Name: 使用荧光光活化定位显微镜对生物结构进行同步多色成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-09T19:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 51 s
Description: 学习使用荧光光活化定位显微镜技术对固定或活细胞中的多种蛋白质进行纳米级精度的同步多色成像。该方法可精确定位数千个荧光标记蛋白，为研究细胞动态和蛋白相互作用提供高分辨率数据。

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作者谨此感谢 Philip Andresen、Matthew Parent 和 Sean Carter 在计算机编程、技术支持以及有益讨论方面提供的帮助，感谢 Pat Byard 在行政事务上的协助。本工作由美国国立卫生研究院（NIH）职业奖 K25-AI65459、NIH R15 GM094713、美国国家科学基金会（NSF）MRI CHE-0722759、缅因州技术研究所 MTAF 1106 和 2061 以及缅因州经济改善基金资助。

<ol><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+Opt.+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic Opt. reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat. Methods. 3, 793-795 (2006).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Sci%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Sci. 313, 1642-1645 (2006).</li>
<li>Gould, T. J., Verkhusha, V. V., Hess, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+biological+structures+with+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging biological structures with fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Nat. Protoc. 4, 291-308 (2009).</li>
<li>Gould, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+imaging+of+molecular+positions+and+anisotropies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Nanoscale imaging of molecular positions and anisotropies.</a> Nat. Methods. 5, 1027-1030 (2008).</li>
<li>Juette, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+sub-100+nm+resolution+fluorescence+microscopy+of+thick+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples.</a> Nat Meth. 5, 527-529 (2008).</li>
<li>Kanchanawong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+architecture+of+integrin-based+cell+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat%22%5BJournal%5D)">Nanoscale architecture of integrin-based cell adhesions.</a> Nat. 468, 580-584 (2010).</li>
<li>Shtengel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferometric+fluorescent+super-resolution+microscopy+resolves+3D+cellular+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3125-3130 (2009).</li>
<li>Huang, B., Wang, W. Q., Bates, M., Zhuang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+super-resolution+imaging+by+stochastic+Opt.+reconstruction+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic Opt. reconstruction microscopy.</a> Sci. 319, 810-813 (2008).</li>
<li>Hess, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+clustered+distribution+of+hemagglutinin+resolved+at+40+nm+in+living+cell+membranes+discriminates+between+raft+theories%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dynamic clustered distribution of hemagglutinin resolved at 40 nm in living cell membranes discriminates between raft theories.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 17370-17375 (2007).</li>
<li>Manley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+mapping+of+single-molecule+trajectories+with+photoactivated+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy.</a> Nat. Methods. 5, 155-157 (2008).</li>
<li>Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+photoactivated+localization+microscopy+of+nanoscale+adhesion+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics.</a> Nat. Methods. 5, 417-423 (2008).</li>
<li>Sengupta, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+protein+heterogeneity+in+the+plasma+membrane+using+PALM+and+pair+correlation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Probing protein heterogeneity in the plasma membrane using PALM and pair correlation analysis.</a> Nat. Methods. 8, 969-975 (2011).</li>
<li>Shroff, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-color+superresolution+imaging+of+genetically+expressed+probes+within+individual+adhesion+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dual-color superresolution imaging of genetically expressed probes within individual adhesion complexes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 20308-20313 (2007).</li>
<li>Bock, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-color+far-field+fluorescence+nanoscopy+based+on+photoswitchable+emitters%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+B%22%5BJournal%5D)">Two-color far-field fluorescence nanoscopy based on photoswitchable emitters.</a> Appl. Phys. B. 88, 161-165 (2007).</li>
<li>Bossi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+far-field+fluorescence+nanoscopy+through+isolated+detection+of+distinct+molecular+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Multicolor far-field fluorescence nanoscopy through isolated detection of distinct molecular species.</a> Nano Lett. 8, 2463-2468 (2008).</li>
<li>Gunewardene, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superresolution+Imaging+of+Multiple+Fluorescent+Proteins+with+Highly+Overlapping+Emission+Spectra+in+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Superresolution Imaging of Multiple Fluorescent Proteins with Highly Overlapping Emission Spectra in Living Cells.</a> Biophys. J. 101, 1522-1528 (2011).</li>
<li>Wilmes, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triple-Color+Super-Resolution+Imaging+of+Live+Cells%3A+Resolving+Submicroscopic+Receptor+Organization+in+the+Plasma+Membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Triple-Color Super-Resolution Imaging of Live Cells: Resolving Submicroscopic Receptor Organization in the Plasma Membrane.</a> Angewandte Chemie Int. Ed. 51, 4868-4871 (2012).</li>
