Name: 颈脊髓损伤的小鼠模型研究后皮损呼吸神经可塑性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: 了解颈脊髓损伤小鼠模型的建立方法，用于研究呼吸神经可塑性与修复策略。该模型通过手术诱导损伤，结合组织学技术和神经肌肉记录评估损伤程度与恢复机制。

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本工作由欧盟第七框架计划（FP7/2007-2013）资助，资助协议编号为246556（欧洲项目RBUCE-UP），以及由法国公共投资委员会拨付的HandiMedEx项目资助。&#160;Marcel Bonay获得了巴黎大学中心（Chancellerie des Universités de Paris）（Poix遗赠基金）、呼吸健康研究捐赠基金（Fonds de Dotation Recherche en Santé Respiratoire）以及法兰西岛居家呼吸援助中心（Centre d’Assistance Respiratoire à Domicile d’Île de France，CARDIF）的支持。

本方案已获得RBUCE-UP卓越讲席（巴黎南大学，资助协议编号：246556）伦理委员会和凡尔赛圣康坦-伊夫林大学的批准。
1. 灭菌外科手术器械的准备
<ol>
	<li>用实验室洗涤剂清洁手术器械。</li>
	<li>手术前对器械进行高压灭菌。</li>
	<li>在一次手术过程中，两次手术之间将器械尖端置于热珠灭菌器中，在 180 °C 下加热 10 分钟以实现工具灭菌。</li>
</ol>
2. 药物制备
<ol>
	<li>准备2支1 ml注射器，分别用于麻醉前药物混合液和术后药物。</li>
	<li>根据大鼠体重，配制麻醉前药物注射液：卡洛芬（5 mg/kg）、丁丙诺啡（50 μg/kg）、拜菌素（5 mg/kg）和右美托咪定（0.5 mg/kg），用乳酸林格液补足至1 ml。</li>
	<li>另用一支注射器准备麻醉前药物的逆转剂：阿替美唑（500 μg/kg）。</li>
</ol>
3. 大鼠的麻醉
<ol>
	<li>按照步骤2.2中所述，将预麻醉药物溶液皮下注射给予动物。然后将动物放回笼中，等待镇静效果出现。</li>
	<li>将大鼠置于密闭麻醉舱内，吸入5%异氟烷（溶于100% O2），等待其呼吸节律减慢（约30秒）。随后将大鼠从麻醉舱中取出，放置于气管插管操作台上。</li>
</ol>
4. 经口插管术
<ol>
	<li>将动物仰卧位放置，然后用绑带固定其头部，绑带应固定在动物的门齿上并连接至手术台。</li>
	<li>使用光纤光源照亮胸腔区域。随后将喉镜（或自制喉镜，详见 Jou&#160;et al.20）插入动物口腔，观察声带。</li>
	<li>将经口气管导引管沿声带之间滑入气管，然后沿导引管插入经口气管插管（16 G 导管规格）。</li>
	<li>撤出导引管，并在经口气管插管末端放置喉镜，观察是否有水汽凝集，以确认插管位于气管内而非食管内。</li>
	<li>将插管连接至啮齿类动物呼吸机（683 型啮齿类呼吸机，Harvard Apparatus），并将异氟烷浓度调节至 2%（在 100% O2 中）。</li>
	<li>使用手术胶带固定经口气管插管。</li>
</ol>
5. 脊柱手术
<ol>
	<li>将动物置于加热的手术板上，呈仰卧位，鼻部与术者成90°角。整个手术过程中维持体温在约37.5 °C。</li>
	<li>使用电推剪剃除肩胛骨之间的毛发，并用纱布清除毛发。</li>
	<li>先用聚维酮碘清洁皮肤，再用70%酒精擦拭。重复此步骤3次。&#160;</li>
	<li>手术开始前进行足趾夹捏测试，以确认麻醉深度合适。&#160;然后，用剪刀在肩胛骨之间沿头尾方向做一侧皮肤切口。</li>
	<li>沿肌腱方向头尾向切开肩胛棘上肌，以防止出血。随后分离菱形肌，以暴露脊肌（围绕椎骨的肌肉）。</li>
	<li>从C1至C3椎骨处将脊肌牵开。C2椎骨具有明显的突起。</li>
	<li>使用无菌棉签清理椎骨背侧周围的肌肉组织。</li>
	<li>使用咬骨钳小心开始去除C2椎骨的突起，然后仔细操作直至暴露背侧脊髓。确保椎板切除为背侧半椎板切除术。操作时需特别注意包裹脊髓的硬脊膜以及该区域附近的血管。</li>
	<li>使用#55镊子沿C2节段头尾方向分离硬脊膜，随后继续向头侧和尾侧两侧横向分离。</li>
	<li>吸除脑脊液。</li>
	<li>使用显微剪刀在颈段第二背根下方做一侧切口。使用显微刀片确认损伤范围足够接近脊髓中线（见图2A中的损伤背侧视图）。若未达到，可再进行一次切割以完成损伤。如发生出血，使用无菌棉签处理。注意避免损伤对侧，否则动物将无法从损伤中恢复，并可能发生呼吸衰竭。</li>
	<li>缝合肌肉作为保护层，再缝合皮肤。使用浸透聚维酮碘的无菌纱布清洁伤口。</li>
	<li>关闭异氟烷蒸发器，注射拮抗药物（阿替美唑 [500 μg/kg, 肌内注射]），并检查体温。</li>
	<li>当动物开始对抗呼吸机自主呼吸时，将气管导管与呼吸机断开，然后拔除经口插管的气管导管。将动物放入加热的笼子中进行恢复。</li>
</ol>
6. 术后护理
手术后，持续监测动物，以确保为其恢复提供最佳环境。每12小时给予抗生素（Baytril，5 mg/kg）、抗炎药（Carprofen，5 mg/kg）和布托啡诺（Buprenorphine，50 μg/kg）&#160;术后前两天给予抗生素以预防感染，并减少术后疼痛的发生。大鼠可自由摄取软质食物和水（术后第一天可提供凝胶状水）。术后最初几天可皮下注射液体以防止脱水。每日监测体重及食物摄入量。在整个实验期间及损伤后阶段，动物饲养环境均保持丰富化（双只共笼饲养，笼内放置管道）。

