Name: 在对飞行性能的准确，快速测定方法的改进果蝇 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-13T13:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: 了解如何使用数字成像技术快速准确地测定果蝇飞行性能的高通量方法。该技术通过测量着陆高度来筛选影响飞行的突变和神经退行性疾病，适用于遗传学与神经科学研究。

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本工作获得了美国国立卫生研究院基金F32 NS078958（DTB）和R01 AG033620（BG）的支持。

1. 组装飞行测试仪
<ol>
	<li>使用链条夹具将飞行圆筒固定在1号铁架台上。（圆筒下方需预留约3 cm空间用于放置称量皿。） 
	（注：我们使用的飞行圆筒长90 cm，直径为13.5 cm。）</li>
	<li>在飞行圆筒下方插入带有薄层矿物油的称量皿。</li>
	<li>使用环形夹具和爪形夹具将漏斗固定在2号铁架台上。调节漏斗高度，使其底部与飞行圆筒顶部齐平。（注：漏斗尖端直径必须小于放入落管中的小瓶外径，以防止小瓶掉落。）</li>
	<li>将落管插入漏斗顶部，并用爪形夹具固定。 
	（注：我们使用的落管长25 cm。从该高度释放含果蝇的小瓶，可使所有果蝇以一致且均匀的力度弹出。落管内径应略大于小瓶外径，以确保小瓶能自由下落。）</li>
	<li>将聚丙烯酰胺板裁剪至合适尺寸。（注：为便于插入和取出，板的宽度应略小于飞行圆筒的内周长。）</li>
	<li>在板上涂抹一层薄薄的Tangle-Trap粘虫剂，使用前静置1小时。（注：板的顶部和底部需留出足够未涂覆区域（约&#160;3 cm），以便抓握并进行插入或取出操作。）</li>
	<li>将聚丙烯酰胺板插入飞行圆筒中。</li>
	<li>使用松木支撑支架组装相机轨道。（注：确保轨道底部能够支撑相机且不遮挡镜头。参见图1B。）</li>
	<li>安装止动器并旋紧固定。（注：止动器的位置应使相机在全景模式下能够完整拍摄到整个塑料板。）</li>
</ol>
2. 运行实验
<ol>
	<li>收集待测果蝇样品管。为获得最佳结果，每管使用不超过 20 只果蝇。</li>
	<li>轻轻敲击样品管，使果蝇沉至管底，拔去管塞，然后将样品管插入落管装置并释放样品管。 
	（注意：样品管沿落管下落，直至接触下方狭窄的漏斗开口。当样品管撞击漏斗时，果蝇被弹射进入飞行筒内。）</li>
	<li>提起落管装置，取出空样品管。 
	（注意：同一聚丙烯酰胺凝胶板上可检测同一实验组的多个样品管。我们发现，单块凝胶板上可轻松检测并成像最多 200 只果蝇（即 10 个样品管，每管 20 只）。）</li>
	<li>取下塑料板，并将其放置在平坦的白色表面上。 
	（注意：若实验台表面颜色较深，可使用白色海报纸作为替代。）</li>
	<li>在塑料板上方组装相机导轨。相机应足够高，以确保视野中同时包含塑料板的顶部和底部。</li>
	<li>沿导轨滑动相机，同时按住 &#34;capture&#34; 按钮，以获取全景图像。</li>
	<li>每次实验重复时，可手动统计落入油区的果蝇数量。</li>
	<li>对某一实验中的所有条件重复步骤 2.2–2.7。每次重复后可将果蝇从塑料板上清除。或者，也可使用多块塑料板，每次重复使用新的塑料板。</li>
</ol>
3. 数据收集
<ol>
	<li>使用 ImageJ 软件打开图像文件。</li>
	<li>如有必要，裁剪图像，仅保留着陆表面区域。（即涂有 Tangle-Trap 的区域）</li>
	<li>将图像转换为 8 位灰度图像。</li>
	<li>创建 &#34;阈值&#34; 以滤除白色背景。 
	（图像 → 调整 → 阈值）</li>
	<li>使用 &#34;分析颗粒&#34; 菜单设置参数，以识别每只果蝇。 
	（分析 → 分析颗粒）定义用于识别颗粒的参数。在我们的实验条件下，采用面积为 5–90 像素2、圆度为 0.4–1.0 的参数可准确识别所有样本。</li>
	<li>利用每个颗粒生成的坐标列表，测量每只果蝇的位置。将像素的 x 坐标转换为厘米，以计算着陆高度。</li>
	<li>将表格导入电子表格软件（如 Microsoft Excel）。</li>
</ol>

