同时多色成像生物结构的荧光光激活定位显微技术

本实验的总体目标是在固定或活细胞中同时以纳米级精度对多种蛋白质进行成像。首先，通过调整相机和光学器件的位置，使显微镜的聚焦图像准确投射到相机芯片上，实现这一目标。第二步是调整激光束，使其直接对准显微镜载物台上的样品。

接下来，对制备好的细胞样本进行照明，并选择表达目标蛋白的细胞。最后一步是通过激光照射样本，利用荧光光激活定位显微镜对细胞成像，然后将细胞发出的荧光引导至相机芯片，以获取数据集。最终，荧光光游戏副本定位显微镜可用于在固定或活细胞中，以纳米级空间分辨率显示多种蛋白质在宽场成像条件下或利用全内反射荧光选择样本薄层区域时的定位分布。

与现有的共聚焦显微镜或电子显微镜等方法相比，该技术的主要优势在于，能够在固定或活细胞中以纳米级分辨率同时对多种蛋白质进行成像。以下步骤参考了此处所示的编号系统，该编号系统为随附文本方案中图一提供的多色F Om装置示意图。首先，在显微镜载物台上放置校准标尺或标本，使用10倍物镜，并将光源设置为透射光模式，然后将垂直线置于视野中央。

接下来，通过闭合视场光阑并从目镜观察垂直方向来调整显微镜的同轴照明。如果视场光阑的边缘失焦，请调节聚光镜的高度，直至视场光阑和红光指示灯均清晰对焦。然后调节视场光阑的横向位置，使其相对于视野居中，并继续关闭视场光阑，直到仅红光指示灯的中心网格被照亮为止。

首次组装这些组件时，应调节各通道的光路长度使其相等。为完成此项目，将红光引导至相机芯片，调节第七和第九反射镜，并关闭检测光阑以防止两个通道之间的空间重叠。然后聚焦反射光通道中自由基的图像，并检查其在透射光通道中是否也处于焦点位置。

如果透射光通道中的图像未对焦，请平移第九个反射镜，直至两个通道中的自由基图像同时对焦。通过从激光光路中移除第一个透镜并阻断激活光束和读出光束，开始对激光进行准直。然后将一张白卡紧贴第四反射镜放置，打开显微镜快门并调节对焦，直至自由基图像投射到第四反射镜前方的白卡上。

接下来，解除读出光束的遮挡，并调节第一面反射镜，使读出激光对准第四面反射镜上自由基图像的十字叉丝中心。对准后，将自由基图像投射到第五面反射镜上，并调节第四面反射镜，直至光束在第五面反射镜图像的十字叉丝中心对准。此时，读出光束应在 M4 和 M5 上均居中。

然后通过关闭快门一来阻断读出光束。接着，将激发态图像投射到三号反射镜上。从激光光路中移除扩束镜，并解除对激活激光的阻断。

现在调节第二面镜子，使激活光束对准第三面镜子上自由基图像十字线的中心。对准后，在第二和第三面镜子之间重新安装扩束镜，并调节扩束镜的位置，直至光束对准自由基图像十字线的中心。在第三面镜子上，将自由基图像投射到第五面镜子上并进行聚焦。

使用显微镜的调焦旋钮，调节第一号二向色镜的角度，直至激活光束位于 redle 图像的中心。然后在无物镜且显微镜快门打开的情况下，关闭快门二以阻断激活激光。打开读出快门（快门一），并将激光通过显微镜的后光圈投射出去。

调整第五个反射镜，直到光束从显微镜中射出，确保在物镜和透镜一复位后，光束垂直于显微镜出射。将含有100 µM溴素B的样品置于载物台上，并阻断激活激光。将读出激光通过60倍物镜投射到染料中。

关闭电子倍增增益。将此图像发送至相机。接下来，将物镜聚焦到样品中。

将光圈开至足够大，以允许对整个光束轮廓进行成像。然后横向移动光圈，使光束轮廓的中心与光圈中心重合。使用相机软件选择感兴趣区域，以获得包含两个通道的最小相机读出区域，并记录这些坐标。