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

构建 C2 损伤模型的技术难点
C2 损伤小鼠模型是研究呼吸性损伤后神经可塑性的有用工具。然而，构建可重复且可靠的模型所需的操作步骤繁多，每一步都可能影响研究结果。例如，在插管过程中必须格外小心，因为经口插管可能引发气管炎症，进而导致阻塞性呼吸衰竭等并发症，加重由损伤本身引起的初始呼吸功能不全。此外，手术过程中对脊髓的暴露方式可能直接影响动物的术后恢复。所有操作步骤（包括肌肉解剖与牵拉、背侧椎板切除、硬膜切开及损伤操作本身）都必须极为谨慎，因为手术区域周围及脊髓内部存在多条重要动脉。必须避免大出血，否则术中失血不仅会阻碍术后恢复，还可能在原有损伤基础上引发脊髓缺血。
另一个需要注意的重要方面是手术器械以及手术操作所在房间的清洁程度。尽管在手术过程中已向动物注射了抗生素药物，并且采取了严格的“准无菌”条件，但仍可能发生细菌感染，从而影响基于该模型开展的整个研究计划。例如，由脂多糖注射诱导的全身性炎症会消除呼吸神经可塑性22，并可能干扰和/或掩盖后续的自发性神经可塑性或潜在修...