<ol><li>Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Am%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of behavior.</a> Sci. Am. 229, 24-37 (1973).</li>
<li>Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+locomotor%2C+learning%2C+and+memory+deficits+in+Drosophila+models+of+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration.</a> J. Vis. Exp. , e2504(2011).</li>
<li>de Vries, S. E., Clandinin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+Stimulation+of+Escape+Behavior+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster.</a> J. Vis. Exp. , e50192(2013).</li>
<li>Mundiyanapurath, S., Certel, S., Kravitz, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+aggression+in+Drosophila+%28fruit+flies%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Studying aggression in Drosophila (fruit flies).</a> J. Vis. Exp. , e155(2007).</li>
<li>Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+assay+Drosophila+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Methods to assay Drosophila behavior.</a> J. Vis. Exp. , e3795(2012).</li>
<li>Shiraiwa, T., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proboscis+extension+response+%28PER%29+assay+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Proboscis extension response (PER) assay in Drosophila.</a> J. Vis. Exp. , e193(2007).</li>
<li>Lloyd, T. E., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flightless+flies%3A+Drosophila+models+of+neuromuscular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1184, e1-e20 (2010).</li>
<li>Atkinson, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+separation+of+two+behavioral+phenotypes+by+a+mutation+affecting+the+promoters+of+a+Ca-activated+K+channel%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular separation of two behavioral phenotypes by a mutation affecting the promoters of a Ca-activated K channel.</a> J. Neurosci. 20, 2988-2993 (2000).</li>
<li>Atkinson, N. S., Robertson, G. A., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+component+of+calcium-activated+potassium+channels+encoded+by+the+Drosophila+slo+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A component of calcium-activated potassium channels encoded by the Drosophila slo locus.</a> Science. 253, 551-555 (1991).</li>
<li>Elkins, T., Ganetzky, B., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+mutation+that+eliminates+a+calcium-dependent+potassium+current%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A Drosophila mutation that eliminates a calcium-dependent potassium current.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 8415-8419 (1986).</li>
<li>Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+iterative+negative+geotaxis+%28RING%29%3A+a+new+method+for+assessing+age-related+locomotor+decline+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila.</a> Exp. Gerontol. 40, 386-395 (2005).</li>
<li>Fry, S. N., Rohrseitz, N., Straw, A. D., Dickinson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+control+of+flight+speed+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Visual control of flight speed in Drosophila melanogaster.</a> J. Exp. Biol. 212, 1120-1130 (2009).</li>
<li>Mronz, M., Lehmann, F. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+free-flight+response+of+Drosophila+to+motion+of+the+visual+environment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">The free-flight response of Drosophila to motion of the visual environment.</a> J. Exp. Biol. 211, 2026-2045 (2008).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

利用此处所述方法，我们能够快速评估大量黑腹果蝇（Drosophila）突变体的飞行能力，效率显著高于以往。在实验中，我们通常将雄性和雌性分开，并以低密度（每管少于20只果蝇）培养，以减少可能造成翅膀损伤的攻击行为。另一个重要考虑因素是需适当控制因遗传背景差异而导致的飞行能力差异。我们还发现，在飞行测试前，让果蝇至少经过24小时&#160;的恢复期以从二氧化碳麻醉中恢复，有助于提高实验准确性。 alternatively，可通过低温（4 °C）暴露对果蝇进行麻醉，从而实现更快恢复，且不会对行为产生潜在影响。
本方案中的限速步骤是在两次试验之间将果蝇从塑料片上移除。提高效率的一种方法是同时使用大量塑料片，在使用后将其放置一旁，并在数据采集结束后统一清洗。掉到底部的果蝇需要手动计数，因为它们不会附着在塑料片上。尽管如此，这种方法仍比手动计算着陆高度更为简便。是否需要重新在每张塑料片上涂抹Tangle-Trap取决于涂层的厚度。根据我们的经验，单张塑料片在需要重新涂覆前可维持一个月。
与矿物油相比，使用Tangle-...

