著降低设备成本，同时保持高质量成像能力。

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J.F. 感谢Searle学者项目和NIH主任新创新者奖的支持。作者感谢伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校Paul Selvin实验室在3-D镜头定位方面提供的有益建议。

1. 显微镜的设计与组装
<ol>
	<li>激发路径 
	注意：激发光路包括激光器、微分干涉差（DIC）组件、显微镜主体及其照明臂。
	<ol>
		<li>准备一个隔振光学平台。例如，一个尺寸为 48 x 96 x 12 英寸的结构阻尼平台可为所有组件提供足够的空间。 
		注意：在具有温度控制的房间内搭建装置（例如，21.4 ± 0.55 °C）。温度稳定性对维持光学对准至关重要。</li>
		<li>安装配备有用于光纤连接的照明臂、100倍油浸TIRF物镜和微分干涉差（DIC）组件的显微镜主体。</li>
		<li>放置四个激光头（647 nm、561 nm、488 nm 和 405 nm，用圆圈标出） 图1B）及其散热器固定在光学平台上，并确保发射的激光束高度相同且尽可能短，以保证良好的稳定性（例如, 3’’). 
		注意：如果某个激光头的高度低于其他激光器，则应在下方放置一块足够厚度的铝板。务必确保散热器与光学平台之间最大程度接触，以实现最佳散热效果。图1B）。激光器的功率必须足够用于超分辨率成像。参见 材料表建议在二极管激光器前安装激光清理滤光片。</li>
		<li>通过外设组件互连（PCI）接口在工作站中安装数据采集卡，并将激光器与此卡连接。通过该卡的晶体管-晶体管逻辑（TTL）输出控制激光器的开关行为，通过其模拟输出控制激光器的功率调节。图1C安装合适的显微成像软件（商业或自研），以控制数据采集卡和显微镜主体。</li>
		<li>安装反射镜和二向色分光镜（590、525 和 470 长通滤光片）至各自的镜座上。反射镜应使用非常稳定的镜架。使用带固定环的圆形分光镜，以避免二向色分光镜发生任何弯曲图1D).</li>
		<li>将反射镜和二向色镜放置在光学平台上，以合并激光束（图1B）。为了实现最稳定的对准，应使整个装置尽可能紧凑，并使用1英寸厚度的光学支杆。激光器的排列应使波长较短的激光器更靠近光纤耦合端。图1B因为短波长的光在空气中散射更明显。</li>
		<li>将激光束耦合至单模光纤中。为此，通过以下步骤在笼式系统中构建光纤耦合器：
		<ol>
			<li>将光纤适配器板安装至 z 轴平移调节架中（图1E，最左侧图面板）。</li>
			<li>安装一个消色差双合透镜（焦距 = 7.5 mm）到笼式平台中（图1E，左侧第二个图板）。</li>
			<li>通过延长杆将上述两个部分连接起来，形成一个笼式结构。使用安装支架将笼式结构固定在1英寸厚的光学支架上（图1E，中间图板）。</li>
			<li>首先使用单模光纤（FC/APC端连接至耦合器）对准647 nm激光器。 
			注意：在使用单模光纤之前，先使用多模光纤进行粗略对准，可能有助于对准过程。调整反射镜和二向色镜的角度（图1D，通过调节旋钮），以及消色差双合透镜与光纤适配板之间的距离（图1E通过调节z轴平移装置，使激光器通过光纤输出的激光功率达到最大。</li>
			<li>完成第一台激光器的准直后，临时安装一对光阑，并依次准直其余各台激光器（图1F）。使用功率计检查对准效率。</li>
			<li>在适配板前方保留一个虹膜，以减少激光的反射。 
			注意：强烈的背向反射会缩短激光光源的使用寿命。可根据需要在每个激光头前安装一个光学隔离器，以完全消除反射。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将光纤的另一端连接到显微镜的照明臂上（图1H).</li>
		<li>通过以下步骤设计并安装“放大透镜（mag lens）”： 
		注意：激光器可用于样品的落射荧光成像，但每束激光的光束尺寸较窄，导致样品被照区域远小于相应相机传感器的实际成像面积，尤其是对于新型相机（对角线长度为18.8 mm，而传统相机为11.6 mm）。因此，建议扩束以实现对样品更大且更均匀的照明。
		<ol>
			<li>设计可安装到照明臂中的磁透镜（图1H). 
			注意：磁透镜的设计取决于其安装位置。 图1H 展示了照明臂中安装的一个示例，但其可安装于激光束准直后的任意位置（参见 讨论）。使用计算机辅助设计与制图软件进行设计。</li>
			<li>放置两个消色差透镜，其中一个为凹透镜（焦距 = f1），以及一个凸透镜（焦距 = f2）置于自制的磁透镜支架中（图&#160;2A 和 2C），其间距等于它们的焦距之和 f1 + f2 = (-25) + 50 = 25 mm图2B). 