<li>Gudheti, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+mediates+the+nanoscale+membrane+organization+of+the+clustered+membrane+protein+influenza+hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Actin mediates the nanoscale membrane organization of the clustered membrane protein influenza hemagglutinin.</a> Biophys. J. , (2013).</li>
<li>Tanaka, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+molecules+mobile+even+after+chemical+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Membrane molecules mobile even after chemical fixation.</a> Nat. Methods. 7, 865-866 (2010).</li>
<li>Beisker, W., Dolbeare, F., Gray, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+immunocytochemical+procedure+for+high-sensitivity+detection+of+incorporated+bromodeoxyuridine%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">An improved immunocytochemical procedure for high-sensitivity detection of incorporated bromodeoxyuridine.</a> Cytometry. 8, 235-239 (1987).</li>
<li>Koehler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Method+of+Illumination+for+Photomicrographical+Purposes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Microscopical+Society%22%5BJournal%5D)">New Method of Illumination for Photomicrographical Purposes.</a> Journal of the Royal Microscopical Society. 14, 261-262 Forthcoming.</li>
<li>Self, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focusing+of+Spherical+Gaussian+Beams%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Opt%22%5BJournal%5D)">Focusing of Spherical Gaussian Beams.</a> Appl. Opt. 22, 658-661 (1983).</li>
<li>Annibale, P., Scarselli, M., Greco, M., Radenovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+factors+affecting+co-localization+precision+for+quantitative+multicolor+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Nanoscopy%22%5BJournal%5D)">Identification of the factors affecting co-localization precision for quantitative multicolor localization microscopy.</a> Opt. Nanoscopy. 1, (2012).</li>
<li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nat. Methods. 8, 1027(2011).</li>
<li>Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivatable+fluorescent+proteins+for+diffraction-limited+and+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Photoactivatable fluorescent proteins for diffraction-limited and super-resolution imaging.</a> Trends Cell Biol. 19, 555-565 (2009).</li>
<li>Subach, F. V., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromophore+Transformations+in+Red+Fluorescent+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Chromophore Transformations in Red Fluorescent Proteins.</a> Chem. Rev. 112, 4308-4327 (2012).</li>
<li>Simpson-Holley, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+link+between+the+actin+cytoskeleton+and+lipid+rafts+during+budding+of+filamentous+influenza+virions%5BTitle%5D)+AND+%22Virol%22%5BJournal%5D)">A functional link between the actin cytoskeleton and lipid rafts during budding of filamentous influenza virions.</a> Virol. 301, 212-225 (2002).</li>
<li>Sternberg, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomedical+Image+Processing%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Computer%22%5BJournal%5D)">Biomedical Image Processing.</a> IEEE Computer. , 22-34 (1983).</li>
<li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+nanometer+localization+analysis+for+individual+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes.</a> Biophys. J. 82, 2775-2783 (2002).</li>
<li>Juette, M. F., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Tracking+of+Single+Fluorescent+Particles+with+Submillisecond+Temporal+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Tracking of Single Fluorescent Particles with Submillisecond Temporal Resolution.</a> Nano Lett. 10, 4657-4663 (2010).</li>
<li>Gould, T. J., Hess, S. T. Biophysical Tools for Biologists, Vol 2: In Vivo Techniques. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGould%2C+TJ+%22Methods+Cell+Biol%22">Methods Cell Biol</a>. 89, 329-358 (2008).</li>
<li>Enderlein, J., Toprak, E., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization+effect+on+position+accuracy+of+fluorophore+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Polarization effect on position accuracy of fluorophore localization.</a> Opt Express. 14, 8111-8120 (2006).</li>
<li>Jones, S. A., Shim, S. H., He, J., Zhuang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast%2C+three-dimensional+super-resolution+imaging+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast, three-dimensional super-resolution imaging of live cells.</a> Nat. Methods. 8, 499-U496 (2011).</li>
<li>Mlodzianoski, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+drift+correction+in+3D+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Sample drift correction in 3D fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Opt Express. 19, 15009-15019 (2011).</li>
<li>Kim, D., Curthoys, N. M., Parent, M., Hess, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bleed-through+correction+for+rendering+and+correlation+analysis+in+multi-colour+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Opt%22%5BJournal%5D)">Bleed-through correction for rendering and correlation analysis in multi-colour localization microscopy.</a> J. Opt. , (2013).</li>
</ol>