Drosophila 长期以来被用于研究行为的遗传基础1，研究人员已设计出多种方法来分析不同类型的行为2-6。果蝇在提供神经肌肉疾病的有效模型方面尤其具有价值7。用于研究运动行为的一种常见检测方法是飞行能力检测。原始的飞行检测装置可用于鉴定飞行缺陷型突变体并对飞行能力进行定量评估1，但它存在若干局限性，限制了其在高通量筛选中的应用：使用涂油的圆筒操作繁琐且不整洁；某些设计特征，例如圆筒长度以及将果蝇以不一致的力度引入管中，会降低定量准确性；此外，从检测装置中回收活体果蝇也较为困难。为了克服这些局限性，我们对飞行检测装置进行了多项改进。我们增加了一个&#34;下落管&#34;来引入果蝇，以消除不同实验之间及操作者之间的变异。我们采用可拆卸的丙烯酸板，并在其表面涂覆粘性材料，以便更方便地清洁并单独回收果蝇。我们延长了飞行管的长度，以提高定量的准确性和可靠性。最后，我们使用数码相机和成像软件来计算果蝇的着落高度。我们认为，这些改进将对任何希望开展大规模遗传筛选以研究飞行能力缺陷的实验室具有重要帮助。

<table><tbody><tr><td>刮刀</td><td>Home Depot</td><td>630147</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.homedepot.com">www.homedepot.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>松木背板条（2个）</td><td>Home Depot</td><td>156469</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.homedepot.com">www.homedepot.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>衬条板</td><td>Home Depot</td><td>164704</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.homedepot.com">www.homedepot.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>缠绕式昆虫捕获涂层</td><td>BioControl Network</td><td>268941</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.biconet.com">www.biconet.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>笔记本电脑&amp;nbsp;</td><td>Apple</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.apple.com/mac/">www.apple.com/mac/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>矿物油</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP26291</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.fishersci.com">www.fishersci.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>白色海报纸板</td><td>Staples</td><td>247403</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.staples.com">www.staples.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>聚苯乙烯称量皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>S67091A</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.fishersci.com">www.fishersci.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>ImageJ 软件</td><td>美国国立卫生研究院</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info.nih.gov/ij/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>数码相机</td><td>Sony</td><td>DSC-TX7</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.store.sony.com">www.store.sony.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>精细镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.finescience.com">www.finescience.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>聚碳酸酯圆筒（落管）</td><td>McMaster-Carr</td><td>8585K62</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.mcmaster.com">www.mcmaster.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>飞行圆筒（丙烯酸材质）</td><td>McMaster-Carr</td><td>8486K943</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.mcmaster.com">www.mcmaster.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>聚碳酸酯板材</td><td>McMaster-Carr</td><td>85585K25</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.mcmaster.com">www.mcmaster.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>铁架台（2个）</td><td>Fisher Scientific</td><td>S47808</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.fishersci.com">www.fishersci.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>环形支架</td><td>Fisher Scientific</td><td>S47791</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.fishersci.com">www.fishersci.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>三爪万能夹（2个）</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-769-7Q</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.fishersci.com">www.fishersci.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>漏斗</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-500-3</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.fishersci.com">www.fishersci.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>链条夹（2个）</td><td>VWR</td><td>21573-275</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.vwr.com">www.vwr.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>玻璃小瓶</td><td>VWR</td><td>66020-198</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.vwr.com/">www.vwr.com&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

一种改进的准确快速测量飞行性能的方法 果蝇

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Drosophila 已被证明是研究行为（包括飞行行为）的有用模式系统。最初的飞行测试方法是将果蝇投入涂油的带刻度圆柱管中；通过测量果蝇下落多高后产生足够推力并接触到管壁，来评估其飞行能力。本文描述了一种经过改进的飞行测试装置，具有四项主要改进。第一，我们增加了一个&#34;下落管&#34;，以确保在不同实验中所有果蝇以相似的速度进入飞行圆柱管，从而消除操作者之间的差异。第二，我们用可拆卸的塑料片替代了油涂层，塑料片表面涂有Tangle-Trap胶——一种专为捕捉活体昆虫设计的粘性物质。第三，我们采用更长的圆柱管，以更精确地区分果蝇的飞行能力。第四，我们使用数码相机和图像分析软件，实现飞行表现评分的自动化。这些改进使得果蝇飞行行为能够被快速、定量地评估，适用于大规模数据集和大规模遗传筛选研究。

图1A展示了更新后的飞行测试仪组件的示意图。图1B展示了轨道设计，可使相机在不遮挡视野的情况下拍摄全景图像。代表性结果见图2，其中将已知存在飞行缺陷的slowpoke突变果蝇与野生型Canton-S果蝇的飞行表现进行了比较8-10。对照组果蝇 consistently 落在圆柱体顶部附近，个体间分布非常集中，平均着陆高度为73±2.0 cm。相比之下，slowpoke果蝇的着陆分布范围更广，且着陆位置显著更低，平均为44±4.1 cm。所有果蝇均为3日龄，于室温（23 °C）条件下培养。
<img alt="飞行测试仪和相机轨道示意图；用于抛射体轨迹分析的设备。" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51223/51223fig1highres.jpg" src="/fi...