			注意：通过选择此焦距，放大镜使光束扩展了 f2/|f1| = 2倍。磁透镜具有多功能性，可将其移除以恢复常规照明，而不扩展光束（图 2D）或反向插入，以聚焦激光束，从而获得更强的激发强度。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 发射光路
注意：发射光路由一个可拆卸的柱面透镜、一个滤光轮、一个发射光分束器和一个EMCCD相机组成（图1G）。为了获得单分子最佳的点扩散函数（PSF），需将微分干涉（DIC）棱镜移出物镜光路。
<ol>
	<li>定制设计圆柱透镜（3-D 透镜）卡匣，使其能够插入显微镜机身的手动 DIC 分析器插槽中（图 3C）。 
	注意：此设计不会影响 DIC 分析器的使用，因为分析器模块可插入滤光片转轮中。</li>
	<li>将焦距为 10 m 的 3-D 透镜放入卡匣中，并将其插入发射光路，以产生必要的像散效应，从而提取每个单分子的 z 坐标14。 
	注意：可选择将 3-D 透镜卡匣置入或移出发射光路（图 3C）。</li>
	<li>在显微镜机身内的滤光片转轮中安装多通道二向色分光镜。</li>
	<li>安装发射滤光片。 
	注意：发射滤光片的选择取决于所使用的荧光染料。根据成像模块的不同，发射滤光片可安装在不同位置，具体如下：
	<ol>
		<li>对于顺序多色落射荧光成像或超分辨成像，使用安装在显微镜机身旁的屏障滤光片轮中的发射滤光片，以在通道切换期间最小化显微镜机身的振动（图 1G）。</li>
		<li>对于同时多色检测（例如，单分子 FRET 实验），在发射分光器中安装另一组滤光片（详见步骤 4）。 
		注意：通常，商用发射分光器具有两种可切换模式（即，“启用”或“旁路”模式）。为了在同时多色成像中实现发射光的色散分离（“启用”模式），需使用包含两个二向色分光镜和三个发射滤光片的滤光片组（“三合一滤光片组”，图&#160;4C 和 4D），并与屏障滤光片轮中的空位配合使用。而对于顺序多色成像，则用仅内置镜面的滤光片组（“旁路滤光片组”，图&#160;4A 和 4D）替代三合一滤光片组。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将 EMCCD 相机作为发射光路的最后一个组件进行安装。利用 USB-PCI 连接以实现高帧率成像。 
	注意：推荐使用 EMCCD 相机以实现最灵敏的单分子检测，但先进的 sCMOS 相机也可作为替代方案。</li>
</ol>
3. 使用落射式激发进行衍射极限成像
<ol>
	<li>调整照明臂中激发激光的入射角度至倒置模式（epi-mode）。</li>
	<li>如已启用，解除3-D镜头（图3C，右侧面板）。</li>
	<li>在发射分光镜中插入旁路滤光立方体（图&#160;4A 和 4E，底层面板）。</li>
	<li>（可选）插入放大镜头以扩大照明区域（图2D，左侧面板）。 
	注意：使用放大镜头与100倍油浸物镜时，可实现约91 × 91 µm2 的均匀照明，无需使用白光光源和多个滤光立方体。</li>
	<li>使用显微成像软件采集多通道、和/或Z轴层扫、和/或延时图像。 
	注意：目前有多种显微成像软件可供选择，不仅来自显微镜制造商，也包括第三方公司或开源开发者提供的程序。</li>
</ol>
4. 包括单分子FRET在内的多通道单分子成像
注意：将滤光轮移至“空”位置，以便所有波长的发射光均可到达发射光分离器中的第二组滤光片/二向色镜。
<ol>
	<li>为了使用TIRF激发进行表面固定分子的多色单分子检测15（包括smFRET测量），调节激发激光的入射角至TIRF角。解除放大镜片和三维（3-D）镜片的连接。</li>
	<li>通过以下步骤在发射分光器中启用三通道模式（图1G）：
	<ol>
		<li>将旁路立方体更换为“校准立方体”，使光可通过所有通道（图&#160;4B 和 4E）。</li>
		<li>在DIC模式下开启相机（即，屏障滤光轮中无发射滤光片），并调节发射分光器的光圈，直至屏幕上出现三个完全分离的通道。 
		注：此步骤应在室内灯光开启的条件下进行，以便观察所有通道。</li>
		<li>旋转发射分光器上的垂直/水平调节旋钮，粗略对齐三个通道（图&#160;4E 和 4F）。</li>
		<li>关闭相机，将校准立方体更换为三通道立方体（图&#160;4C 和 4E）。</li>
		<li>将含有100 nm多通道微珠的样品置于100倍物镜上方，并对样品进行聚焦。</li>
		<li>开启相机和488 nm激光器，放大至其中一个明亮的微珠，再次旋转调节旋钮，精细对齐三个通道（图&#160;4E 和 4G）。 