此时，记录单幅图像以表示读出光束的光斑轮廓。接下来，通过关闭快门一阻断读出激光，并打开快门二。为开始测量激活光束的光斑轮廓，将激活激光投射到样品上；如有必要，使用小于100的电子倍增增益，并调节第一片二向色镜，直至光束在每个视野中居中。

然后记录激活光束轮廓的快照，以开始采集多色fPALM图像。关闭所有室内照明。接着通过翻转支架将汞灯投射到转染的细胞上，并将滤光片立方体更换为包含预光转换状态适当激发波长的滤光片。

选定细胞后，将翻转支架下调，使激光能够进入显微镜，并根据随附文本方案中的描述，将滤光片转轮切换至含有适用于成像的二向色镜的滤光片位置。随后将图像投射到相机上，以区分转染细胞与背景荧光，并确认分子可被光激活。使用激活激光以低于10 µW的低功率短暂照射样品。

接下来，通过将电子倍增增益设为200，并将所需帧数设为5至10,000之间，来设置相机软件以进行动力学序列采集。同时将曝光时间设为10至30毫秒之间。然后阻断激活光束，解除读出光束的阻断，并将被照射细胞的图像投射到相机上。

通过向下调节焦平面，直至细胞底部膜附近的单个分子不再可见，选择一个靠近底部细胞膜的焦平面。然后缓慢向上移动焦平面，直到分子首次可见。此时，解除激活光束的遮挡，以每平方厘米小于一瓦的强度照射样品。

通过相机软件开始采集这些数据，同时通过动态调节激发激光器前的中性密度滤光片，使每平方微米内可见的可成像分子密度维持在0.1至1个之间。对于全内反射荧光成像，将镜片五和透镜一安装在同一平移台上，并将其横向移动至显微镜入口后方。当镜片五和透镜一平移时，从物镜经样品向上射出的激光将逐渐向一侧倾斜；继续平移该平移台，直至激光束与垂直方向的夹角达到90度。

此时，产生的激光本身将消失，入射激光会被背向反射回孔径中，沿与入射光束反平行的方向传播，并向侧向偏移。当样品完成图像采集并进入全内反射荧光状态时，背景信号应有所降低，此时应立即关闭显微镜快门并阻断两束激光。关闭电子倍增增益。

将相机设置为记录单帧图像，并将相机的读出区域设为最大尺寸。最后，通过在显微镜光源上安装长通滤光片，并用卡片遮挡F三或F四通道来阻断其中一个通道。照射样品，并将该图像投射到相机上。

记录细胞的透射光图像快照，以代表整个细胞。图中显示的是表达 DENDRA2 血凝素和 PAM Cherry 肌动蛋白的 NIH 3T3 细胞的双色 F palm 采集示例。左侧的透射通道包含比右侧反射通道更长的波长。

图中显示的是经过背景扣除和变换以叠加左右两个通道后，同一双色荧光显微成像的快照。可识别并定位单个分子。某些分子在透射通道中显得更亮，而另一些分子在两个通道间的发射分布则更为均匀。

这表明 PAM cherry 与 DENDRA2 之间发射光谱的差异，可用于分析以区分这两种分子。此处显示的直方图表示在施加容差后，所有定位分子的红色透射通道强度与总强度的比值。在左下角的图像中，像素显示为白色；在右下角的最终合并图像中，这些像素显示为红色；而在右上角图像中绿色区域内的像素显示为白色，并在右下角的最终合并图像中显示为绿色。

在进行图像渲染时，所选择的阈值水平会显著影响噪声程度以及共定位的呈现效果。此处展示了三种不同的渲染选项，其产生的信号串扰程度各不相同，其中最为保守的阈值水平显示在底部两幅图中。当图像中存在两个可区分的峰时，通过彩色F palm alpha直方图进行解读最为适宜。

尽管左侧的直方图适合进行进一步分析，但根据此方法，由另外两个直方图得到的图像将更难以解释。可以采用全内反射显微技术、显微成像以及活细胞成像等方法，以回答诸如蛋白质在活细胞膜中的纳米尺度上如何组织等其他科学问题。观看本视频后，您应能够充分理解如何搭建自己的FAR显微镜，并利用它获取数据。

请勿忘记，使用激光器可能具有极高的危险性，在尝试此操作程序之前必须完成安全培训。