在此，我们介绍一种快速且准确测量飞行性能的方法 果蝇，实现高通量筛选。

果蝇已被证明是研究行为（包括飞行）的有用模型系统。最初的飞行测试方法涉及将果蝇投入一个……

本实验的总体目标是快速、准确地测量果蝇的飞行能力。首先将果蝇投入飞行圆筒中，以实现这一目标。实验的第二步是使用数码相机对降落表面进行成像。最后一步是使用成像软件通过测量每只果蝇的着陆高度来分析数据。该方法最终有助于鉴定影响飞行能力的突变及衰老或神经退行性变等条件，并可对飞行表现进行量化。与传统的飞行测试仪等现有方法相比，该技术的主要优势在于更适用于对影响飞行能力的突变体及其他条件进行高通量筛选。我们最初想到这种方法，是因为意识到使用原始飞行测试仪检测大量基因型时需要耗费大量时间。使用链条夹将飞行圆筒固定在铁架台上。在圆筒下方预留约三厘米的空间用于放置接虫皿。在培养皿中加入一层薄薄的矿物油，并将其滑入飞行圆筒下方。将漏斗固定在第二个铁架台上。调节漏斗的高度，使漏斗底部与飞行圆筒的顶端齐平。漏斗最窄的部分必须比果蝇小瓶更窄。滴管的直径应略大于果蝇小瓶，以便小瓶能够自由下落。将滴管插入漏斗顶部，并使用爪形夹固定。接下来，从聚丙烯酰胺板上裁下一小块矩形片段，其长度与飞行筒长度相同，宽度略小于飞行筒的内周长。在该片段表面涂上一层薄薄的Tangle-Trap粘合剂，上下两端留出足够未涂覆区域以便手持。待片段上的粘合剂干燥一小时后，将片段粘合面朝内滑入飞行筒中。接下来，使用松木支撑架组装相机滑轨。确保滑轨底部能够支撑相机，且不会遮挡镜头。然后将止动器拧紧固定在不会遮挡相机对塑料板视野的位置。收集待测果蝇，每瓶不超过20只。轻轻敲击将果蝇震至瓶底。打开瓶塞，将瓶子插入落管中。松开小瓶。当小瓶撞击逐渐收窄的漏斗壁时，果蝇会被弹射进入飞行筒中。提起落管以移除空的小瓶，如有需要可继续装入更多果蝇。最多可将来自10个试剂瓶的200只果蝇置于一张聚丙烯酰胺胶片上，进行快速检测与成像。现在，取下塑料片并将其放置在平坦的白色表面上；若实验台面颜色较深，可使用白色海报纸作为替代。将相机轨道组装在塑料片上方。相机应足够高，以确保视野中同时包含纸张的顶部和底部。在握住拍摄按钮的同时沿轨道滑动相机，以获取全景图像。可人工统计飞行室下方培养皿油中降落的果蝇数量。每次试验之间，可将果蝇从粘板上移除，粘板可重复使用。在 ImageJ 软件中打开图像文件，如有需要，裁剪图像以仅包含着陆表面区域。该区域涂有缠绕陷阱。将图像转换为8位灰度图像并创建阈值，以滤除白色背景。设置参数以识别每只果蝇。使用“分析颗粒”菜单定义参数。用于通过演示装置识别颗粒。设置面积为5至90平方像素，圆度为0.4至1.0，可准确识别所有样品。现在，使用为每个颗粒生成的坐标列表来测量每只果蝇的位置。像素表示的 X 坐标可转换为厘米。为计算着陆高度，将表格导入电子表格并进行后续分析。将已知存在飞行缺陷的slow poke突变体果蝇与野生型canton s果蝇的飞行能力进行比较。所有果蝇均为在室温下培养的三日龄果蝇。对照组果蝇 consistently 落在圆柱体的顶部附近，而slow poke突变体果蝇的着陆分布范围要大得多。在73厘米高度处，野生型果蝇的平均着陆高度显著高于在44厘米处的慢行突变体。通过该实验流程，可进一步采用组织学等其他方法，探究飞行肌、运动神经元或神经肌肉接头结构完整性的相关问题。观看本视频后，您应能够充分了解如何快速评估果蝇的飞行能力。

an-improved-method-for-accurate-rapid-measurement-flight-performance

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科研

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Biology

生物学

在对飞行性能的准确，快速测定方法的改进<em&gt;果蝇</em

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