		注：100 nm多通道微珠在488 nm激发下可发射不同波长的光，从而实现三通道对齐。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>开启相机和激光器，进行聚焦并找到一个斑点密度合适的视野。调节激光功率和曝光时间，以获得可接受的信噪比和光漂白水平。使用显微成像软件采集时间序列图像。</li>
</ol>
5. SR 成像
注意：这是基于单分子检测的超分辨率显微技术。
<ol>
	<li>设置SR成像时，插入3-D镜头并移除放大镜头。在相应的激光通道中设置相机的曝光时间（例如，5 - 60 毫秒）。确定并手动调节激发激光的入射角至全内反射荧光（TIRF）角。</li>
	<li>将样品置于SR成像缓冲液中16让缓冲液平衡至少10分钟后再进行成像。 
	注意：SR成像缓冲液约1小时后失效，因此需相应配制新鲜的SR成像缓冲液。</li>
	<li>在进行超分辨率成像前，先获取微分干涉差（DIC）图像。为了找到适用于超分辨率成像的最佳物镜高度，以优化像散效应，需利用DIC成像确定细胞的中位平面。该平面可通过细胞图像由“亮”变“暗”并呈现透明状态时对应的高度来识别。图&#160;5A, 5B，以及 5C）。确定所需的焦平面后，启动 z 轴漂移校正系统（图1A).</li>
	<li>进行SR成像。调整405 nm激光功率，以保持“闪烁开启”斑点的合理密度。 
	注意：虽然可以手动调节405 nm激光，但更便捷的方法是运行程序化的数据采集代码，以维持“闪烁开启”斑点的密度。以下是一个自动操作的示例。源代码可应要求提供。图6).
	<ol>
		<li>以 0 W/cm² 的功率密度开始成像采集2 紫色激光功率</li>
		<li>在特定时间段内统计闪烁出现的斑点数量。</li>
		<li>调节紫色激光功率，使视野中闪烁出现的点数量保持在用户定义的“计数阈值”以上。当闪烁出现的点数量低于计数阈值时，增加紫色激光功率。</li>
		<li>当闪烁亮起的点数在使用最大紫光激光功率时降至计数阈值以下，终止采集。 
		注意：最大值可根据样品亮度设置为不同数值，但不得超过 130 W/cm2根据SR成像的实际目标，可随时手动终止该自动采集程序。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采集开始后立即检查光斑的闪烁行为和点扩散函数（PSFs）。 
	注意：如果闪烁行为不理想，可调整激发激光的入射角度或更换成像缓冲液。预期会观察到点扩散函数（PSF）呈现“垂直”、“水平”和“菱形”形状，分别代表来自焦平面下方、上方以及焦平面内的荧光分子。图5D）。如果大多数斑点显示为垂直或水平的点扩散函数（PSF），则表明焦平面偏离了细胞中心，此时应终止实验并重新调整焦平面。浸油中存在气泡或其他局部因素可能影响PSF的质量，因此可能需要更换浸油或更换样品的成像区域。</li>
	<li>对于数据分析，使用开源（NIH ImageJ 插件中）或商业化的代码，以检测每帧图像中每个斑点的质心，并根据 x 和 y 方向的宽度提取每个斑点的 z 值14. 
	注意：本报告中使用的源代码最初是在基于单分子检测的超分辨率成像技术最早期研究之一中开发的8 已修改用于三维检测16 并被使用。</li>
	<li>对于双色成像，先对激发波长较长的荧光染料进行成像，随后对激发波长较短的荧光染料进行成像。运行自动采集程序，步骤类似于5.4中所述，但使用不同的成像激光器。 
	注意：应在不同荧光染料的图像之间校正色差（例如，红色染料和黄绿色染料）。步骤如下。
	<ol>
		<li>将多个100 nm多通道微球固定在玻璃盖玻片上，避免形成团块。</li>
		<li>在不同的激发通道下对它们进行成像。</li>
		<li>通过软件提取其（X, Y, Z）坐标（步骤 5.6）。</li>
		<li>绘制 ΔXi X1i - X2i 和 ΔYi = Y1i - Y2i （i 代表不同的微珠，1 和 2 代表不同的颜色通道）分别进行，并使用适当的函数进行拟合。保存这些函数。 
		注意：线性函数在大多数情况下已足够。一旦确定这些函数，便无需在每次成像时重复此测量。</li>
		<li>在对目标样本进行实际的双色超分辨成像时，应用相应函数校正（X, Y）方向的色差。对于Z方向的色差，通过获取ΔZ = Z1 - Z2 用于与待测样本共同接种的多通道微球或已知参考多通道样本。 
		注意：与（X，Y）方向色差不同，Z方向色差在每次实验中的可重复性较差，主要原因是通道切换时Z方向对焦未能完全保持。因此，建议每次实验均进行校正。ΔZ = Z1 - Z2 在很大程度上独立于（X，Y），因此每个感兴趣的样本区域仅需少量微珠或参考样品即可。将构建的最终双色超分辨率图像导入三维可视化软件，并手动检查ΔZ。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