S.T.H. 和 M.J.M. 拥有超分辨率显微镜领域的专利。S.T.H. 担任 Vutara 公司科学咨询委员会成员。

基于定位的超分辨率成像为生物成像提供了多种强大功能。从将单个光学元件放置于实验台开始，到构建一台能够同时对生物样本中多种荧光物种进行成像的功能性超分辨率显微镜，这一过程面临诸多挑战。在光路调整过程中，某些环节比其他环节更为关键；下文旨在为正在应对这些关键难点的用户提供指导。
关键步骤
FPALM 及类似技术提供的增强图像分辨率需要更加关注显微镜的稳定性。虽然传统显微镜成像通常不会因样品漂移或振荡运动（振动）在约 20-50 nm 尺度上的影响而出现明显畸变，但超分辨率显微镜成像会因此类运动而质量下降。例如，引起非预期运动的来源包括：显微镜和样品内部的温度梯度、安装在气浮台上的设备中的散热风扇、物体意外接触显微镜载物台或气浮台，以及建筑物内部的振动（例如由空气调节设备和其他机械引起的振动）。
为减少这些负面影响，采用减振空气阻尼台可有效抑制或消除局部振动。需要风扇散热或含有其他运动部件的设备应放置在独立的台面上，仅通过（必要的）电线/电缆与另一台面连接。在4 °C下保存的固定样品...

尽管细胞结构存在于多种空间尺度上，但由于衍射极限的物理限制，传统显微镜对小于约250 nm尺度的细胞结构进行荧光成像时受到限制。随着荧光光激活定位显微技术（FPALM1）及类似技术2,3,&#160;的发展，这一限制已被突破，这些技术能够以约10 nm的精确定位大量单分子，从而生成分辨率达数十纳米的图像。FPALM基于光学控制，选择性激活和失活部分分子（有关FPALM的完整描述及该成像系统的实施指南，请参见Gould et al.4）。该技术可绘制出大量单分子的空间分布图，从而揭示从数十纳米到数十微米尺度范围内的生物学结构。基于定位的超分辨率显微技术（本文简称为定位显微技术）现已发展用于解决一系列生物学问题，技术进步使得例如通过偏振FPALM（P-FPALM）成像单分子取向5,&#160;，利用双焦平面FPALM6&#160;或其他方法实现单分子三维荧光成像7-9,&#160;，以及在活细胞中进行单分子超分辨率荧光成像成为可能10-12。&#160;定位显微技术也已应用于固定细胞中多种分子的成像13-16。&#160;最近，已有研究在固定和活细胞中同时实现了三种蛋白质的FPALM成像17。&#160;定位显微技术可对多种标记方式的样品进行成像：例如表达PAFP或PSFP融合标签的蛋白质、用笼锁型有机染料标记的抗体或分子，或常规有机染料标记的样品。虽然使用常规荧光染料可在无需融合蛋白标签的情况下标记蛋白质，但超分辨率成像中使用非笼锁型有机染料通常要求样品浸入还原性缓冲液中2。&#160;此外，抗体-染料偶联物的细胞内递送通常需要对细胞进行固定并通透化处理，或通过电穿孔等手段使活细胞膜通透。还原性缓冲条件和膜通透化的要求限制了有机染料在活细胞成像中的适用性，尽管近期发展已实现了HaloTag与FPALM的有效结合，用于膜结构的成像18。
FPALM 是首个应用于活细胞的定位显微技术10。&#160;在活细胞中，FPALM 除了能够提供标记分子位置随时间变化的空间图谱外，还可以在多个图像帧中追踪单个分子，并在毫秒时间尺度上确定分子的运动轨迹19。&#160;因此，FPALM 能够实现较短时间尺度 和 纳米级分辨率的观测。
多色FPALM可用于多种不同的探针，包括光激活蛋白以及有机笼锁或非笼锁染料。本文详细介绍了同时成像两种荧光蛋白——Dendra2和PAmCherry的实验方案与系统设置。我们报道了在NIH-3T3成纤维细胞中对PAmCherry标记的β-肌动蛋白（PAmCherry-actin）和Dendra2标记的流感病毒血凝素（Dendra2-HA）进行成像的结果。系统设置中所描述的组件可根据其他探针的需求替换为更合适的硬件；若涉及此类替换，文中均已明确说明。
多色FPALM技术非常适合报告活细胞或固定细胞中多种蛋白质的空间分布。该技术特别适用于研究纳米尺度范围内的空间和/或动态关系，尽管成像结果可反映从数十纳米到数十微米范围内不同尺度的定位信息。多色FPALM的一个主要优势在于系统构建成本相对较低，并且在使用多种探针组合时具有很高的灵活性。通过组件自行搭建和校准系统的过程，还能深入理解可能影响数据质量和可解释性的各种因素，从而提升研究结果的可靠性。本文详细描述了利用FPALM技术，结合PSFP和PAFP融合蛋白构建体，对多种蛋白质进行光学系统搭建、样品制备及数据采集的方法。尽管本方案以固定细胞的分析为例，但这些操作流程同样可直接适用于活细胞成像。
此处描述的光学装置非常适合同时对光转换荧光蛋白 Dendra2 和光活化荧光蛋白 PAmCherry 进行成像。许多其他探针也可用于多色成像；然而，所需的具体组件可能因所选探针的激发和发射光谱不同而有所差异。应根据这些因素来选择合适的二向色镜、滤光片和激光波长。

