使用荧光光活化定位显微镜对生物结构进行同步多色成像

该程序的总体目标是在固定或活细胞中以纳米级精度同时对多种蛋白质物种进行成像。这是通过首先调整相机和光学元件的位置来实现的，直到显微镜的聚焦图像投射到相机芯片上。第二步是排列激光束，使其直接对准显微镜载物台上的样品。

接下来，照射制备的细胞样品并选择表达所需蛋白质的细胞。最后一步是用荧光光激活定位显微镜对细胞进行成像，方法是用激光照射样品，然后将细胞荧光引导到相机芯片以获得数据集集。最终，荧光光激活定位显微镜用于在固定或活细胞中以及宽场中或在使用全内反射荧光分离样品的薄区域时，在纳米空间尺度上显示多种蛋白质种类的定位。

与共聚焦或电子显微镜等现有方法相比，该技术的主要优点是可以在固定或活细胞中以纳米分辨率同时对多种蛋白质进行成像。以下步骤引用此处所示的编号系统，这是多色 F Om 设置的示意图，在随附的文本协议中如图 1 所示，用于对齐显微镜，首先将校准刻度或自由基放在显微镜载物台上，放置 10 倍物镜和用于透射光的灯组。将垂直线置于视野的中心。

接下来，通过关闭视场孔径并通过垂直方向的目镜观察来调整显微镜的共感照明。如果视场孔径的边缘未聚焦，请调整聚光镜的高度，直到视场孔径和 redle 都清晰对焦。然后调整视场孔径的横向位置，直到它相对于视场居中，然后关闭视场孔径，直到仅照亮 redle 上的中心网格。

首次组装这些组件时，请将每个通道的路径长度调整为相等。为了完成这个项目，摄像头芯片上的雷达调整了镜子 7 和 9 并关闭了检测孔径，以防止两个通道之间的空间重叠。然后将自由基的图像聚焦在反射光通道中，并检查它是否也在透射光通道中聚焦。

如果透射光通道中的图像未聚焦，则平移镜 9，直到根基图像在两个通道中同时聚焦。通过从激光路径中取出透镜 1 并阻挡激活光束和读出光束来开始对准激光器。然后将一张白色卡片与镜子 4 齐平，打开显微镜快门并对焦，直到激进图像投射到镜子 4 前面的卡片上。

接下来，解锁读出光束并调整镜子 1 以将读出激光居中到镜子 4 上根基图像的十字准线上。居中后，将根数图像投影到镜子 5 上并调整镜子 4，直到光束以镜子 5 的图像十字准线为中心。读出光束现在应以 M 4 和 M 5 为中心。

然后通过关闭快门 1 来阻挡读出光束。接下来，将根式图像投影到镜像 3 上。从激光路径上拆下扩束器并解锁激活激光器。

现在调整镜像 2，将激活光束对准镜像 3 上的根基图像的十字准线。居中后，更换镜子 2 和 3 之间的扩束器，并调整扩束器的位置，直到光束以自由基图像的十字准线为中心。在镜子 3 上，将根数图像投影到镜子 5 上并聚焦。

使用显微镜的聚焦旋钮，调整一号二向色镜的角度，直到激活光束以 redle 图像为中心。然后，在没有物镜就位的情况下关闭快门 2 并打开显微镜快门来阻挡激活激光。打开读出快门快门 1 并将激光通过显微镜的后孔投射。

调整反射镜 5，直到光束从显微镜中出来，使光束垂直离开显微镜，透镜 1 和物镜回到原位。将含有 100 微摩尔溴 B 的样品放在载物台上，激活激光被阻挡。将读出的激光通过 60 倍物镜投射到染料中。

禁用电子倍增增益。将此图像发送到相机。接下来，将物镜聚焦到样本中。

将孔径打开足够大，以便对全光束轮廓进行成像。然后横向平移孔径，使光束轮廓和孔径的中心同心。使用相机软件，选择感兴趣的区域以允许封装两个通道的最小相机读出区域并记录这些坐标。