这种混合显微镜系统消除了购买多台显微镜的需求。所有部件的总成本，包括光学平台、平台安装人工、软件和工作站，约为23万美元。定制加工部件（包括磁透镜和三维透镜）的成本约为700美元（具体费用取决于不同机构的实际收费标准）。目前市面上常见的基于单分子检测的超分辨显微成像集成系统价格通常超过30万至40万美元，且在没有白光光源的情况下，难以实现单分子荧光共振能量转移（smFRET）测量，或在合理视场范围内进行落射照明成像。因此，本文所介绍的方法能够以显著降低的成本实现相当于多台显微镜的成像功能。
该调制显微镜系统可基于不同制造商的显微镜主体构建。3-D透镜可安装在发射光路中的任意位置，包括发射分光器内部、显微镜主体内部，或滤光轮与物镜转盘之间的可用空间。然而，3-D透镜的物理位置将决定其实现最佳像散效应以进行3-D超分辨（SR）成像所需的焦距。我们建议初始选择10米的焦距。放大透镜（mag lens）本质上是安装在激发光路中的一个扩束系统。如果激发激光器为自由空间耦合（i.e., 未使用光纤），则在激光束准直后的任意位置安装此类扩束系统都非常简便。如果激发激光器为光纤耦...

荧光显微镜是现代生命科学研究的重要工具，许多生物学实验室 routinely 进行荧光成像。通过将目标生物分子与荧光染料标记结合，我们可以在显微镜下直接观察它们，并记录其在活体（in vivo）或体外（in vitro）条件下随时间变化的定位、构象、相互作用及组装状态。1,2 传统的荧光显微镜受限于衍射极限，其空间分辨率在横向约为 200 - 300 nm，轴向约为 500 - 700 nm，因此仅适用于百纳米至微米尺度的成像。为了揭示分子组装或组织结构中的更精细细节，目前已开发出多种能够突破衍射极限的超分辨率（SR）显微技术。实现超分辨率的策略包括利用非线性光学效应，如受激发射损耗（STED）显微术3,4 和结构光照明显微术（SIM）5,6,7；基于单分子随机检测的方法，如随机光学重建显微术（STORM）8 和光激活定位显微术（PALM）9；以及上述两类方法的结合，例如 MINFLUX10。在这些超分辨率显微技术中，基于单分子检测的超分辨率显微镜可相对容易地从单分子显微系统改装而来。通过对目标生物分子上标记的光激活荧光蛋白（FPs）或可光切换染料进行重复激活与成像，空间分辨率可达 10 - 20 nm11。为了实时获取分子间相互作用和构象动态的信息，需要达到埃至纳米级的分辨率。smFRET12,13 是实现该分辨率的一种方法。通常情况下，根据所研究的生物学问题，需要采用具有不同空间分辨率的成像方法。
通常，每种成像方式都需要特定的激发和/或发射光路配置。例如，单分子检测中最常用的照明方法之一是全内反射（TIR），该方法需要通过棱镜或物镜实现特定的激发角度。对于单分子FRET（smFRET）检测，供体和受体染料的发射光需要在空间上分离，并导向电子倍增电荷耦合器件（EMCCD）的不同区域，这可通过在发射光路中放置一系列反射镜和二向色分光镜来实现。对于三维（3-D）超分辨（SR）成像，需要在发射光路中加入光学元件（如柱面透镜14），以产生像散效应。因此，自行搭建或商业化的集成显微镜通常针对特定成像方法进行功能优化，难以在同一系统上灵活切换不同的成像模式。本文介绍一种成本较低、功能混合的系统，可在三种不同成像方法之间实现可调节且可重复的切换：传统基于衍射极限分辨率的落射荧光成像、基于单分子检测的超分辨成像，以及多色单分子检测（包括smFRET成像）（图1A）。具体而言，本系统采用光纤耦合输入的多色激光器进行激发，并在激发光路中配备商用照明臂，可程序化控制激发角度，从而在落射模式和TIR模式之间切换。在发射光路中，显微镜主体内安装了一个可拆卸的自制柱面透镜盒，用于实现3-D超分辨成像；同时，在EMCCD相机前放置了一个商用分光器，可根据需要选择性启用，以同时检测多个发射通道。