<table><tbody><tr><td>LabTek II 培养小室</td><td>Nunc</td><td></td><td> </td></tr><tr><td>荧光微球</td><td>Invitrogen</td><td>F-8801</td><td>用于校准的微球</td></tr><tr><td>Tetraspeck 微球</td><td>Invitrogen</td><td>T-7279</td><td>四色荧光微球，用于校准</td></tr><tr><td>物镜浸油</td><td>Zeiss</td><td>518F</td><td>高数值孔径物镜用浸油（取决于物镜选择）</td></tr><tr><td>HPLC 级水</td><td>Fisher Scientific</td><td>W5-4</td><td> </td></tr><tr><td>培养基</td><td>ATCC</td><td>30-2003</td><td>或 Cellgro 10-090</td></tr><tr><td>抗生素</td><td>GIBCO</td><td>15070-063</td><td> </td></tr><tr><td>血清</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30087.03</td><td> </td></tr><tr><td>Lipofectamine</td><td>Invitrogen</td><td>52887</td><td> </td></tr><tr><td>OptiMEM I</td><td>GIBCO</td><td>11058-021</td><td> </td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>MPBiomedicals</td><td>1689149</td><td> </td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Fisher Scientific</td><td>AA433689M</td><td>注意：有毒</td></tr></tbody></table>

同时多色成像生物结构的荧光光激活定位显微技术

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

基于定位的超分辨率显微技术可用于获取样品中单个荧光标记的单分子分布的空间图（图像），空间分辨率可达数十纳米。通过使用与目标蛋白融合的光激活（PAFP）或&#160;光可切换（PSFP）荧光蛋白，或与抗体及其他目标分子偶联的有机染料，荧光光激活定位显微技术（FPALM）能够在单个细胞内同时成像多种分子种类。采用以下方法，可在单个细胞中对大量（数千至数十万）单个分子进行成像，并以约10-30 nm的精确定位。所获得的数据可用于理解细胞内多种蛋白类型的纳米级空间分布。该技术的主要优势之一是空间分辨率的显著提高：在传统光学显微镜中，衍射极限将分辨率限制在约200-250 nm，而FPALM可成像比此小一个数量级以上的尺度。由于许多生物学假说涉及不同生物分子之间的空间关系，FPALM的更高分辨率可为细胞结构组织相关问题提供新的见解，而这些问题此前无法通过常规荧光显微技术触及。除了详细描述样品制备和数据采集的方法外，本文还介绍了FPALM的光学装置。对于希望开展超分辨率显微研究的科研人员而言，另一需考虑的因素是成本：自行搭建的系统显著低于大多数商用成像设备的价格。该技术的局限性包括需要优化细胞样品中目标分子的标记效率，以及需要后处理软件来可视化结果。本文描述了使用PAFP和PSFP表达对固定细胞中两种蛋白进行成像的方法。该技术向活细胞成像的拓展也一并进行了说明。