此时，记录单个快照以表示读出的光束轮廓。接下来，通过关闭快门 1 和打开快门 2 来阻挡读出的激光。为了开始测量激活光束轮廓，将激活激光投射到样品上，如有必要，使用小于 100 的电子倍增增益并调整第一个二向色镜，直到光束在每个视场中居中。

然后记录激活光束轮廓的快照，以便开始获取多色 F 手掌图像。消除所有房间照明。然后通过翻转支架将汞灯投射到转染的细胞上，并将滤光片立方体更改为包含预光开关的适当激发波长的立方体。州。

选择细胞后，向下移动翻转支架以使激光进入显微镜，将滤光片转盘更改为包含用于成像的二向色镜的转盘，如随附的文本协议中所述。然后将此图像投影到相机上，以区分转染的细胞和背景荧光，并确认分子是可光的。用激活激光器小于 10 微瓦的低功率短暂照射样品。

接下来，通过将电子乘法游戏设置为 200 并将所需的帧数设置为 5 到 10， 000 之间，为动力学序列采集准备相机软件。此外，将曝光设置为 10 到 30 毫秒之间。然后阻挡激活光束，取消阻挡读出光束，并将被照亮单元的图像投射到相机。

通过向下移动焦点直到不再可见单个分子，选择靠近底部细胞膜的焦平面。然后逐渐向上移动焦点，直到分子首先变得可见。现在解锁激活光束，以每平方厘米不到 1 瓦的强度照亮样品。

开始通过相机软件获取这些数据，同时通过动态调整激活激光器前面的中性密度滤光片，保持每平方微米 0.1 比 1 可见光敏分子的密度。对于全内反射荧光成像，将反射镜 5 和镜头 1 安装到单个平移台上，以便在显微镜入口后面横向移动。当反射镜 5 和镜头 1 被平移时，通过样品从物镜向上离开的激光将逐渐向一侧倾斜，继续平移载物台，直到激光与垂直方向的角度达到 90 度。

此时，出射激光本身将消失，入射激光将被反射到与入射光束平行的孔径中，并移位到侧面。在完成图像采集后，当样品进入全内反射荧光时，您应该会看到背景减少，立即关闭显微镜快门并阻挡两束光束。禁用电子倍增增益。

将相机设置为录制一帧，并将相机读出区域设置为其最大大小。最后，通过将卡放在 F 3 或 F 4 上，并在显微镜灯上安装长通滤光片来阻止一个通道。照亮样品并将此图像投影到相机。

记录单元的快照，以在透射光下表示整个单元。这里显示的是 NIH 三个 T 三个细胞的双色 F 手掌采集示例，该细胞同时表达 DENDRA 2 血凝素和 PAM Cherry 肌动蛋白。左侧的传输通道包含的波长比右侧的反射通道长。

此处显示的是相同的双色 F OM 采集的快照，经过背景、减法和变换以叠加左右声道。可以识别和定位单个分子。一些分子在透射通道中显得更亮，而一些分子在两个通道之间的发射分布更均匀。

这分别表明 PAM cherry 和 DENDRA 两个发射光谱之间的差异，并用于分析以识别这两个物种。此处显示的直方图表示在应用容差后，红色透射通道强度除以所有定位分子的总强度的比率。像素在左下角图像中显示为白色，在右下角显示的最终合并图像中显示为红色，其中绿色区域中的像素在右上图像中显示为白色，在右下角显示的最终合并图像中显示为绿色。

渲染时选择的阈值级别会极大地影响杂色的程度和共定位的外观。显示。以下是三个不同的渲染选项，它们会导致不同程度的出血，通过最保守的阈值级别显示在底部的两个。当图像中有两个可辨别的峰值时，Color F palm alpha 直方图最适合解释。

虽然左侧的直方图非常适合进一步分析，但由其他两个直方图生成的图像将更难解释。按照此过程。可以执行全内反射、显微镜和活细胞成像等方法，以回答其他问题，例如蛋白质如何在活细胞膜的纳米尺度上组织。观看此视频后，您应该对如何设置自己的 FAR 显微镜并使用它来采集数据有很好的了解。

不要忘记，使用激光可能非常危险，在尝试此程序之前应完成安全培训。