<table><tbody><tr><td>尼康 Ti-E 显微镜支架</td><td>尼康</td><td>Ti-E</td><td></td></tr><tr><td>物镜</td><td>尼康</td><td>100X NA 1.49 CFI HP TIRF</td><td></td></tr><tr><td>显微成像软件</td><td>尼康</td><td>NIS-Elements 高级研究/HC</td><td>HC 包括 &quot;职位招聘&quot; 模块，该程序化采集模块用于SR成像。</td></tr><tr><td>照明臂</td><td>尼康</td><td>Ti-TIRF-EM 电动照明单元 M</td><td>该臂上设有用于放大镜片的插槽</td></tr><tr><td>分析模块</td><td>尼康</td><td>Ti-A</td><td>这被安装在滤光片转轮中。</td></tr><tr><td>Z轴漂移校正系统</td><td>尼康</td><td>无进展生存期</td><td>该系统由物镜转换器上的步进电机、红外发光二极管（IR LED）和探测器组成。</td></tr><tr><td>光学平台桌面</td><td>TMC</td><td>783-655-02R</td><td></td></tr><tr><td>光学平台底座</td><td>TMC</td><td>14-426-35</td><td></td></tr><tr><td>647 nm 激光器</td><td>Cobolt</td><td>90346 (0647-06-01-0120-100)</td><td>647 nm 120 mW 调制激光二极管，包含激光头、CDRH 控制盒、USB 线缆和 PSU（电源单元）</td></tr><tr><td>561 nm 激光器</td><td>相干的</td><td>1280721</td><td>OBIS 561 nm LS 150 mW 激光系统</td></tr><tr><td>488 nm 激光器</td><td>Cobolt</td><td>90308 (0488-06-01-0060-100)</td><td>488 nm 60 mW 调制激光二极管，包含激光头、CDRH 控制盒、USB 线缆和电源装置（PSU）</td></tr><tr><td>405 nm 激光器</td><td>Crystalaser</td><td>DL405-025-O</td><td>405（±5）nm，25 mW，圆形，M2 &amp;lt;1.3，低噪声，连续波，TTL 信号频率高达 20 MHz。配备 2 个用于 TTL 的 BNC 接口 &amp;和模拟调节</td></tr><tr><td>散热器</td><td>Cobolt</td><td>11658 (HS-03)</td><td>两个部件：无风扇散热片 HS-03，适用于 647 nm 和 488 nm 激光器的散热片</td></tr><tr><td>散热器</td><td>相干的</td><td>1193289</td><td>Obis 带风扇散热片，165 x 50 x 50 mm，用于 561 nm 激光器</td></tr><tr><td>CAB-USB-miniUSB</td><td>Cobolt</td><td>10908</td><td>两套单元，用于647 nm和488 nm激光器的通信电缆</td></tr><tr><td>用于高度调节的铝制部件</td><td>McMaster-Carr</td><td>9146T35</td><td>多功能6061铝合金矩形棒，4毫米 × 40毫米，1英尺长，用于抬升561纳米激光器</td></tr><tr><td>用于高度调节的铝制部件</td><td>McMaster-Carr</td><td>8975K248</td><td>多功能6061铝合金，1-1/4&quot; 厚 X 3&quot; 宽度 × 1 英尺长度，用于提升 405 nm 激光</td></tr><tr><td>BNC 电缆</td><td>L-com</td><td>CC58C-6</td><td>RG58C 同轴电缆，BNC 公头/公头，6.0 英尺</td></tr><tr><td>BNC 适配器</td><td>L-com</td><td>BA1087</td><td>同轴适配器，BNC穿墙式，接地型</td></tr><tr><td>SMA转BNC适配器</td><td>HOD</td><td>SMA-870</td><td>Cobolt MLD 激光器具有 SMA 接口，因此该适配器用于 BNC 连接。</td></tr><tr><td>SMB 转 BNC 适配器</td><td>费尔维微波</td><td>FMC1638316-12</td><td>SMB 插头转 BNC 母头面板安装电缆 RG316 同轴线，12 英寸，适用于 Coherent Obis 激光器</td></tr><tr><td>数据采集卡</td><td>国家仪器公司</td><td>PCI-6723</td><td>13位、32通道、800 kS/s模拟输出设备，用于控制激光器、微分干涉差（DIC）LED等</td></tr><tr><td>屏障滤光轮控制器</td><td>Sutter Instrument</td><td>Lambda 10-B</td><td>光学滤光片转换器</td></tr><tr><td>发射光分离器</td><td>凯恩</td><td>OptoSplit III</td><td></td></tr><tr><td>二向色分光镜</td><td>色度</td><td>T640LPXR-UF2</td><td>OptoSplit III 中用于分离红色发射光与绿色发射光的二向色分光镜</td></tr><tr><td>二向色分光镜</td><td>Chroma</td><td>T565LPXR-UF2</td><td>分色镜分离绿色 &amp;以及在OptoSplit III中将蓝色发射与红色发射分离</td></tr><tr><td>发射滤光片</td><td>染色</td><td>ET700/75M</td><td>两个单元，OptoSplit III 和 Barrier 滤光轮中的红色发射光滤光片（如 Alexa Fluor 647）</td></tr><tr><td>发射滤光片</td><td>染色</td><td>ET595/50M</td><td>OptoSplit III 和滤光片转轮中的黄色/绿色发射光滤光片（如 Cy3B）两个单元</td></tr><tr><td>发射滤光片</td><td>染色</td><td>ET525/50M</td><td>两个单元，OptoSplit III 和 Barrier 滤光轮中的蓝色发射滤光片（适用于 Alexa Fluor 488/GFP 等）</td></tr><tr><td>发射滤光片</td><td>Semrock</td><td>FF02-447/60-25</td><td>用于紫色发射光（如 DAPI/Alexa Fluor 405）的发射滤光片，安装在阻挡滤光轮中</td></tr><tr><td>二向色分光镜</td><td>Chroma</td><td>zt405/488/561/647/752rpc-UF3</td><td>显微镜机身内用于647、561、488和405 