流感病毒血凝素（HA）会形成尺度在数十纳米至微米范围的簇状结构，这些簇与肌动蛋白的共定位情况各异（图5）。这些空间分布特征支持了此前对这两种蛋白进行的大尺度成像结果28，以及HA空间分布对肌动蛋白的依赖性19。多色FPALM图像可进一步用于描述这些簇的密度、面积和周长，以及两种分子在纳米和微米尺度上的共定位程度。所获得图像的分辨率在数十纳米量级1,17；在本处呈现的渲染图像中，图像上的每一个点代表一个单标记蛋白分子的定位，定位精度为20 nm。通过进一步使用透射光源采集整个视场（FOV）的图像（图6），FPALM图像可置于完整细胞及其周围环境的背景下进行观察。
按照上述双色设置记录的图像（另见图1）应与图5所示图像相似。分析的目标是将原始图像时间序列（图3和图4）处理为最终呈现的颗粒位置图像，其中不同颜色代表不同的荧...

我们展示了如何利用荧光光激活定位显微技术（FPALM）同时对细胞内多种荧光标记的分子&#160;进行成像。所述技术可在单个细胞内实现数千至数十万个荧光标记蛋白的定位，精密度达到数十纳米&#160;。

基于定位的超分辨率显微技术可用于获取单个荧光标记分子分布的空间图谱（图像）...

本实验的总体目标是在固定或活细胞中同时以纳米级精度对多种蛋白质进行成像。首先，通过调整相机和光学器件的位置，使显微镜的聚焦图像准确投射到相机芯片上，实现这一目标。第二步是调整激光束，使其直接对准显微镜载物台上的样品。接下来，对制备好的细胞样本进行照明，并选择表达目标蛋白的细胞。最后一步是通过激光照射样本，利用荧光光激活定位显微镜对细胞成像，然后将细胞发出的荧光引导至相机芯片，以获取数据集。最终，荧光光游戏副本定位显微镜可用于在固定或活细胞中，以纳米级空间分辨率显示多种蛋白质在宽场成像条件下或利用全内反射荧光选择样本薄层区域时的定位分布。与现有的共聚焦显微镜或电子显微镜等方法相比，该技术的主要优势在于，能够在固定或活细胞中以纳米级分辨率同时对多种蛋白质进行成像。以下步骤参考了此处所示的编号系统，该编号系统为随附文本方案中图一提供的多色F Om装置示意图。首先，在显微镜载物台上放置校准标尺或标本，使用10倍物镜，并将光源设置为透射光模式，然后将垂直线置于视野中央。接下来，通过闭合视场光阑并从目镜观察垂直方向来调整显微镜的同轴照明。如果视场光阑的边缘失焦，请调节聚光镜的高度，直至视场光阑和红光指示灯均清晰对焦。然后调节视场光阑的横向位置，使其相对于视野居中，并继续关闭视场光阑，直到仅红光指示灯的中心网格被照亮为止。首次组装这些组件时，应调节各通道的光路长度使其相等。为完成此项目，将红光引导至相机芯片，调节第七和第九反射镜，并关闭检测光阑以防止两个通道之间的空间重叠。然后聚焦反射光通道中自由基的图像，并检查其在透射光通道中是否也处于焦点位置。如果透射光通道中的图像未对焦，请平移第九个反射镜，直至两个通道中的自由基图像同时对焦。通过从激光光路中移除第一个透镜并阻断激活光束和读出光束，开始对激光进行准直。然后将一张白卡紧贴第四反射镜放置，打开显微镜快门并调节对焦，直至自由基图像投射到第四反射镜前方的白卡上。接下来，解除读出光束的遮挡，并调节第一面反射镜，使读出激光对准第四面反射镜上自由基图像的十字叉丝中心。对准后，将自由基图像投射到第五面反射镜上，并调节第四面反射镜，直至光束在第五面反射镜图像的十字叉丝中心对准。此时，读出光束应在 M4 和 M5 上均居中。然后通过关闭快门一来阻断读出光束。接着，将激发态图像投射到三号反射镜上。从激光光路中移除扩束镜，并解除对激活激光的阻断。现在调节第二面镜子，使激活光束对准第三面镜子上自由基图像十字线的中心。对准后，在第二和第三面镜子之间重新安装扩束镜，并调节扩束镜的位置，直至光束对准自由基图像十字线的中心。在第三面镜子上，将自由基图像投射到第五面镜子上并进行聚焦。使用显微镜的调焦旋钮，调节第一号二向色镜的角度，直至激活光束位于 redle 图像的中心。然后在无物镜且显微镜快门打开的情况下，关闭快门二以阻断激活激光。打开读出快门（快门一），并将激光通过显微镜的后光圈投射出去。调整第五个反射镜，直到光束从显微镜中射出，确保在物镜和透镜一复位后，光束垂直于显微镜出射。将含有100 µM溴素B的样品置于载物台上，并阻断激活激光。将读出激光通过60倍物镜投射到染料中。关闭电子倍增增益。将此图像发送至相机。接下来，将物镜聚焦到样品中。将光圈开至足够大，以允许对整个光束轮廓进行成像。然后横向移动光圈，使光束轮廓的中心与光圈中心重合。使用相机软件选择感兴趣区域，以获得包含两个通道的最小相机读出区域，并记录这些坐标。此时，记录单幅图像以表示读出光束的光斑轮廓。接下来，通过关闭快门一阻断读出激光，并打开快门二。为开始测量激活光束的光斑轮廓，将激活激光投射到样品上；如有必要，使用小于100的电子倍增增益，并调节第一片二向色镜，直至光束在每个视野中居中。然后记录激活光束轮廓的快照，以开始采集多色fPALM图像。关闭所有室内照明。接着通过翻转支架将汞灯投射到转染的细胞上，并将滤光片立方体更换为包含预光转换状态适当激发波长的滤光片。选定细胞后，将翻转支架下调，使激光能够进入显微镜，并根据随附文本方案中的描述，将滤光片转轮切换至含有适用于成像的二向色镜的滤光片位置。随后将图像投射到相机上，以区分转染细胞与背景荧光，并确认分子可被光激活。使用激活激光以低于10 µW的低功率短暂照射样品。接下来，通过将电子倍增增益设为200，并将所需帧数设为5至10,000之间，来设置相机软件以进行动力学序列采集。同时将曝光时间设为10至30毫秒之间。然后阻断激活光束，解除读出光束的阻断，并将被照射细胞的图像投射到相机上。通过向下调节焦平面，直至细胞底部膜附近的单个分子不再可见，选择一个靠近底部细胞膜的焦平面。然后缓慢向上移动焦平面，直到分子首次可见。此时，解除激活光束的遮挡，以每平方厘米小于一瓦的强度照射样品。通过相机软件开始采集这些数据，同时通过动态调节激发激光器前的中性密度滤光片，使每平方微米内可见的可成像分子密度维持在0.1至1个之间。对于全内反射荧光成像，将镜片五和透镜一安装在同一平移台上，并将其横向移动至显微镜入口后方。当镜片五和透镜一平移时，从物镜经样品向上射出的激光将逐渐向一侧倾斜；继续平移该平移台，直至激光束与垂直方向的夹角达到90度。此时，产生的激光本身将消失，入射激光会被背向反射回孔径中，沿与入射光束反平行的方向传播，并向侧向偏移。当样品完成图像采集并进入全内反射荧光状态时，背景信号应有所降低，此时应立即关闭显微镜快门并阻断两束激光。关闭电子倍增增益。将相机设置为记录单帧图像，并将相机的读出区域设为最大尺寸。最后，通过在显微镜光源上安装长通滤光片，并用卡片遮挡F三或F四通道来阻断其中一个通道。照射样品，并将该图像投射到相机上。记录细胞的透射光图像快照，以代表整个细胞。图中显示的是表达 DENDRA2 血凝素和 PAM Cherry 肌动蛋白的 NIH 3T3 细胞的双色 F palm 采集示例。左侧的透射通道包含比右侧反射通道更长的波长。图中显示的是经过背景扣除和变换以叠加左右两个通道后，同一双色荧光显微成像的快照。可识别并定位单个分子。某些分子在透射通道中显得更亮，而另一些分子在两个通道间的发射分布则更为均匀。这表明 PAM cherry 与 DENDRA2 之间发射光谱的差异，可用于分析以区分这两种分子。此处显示的直方图表示在施加容差后，所有定位分子的红色透射通道强度与总强度的比值。在左下角的图像中，像素显示为白色；在右下角的最终合并图像中，这些像素显示为红色；而在右上角图像中绿色区域内的像素显示为白色，并在右下角的最终合并图像中显示为绿色。在进行图像渲染时，所选择的阈值水平会显著影响噪声程度以及共定位的呈现效果。此处展示了三种不同的渲染选项，其产生的信号串扰程度各不相同，其中最为保守的阈值水平显示在底部两幅图中。当图像中存在两个可区分的峰时，通过彩色F palm alpha直方图进行解读最为适宜。尽管左侧的直方图适合进行进一步分析，但根据此方法，由另外两个直方图得到的图像将更难以解释。可以采用全内反射显微技术、显微成像以及活细胞成像等方法，以回答诸如蛋白质在活细胞膜中的纳米尺度上如何组织等其他科学问题。观看本视频后，您应能够充分理解如何搭建自己的FAR显微镜，并利用它获取数据。请勿忘记，使用激光器可能具有极高的危险性，在尝试此操作程序之前必须完成安全培训。