nm激光激发的多波段二向色分光镜</td></tr><tr><td>DAPI滤光片组</td><td>染色</td><td>49000</td><td>安装在显微镜主体中</td></tr><tr><td>尼康激光/TIRF滤光立方体</td><td>色度</td><td>91032</td><td></td></tr><tr><td>590 长通滤光片</td><td>Chroma</td><td>T590LPXR-UF1</td><td>用于结合647 nm激光与561 nm激光</td></tr><tr><td>525 长通滤光片</td><td>染色</td><td>T525LPXR-UF1</td><td>用于将已合并的647 nm和561 nm激光与488 nm激光进行组合</td></tr><tr><td>470 长通滤光片</td><td>色度</td><td>T470LPXR-UF1</td><td>用于将已合并的647 nm、561 nm和488 nm激光与405 nm激光进行组合</td></tr><tr><td>激光清理滤光片（647）</td><td>色度</td><td>zet640/20x</td><td>用于清除647 nm激光的其他波长</td></tr><tr><td>激光清理滤光片（488）</td><td>Semrock</td><td>LL01-488-25</td><td>用于清除488 nm激光中的其他波长</td></tr><tr><td>LED光源</td><td>Excelitas</td><td>X-Cite120LED</td><td>仅用于 DAPI 成像</td></tr><tr><td>镜架</td><td>纽波特</td><td>SU100-F3K</td><td></td></tr><tr><td>光学柱</td><td>纽波特</td><td>PS-2</td><td></td></tr><tr><td>夹叉</td><td>纽波特</td><td>PS-F</td><td></td></tr><tr><td>功率计</td><td>纽波特</td><td>PMKIT</td><td>用于测量激光功率</td></tr><tr><td>二向色性光束合束器支架</td><td>Edmund Optics</td><td>58-872</td><td>C型接口运动学安装座，用于在激光激发组件中固定二向色分光镜合束器</td></tr><tr><td>卡环</td><td>Thorlabs</td><td>CMRR</td><td>用于二向色性光束合束器安装座</td></tr><tr><td>光纤适配器板</td><td>Thorlabs</td><td>SM1FC</td><td>FC/PC光纤适配器板，带外置SM1（1.035）&quot;-40) 穿线</td></tr><tr><td>Z轴平移调节架</td><td>Thorlabs</td><td>SM1Z</td><td>Z轴平移安装座，兼容30 mm笼式系统</td></tr><tr><td>消色差双合透镜</td><td>Thorlabs</td><td>AC050-008-A-ML</td><td>&amp;Oslash;5 毫米，安装式消色差双合透镜，AR 镀膜：400 - 700 纳米</td></tr><tr><td>笼板</td><td>Thorlabs</td><td>CP1TM09</td><td>带M9×0.5内螺纹和8-32丝锥的30 mm笼板</td></tr><tr><td>笼具组装杆</td><td>Thorlabs</td><td>ER4</td><td>笼具组装杆，4&quot; 长， &amp;Oslash;6 mm</td></tr><tr><td>笼具安装支架</td><td>Thorlabs</td><td>CP02B</td><td>30 mm笼式系统安装支架</td></tr><tr><td>单模光纤</td><td>Thorlabs</td><td>P5-405BPM-FC-2</td><td>补光光纤，PM，FC/PC转FC/APC，405 nm，熊猫型，2 m</td></tr><tr><td>多模光纤</td><td>Thorlabs</td><td>M42L01</td><td>&amp;Oslash;50 &amp;micro;m，0.22 数值孔径，FC/PC-FC/PC 光纤跳线，1 m</td></tr><tr><td>消色差双合透镜（放大透镜）</td><td>Thorlabs</td><td>ACN127-025-A</td><td>ACN127-025-A - f=-25.0 mm, &amp;Oslash;1/2&quot; 消色差双合透镜，抗反射涂层：400-700 nm，含凹透镜 &quot;磁透镜&quot;</td></tr><tr><td>消色差双合透镜（放大透镜）</td><td>Thorlabs</td><td>AC127-050-A</td><td>f=50.0 mm &amp;Oslash;1/2&quot; 消色差双合透镜，抗反射涂层：400-700 nm，凸透镜 &quot;磁透镜&quot;</td></tr><tr><td>卡环</td><td>Thorlabs</td><td>SM05PRR</td><td>SM05 塑料卡环用于 &amp;Oslash;1/2&quot; 透镜管和透镜支架，用于 &quot;磁透镜&quot;</td></tr><tr><td>尼龙尖螺丝</td><td>Thorlabs</td><td>SS3MN6</td><td>M3 × 0.5 尼龙尖端紧定螺钉，6 mm 长，用于固定 &quot;3D 透镜&quot;</td></tr><tr><td>3D 透镜</td><td>CVI Laser Optics</td><td>RCX-25.4-50.8-5000.0-C-415-700</td><td>f=10 m，矩形柱面透镜</td></tr><tr><td>EMCCD相机</td><td>Andor</td><td>iXon Ultra 888</td><td></td></tr><tr><td>100 nm 多通道微球</td><td>Thermo</td><td>T7279，TetraSpeck 微球</td><td></td></tr><tr><td>红色染料</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>Alexa Fluor 647</td><td></td></tr><tr><td>黄绿色染料</td><td>GE Healthcare</td><td>Cy3</td><td></td></tr><tr><td>绿色染料</td><td>GE Healthcare</td><td>Cy3B</td><td></td></tr><tr><td>蓝色染料</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>Alexa Fluor 488</td><td></td></tr></tbody></table>