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用荧光光激活定位显微镜同时对生物结构进行多色成像

本视频介绍了BiFC-PALM技术——即光激活定位显微镜与双分子荧光互补技术的结合，用于检测蛋白质-蛋白质相互作用。双分子荧光互补（BiFC）技术涉及将两种目标相互作用蛋白分别与两个荧光蛋白片段融合。当这两个蛋白发生相互作用时，荧光蛋白片段被拉近至彼此邻近的位置，从而能够结合并重建出具有功能的完整荧光蛋白。通过PALM技术，可在单分子水平上对细胞内单个荧光分子的荧光信号进行精确定位。...

双分子荧光互补偶联光激活定位显微镜技术

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荧光组织移植后用于可视化细胞来源、类型及相互作用的定量多光谱分析

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同时利用双相机发射分光系统在两个发射通道中捕获实时图像：在细胞黏附研究中的应用

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双分子荧光互补结合光激活定位显微技术（BiFC-PALM）

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使用 madSTORM 对 T 细胞进行高度多重化的超分辨率成像

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活体哺乳动物细胞器中单个膜蛋白的多色定位显微成像

本文介绍了一种构建集成显微系统的实用指南，该系统以经济高效的方式将传统的落射荧光成像、基于单分子检测的超分辨率成像以及多色单分子检测（包括单分子荧光共振能量转移成像）整合到一个装置中。...

使用一台荧光显微镜实现多种成像模式

我们介绍一种对冷冻组织进行多光谱成像的快速染色方法。...

一种用于冷冻组织切片多光谱荧光成像的快速方法

我们介绍一种实验方案，可同时实现干涉反射显微镜与全内反射荧光显微镜，用于动态微管及荧光标记的微管相关蛋白的同步成像。...

同时干涉反射与全内反射荧光显微镜技术用于成像动态微管及其相关蛋白

本方案详细介绍了无标记自体荧光多谐波（SLAM）显微技术的逐步操作流程，包括激光光源的产生、组织样本的制备、成像过程的实施以及数据的分析方法。SLAM技术通过检测四种互补的无标记对比信号，推动了非线性显微成像技术的发展，可用于研究组织微环境。...

无标记自体荧光多谐波显微成像同步观测

本方案介绍了一种高效的工作流程，用于对分离的拟南芥细胞核进行单分子定位显微成像，通过优化的分离、固定和标记方法，实现染色质和RNA聚合酶II的可靠纳米级可视化。该方法可轻松扩展应用于其他染色质相关蛋白或组蛋白修饰的高分辨率成像。...

拟南芥细胞核中单分子定位显微镜的简化实验方案

学习使用荧光光活化定位显微镜技术对固定或活细胞中的多种蛋白质进行纳米级精度的同步多色成像。该方法可精确定位数千个荧光标记蛋白，为研究细胞动态和蛋白相互作用提供高分辨率数据。

同时多色成像生物结构的荧光光激活定位显微技术

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