使用一台荧光显微镜实现多种成像模式

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

荧光显微镜是检测生物分子的一种强大工具 原位 并实时监测它们的动态变化和相互作用。除了传统的落射荧光显微镜外，已发展出多种成像技术以实现特定的实验目标。其中一些广泛应用的技术包括单分子荧光共振能量转移（smFRET），该技术可报告埃级分辨率下的构象变化和分子相互作用，以及基于单分子检测的超分辨率（SR）成像，该技术可将空间分辨率提高约十倍&#160;相较于衍射受限显微镜，分辨率可提高至二十倍。本文介绍一种用户定制的集成化系统，该系统将多种成像方法整合于一台显微镜中，包括传统的落射荧光成像、基于单分子检测的超分辨成像，以及多色单分子检测成像（含单分子FRET成像）。通过切换光学元件，可轻松且可重复地实现不同成像模式。该装置易于被生物科学领域的各类研究实验室采用，尤其适用于需要常规开展多样化成像实验的单位，在成本和空间占用方面显著优于分别为特定用途搭建独立显微镜的方案。

该显微镜可灵活且可重复地在不同成像方法之间切换。此处展示了使用每种成像模块采集的样本图像。
图 5D 展示了在超分辨成像过程中闪烁开启分子的点扩散函数（PSF）。通过重建数千张此类图像，生成最终的超分辨图像（图5E). 图 5E 显示了与上图荧光显微图像中相同的细菌调控RNA 图7A. 图7 显示一个小的调控性RNA的代表性落射荧光图像 大肠杆菌 细胞和U2OS哺乳动物细胞中的mRNA。两种RNA均通过荧光标记的DNA寡核苷酸进行标记 原位 杂交17. <strong cla...

本文介绍了一种构建集成显微系统的实用指南，该系统以经济高效的方式将传统的落射荧光成像、基于单分子检测的超分辨率成像以及多色单分子检测（包括单分子荧光共振能量转移成像）整合到一个装置中。

荧光显微镜是一种强大的工具，可用于原位检测生物分子，并实时监测其动态变化和相互作用。除了……

该方法有助于解答光学显微镜领域中的关键问题，例如如何使用同一台显微镜获取超分辨率图像以及FRET图像。该技术的主要优势在于，我们可将三种不同的成像模块整合到一台显微镜中，显著降低总体成本。对该方法进行可视化演示至关重要，因为激发光路的组装过程较难掌握。它们需要正确选择部件并进行精密的光学对准。首先，通过PCI接口安装数据采集卡，并使用该卡将激光器连接到计算机。通过晶体管-晶体管逻辑输出控制激光器的开关，通过该卡的模拟输出调节激光器的功率。接下来，按照此处所示及随附文本方案中的描述，准备一个隔振光学平台，并安装反射镜和分束器。首先将光纤适配板安装在Z轴平移调节架上，然后在笼式平台中安装消色差双合透镜，以将激光束耦合进单模光纤。使用延长杆连接适配器和镜头以构成一个笼式结构。然后，使用一英寸厚的光学支架将笼式结构固定在光学平台上。通过调整各组件，使647纳米激光器经光纤输出的激光功率达到最大，从而完成光路准直。完成第一台激光器的准直后，临时安装一对小孔光阑，并逐一准直其余的激光器。使用功率计检查每台激光器的准直效率。务必在适配板前方保留一个光阑，以减少激光的反射。接下来，按照随附的文字版实验方案设计并安装放大透镜。为了产生提取每个分子z坐标所必需的像散效应，将一个焦距为10米的3D透镜放入盒式装置中，并将其插入发射光路。为了在连续多色落射荧光成像过程中最小化振动，使用安装在显微镜旁的屏障滤光轮中的发射滤光片。在单分子FRET实验中进行多色同时检测时，需在发射光分离器中放置另一组滤光片。若要设置基于倒置照明激发的衍射极限成像，首先在照明光路中调节激发激光的入射角度至倒置（epi）模式。接着，移出3D透镜，并将旁路立方体插入发射光分离器中。然后，插入用于扩展照明的磁透镜。设置完成后，根据所需结果对样品进行多通道、z轴层扫和/或时间推移成像。为了建立表面固定分子的多色单分子检测，首先将滤光轮移至空位。这将允许激光穿过。然后，调节激发激光的入射角度至与草坪角一致，并解除磁透镜和3D透镜的连接。接着，通过首先将旁路立方体更换为校准立方体（该立方体允许所有光通过所有通道），在发射分光器中启用三通道模式。然后，在微分干涉相差（DIC）模式下打开相机，调节发射光路分光器的光圈，直到屏幕上出现三个完全分离的通道。旋转发射光路分光器上的垂直-水平调节旋钮，大致对齐这三个通道。接着，关闭相机，将校准滤光块更换为三通道滤光块。放置100纳米多通道微球样品。在488纳米激发下，100纳米多通道微球会发射不同波长的光，从而实现三通道对齐。然后，打开相机和488纳米激光器，放大其中一个明亮的微球，并再次调节对准控制旋钮，最终完成三个通道的对齐。样品放置就位后，使用弱激光找到一个点密度合理的区域，并调整激光功率和曝光时间，以获得可接受的信噪比和光漂白水平。然后使用成像软件采集延时图像。进行超分辨率成像时，首先插入3D镜头，并移除放大镜头。然后确定最佳激发激光入射角作为草坪角。为了找到适用于超分辨成像的合适物镜高度，使用微分干涉差（DIC）成像定位细胞的中层平面。通过细胞变得透明时对应的高度来确定该平面。确定所需的焦平面后，开始超分辨率成像。成像过程中，调节405纳米激光的功率，以维持合适的闪烁点密度。开始成像时，不使用紫光激光功率。在特定时间段内统计闪烁出现的斑点数量，并增加紫色激光功率，使视野中闪烁出现的斑点数量保持在用户定义的计数阈值以上。通过检测成像帧中每个斑点的质心来分析数据，并根据X和Y方向的宽度提取每个斑点的z值。构建重建图像，并对物体进行三维可视化。这种显微镜配置可灵活且可重复地在不同成像方法之间切换，包括传统的落射荧光成像、基于单分子检测的超分辨率成像以及多色单分子检测。为了揭示分子组装中的更精细结构，超分辨率显微镜会整合数千张此类图像，并通过重建生成最终的超分辨率图像。超分辨率技术能够实现高空间分辨率，提供其他技术无法观察到的细节。这一点在下方显示的两幅图像中尤为突出。超分辨率图像与落射荧光图像展示的是同一种细菌调控性核糖核酸酶，但前者可实现单分子检测。单分子FRET（smFRET）是另一种能够实现埃至纳米级分辨率的方法。在此方法中，将折叠的RNA分子用绿色供体荧光染料和红色受体荧光染料进行标记。可以从单个单分子中提取荧光强度轨迹，从而获得随时间变化的FRET效率。请务必注意，使用激光可能存在危险，在进行此操作时，应始终采取预防措施，例如佩戴护目镜或降低激光功率。

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使用一个荧光显微镜进行多种成像模式

蛋白质在质膜内或细胞内特定位置的区室化分布是一种重要的调控机制，可显著影响信号转导的结果；因此，要理解信号转导过程，研究相关蛋白质在空间和时间上的动态行为至关重要。本文介绍了一种基于全内反射荧光（TIRF）显微镜的系统，用于研究T细胞中的信号转导，该系统也具有广泛的适用性。...

一种用于实时同步成像T细胞受体及其相关信号蛋白的TIRF显微镜技术

用于双色荧光显微镜的双相机发射分光系统能够生成具有优异光学和时间分辨率的实时图像序列，这是某些活细胞检测（包括平行板流动腔黏附实验）所必需的。当使用软件将同时获取的发射通道图像进行合并时，可生成伪彩图像序列。...

同时利用双相机发射分光系统在两个发射通道中捕获实时图像：在细胞黏附研究中的应用

我们展示了如何利用荧光光激活定位显微技术（FPALM）同时对细胞内多种荧光标记的分子 进行成像。所述技术可在单个细胞内实现数千至数十万个荧光标记蛋白的定位，精密度达到数十纳米 。...

同时多色成像生物结构的荧光光激活定位显微技术

光片荧光显微镜是发育生物学中最有价值的工具。在比较研究中，一个主要问题是环境变异。我们的实验方案描述了一种可同时对多个样本进行活体成像的实验框架，从而主动解决了这一问题。...

基于样品腔的光片荧光显微镜中对多个昆虫胚胎进行同步活体成像

本方案介绍了一组关于肌节、钙离子及宏观几何结构的 来自主动收缩的心室小梁的数据...

离体心脏小梁收缩过程中的明场、荧光与光学相干断层成像同步观察 Ex Vivo

本文介绍了多种多细胞球体的形成方法，用于后续的多参数活细胞显微成像。通过荧光寿命成像显微技术（FLIM）、细胞自发荧光、染色染料和纳米颗粒，展示了对活体三维（3D）肿瘤细胞和干细胞来源的球体中细胞代谢、缺氧状态及细胞死亡进行分析的方法。...

多细胞球体的制备及多参数活细胞荧光寿命成像显微镜（FLIM）分析

利用结合无标记光学成像模式的多模态平台，我们开发了一种用于可视化和定量分析细胞动态与代谢的方案。通过多光子荧光、二次谐波生成和受激拉曼散射显微成像，我们能够获得细胞和分子环境的整体概览。...

用于研究细胞代谢的多模态光学成像平台

将低成本、多功能的光照射技术与手动IBEX方法相结合，可实现对具有显著本底自发荧光的人体组织进行优化成像。本方案详细介绍了如何利用倒置显微镜、广泛可得的试剂以及开源软件，对存档的临床样本获取多重标记的全片图像，并进行图像配准与处理。...

高度自发荧光临床样本的迭代漂白扩展多重成像优化工作流程

本方案详细介绍了无标记自体荧光多谐波（SLAM）显微技术的逐步操作流程，包括激光光源的产生、组织样本的制备、成像过程的实施以及数据的分析方法。SLAM技术通过检测四种互补的无标记对比信号，推动了非线性显微成像技术的发展，可用于研究组织微环境。...

无标记自体荧光多谐波显微成像同步观测

光谱迭代漂白扩展多重性（IBEX）在基础IBEX技术的基础上，增加了肝素阻断以最大限度减少非特异性结合，并利用光谱检测结合计算解混技术来抑制自发荧光。该方法可加快图像采集速度，同时降低背景信号来源，从而实现稳健的多轮、高参数空间蛋白质组分析。...

利用光谱共聚焦显微镜进行高重成像以最小化非特异性组织自发荧光

本方案详细介绍了集成多路阵列探测器的激光扫描共聚焦显微镜系统在高级成像中的应用及其共享资源管理，适用于高分辨率的细胞及亚细胞成像。该工作流程可在同一平台上实现从共聚焦到超分辨率（约120...

超分辨率成像与共享管理：一种用于多通道检测共聚焦显微镜的实验方案

了解如何构建集成式荧光显微镜系统，实现常规落射荧光成像、超分辨率成像和多色单分子检测。该方法通过将三种成像模块整合到一台显微镜中，显著降低设备成本，同时保持高质量成像能力。

使用一台荧光显微镜实现多种成像模式

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