脊髓损伤是一种在人群中常见的创伤，可能导致严重的后果，例如永久性瘫痪。然而，损伤的严重程度取决于初始创伤的部位和范围。呼吸衰竭是上颈段脊髓损伤（SCI）后导致死亡的主要原因1。目前唯一的治疗方法是为患者提供通气支持。由于仅有少数患者能够在损伤后经过一段延迟期出现自发性恢复，从而脱离通气支持2，因此迫切需要开发新的、创新的非侵入性治疗手段3。建立一个良好的标准化临床前模型，用于研究颈段脊髓损伤对呼吸功能不全的影响，并进一步评估潜在治疗策略的应用效果，具有重要意义。
在本技术文章中，我们描述了一种由C2水平部分颈段脊髓损伤（SCI）诱导的呼吸功能障碍的特定临床前小鼠模型。目前全球多个实验室正在使用该模型（综述见：4-13）。然而，不同研究者在建立这一特定颈段损伤小鼠模型时，手术操作存在细微差异。C2脊髓损伤对呼吸输出的影响最早于1895年由Porter描述14。颈段半切损伤会导致同侧膈神经运动神经元与其位于脑干rVRG的中枢驱动（图1A）发生传入性去神经支配，从而引起同侧膈神经活动静止及随后的膈肌麻痹。对侧通路保持完整，使动物得以存活。与位于较低脊髓节段的其他脊髓损伤（例如C4水平的挫伤性损伤15）不同，该模型双侧膈神经运动神经元核团的完整性均得以保留。在C2颈段损伤后，由于C3-C6节段水平跨越脊髓中线的对侧沉默突触通路被激活（交叉膈神经通路，CPP，图1B），可在同侧（膈神经和膈肌）观察到一定程度的自发活动。CPP的激活——按定义是指在C2半切损伤基础上再行对侧膈神经切断术，从而诱导同侧膈神经部分功能恢复——可在损伤后数小时至数周内发生16-18。然而，该CPP通路对呼吸功能恢复的实际益处有限19，仍需进一步研究并开发新的治疗策略，以增强自发性功能恢复的程度3。
本方案提供了一种强大的临床前小鼠模型，可用于研究C2节段部分性颈段脊髓损伤后不同层面的呼吸系统损伤后可塑性（例如，从膈神经运动神经元、中间神经元到分子与细胞水平的呼吸生理学，以及前肢运动功能），同时也可作为评估旨在改善呼吸与运动功能恢复的侵入性和非侵入性治疗策略的模型。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;动物&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>雄性Sprague Dawley大鼠</td><td>Janvier</td><td></td><td>225–250 g</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;手术器械&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>学生用Dumont #5镊子</td><td>Fine Science Tool</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>学生用标准型镊子</td><td>Fine Science Tool</td><td>91100-12</td><td></td></tr><tr><td>Mayo-Stille弯剪</td><td>Fine Science Tool</td><td>14013-15</td><td>弯头</td></tr><tr><td>学生用Vannas弹簧剪</td><td>Fine Science Tool</td><td>91500-09</td><td>直头</td></tr><tr><td>弹簧剪 - 8 mm刀片</td><td>Fine Science Tool</td><td>15025-10</td><td>直头钝/钝</td></tr><tr><td>Friedman Pearson咬骨钳</td><td>Fine Science Tool</td><td>16121-14</td><td>弯头</td></tr><tr><td>解剖刀 - 细尖</td><td>Fine Science Tool</td><td>10055-12</td><td>直头</td></tr><tr><td>Olsen-Hegar持针器</td><td>Fine Science Tool</td><td>12002-14</td><td>带齿</td></tr><tr><td>Weitlaner-Locktite牵开器</td><td>Fine Science Tool</td><td>17012-11</td><td>2×3 钝头</td></tr><tr><td>可吸收外科缝线</td><td>Centravet</td><td>BYO001</td><td>缝线规格 4-0</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>热珠灭菌器</td><td>Fine Science Tool</td><td>18000-45</td><td></td></tr><tr><td>导管&amp;nbsp;</td><td>Centravet</td><td>CAT188</td><td>16 G</td></tr><tr><td>喉镜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>导丝</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>喉镜镜片</td><td>Centravet</td><td>MIR011</td><td></td></tr><tr><td>乳酸林格液</td><td>Centravet</td><td>RIN020</td><td></td></tr><tr><td>注射器</td><td>Centravet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>针头</td><td>Centravet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Air Liquid</td><td>I1001M20R2A001</td><td></td></tr><tr><td>683 RodentT呼吸机 115/230V</td><td>Harvard Apparatus</td><td>55-0000</td><td></td></tr><tr><td>独立式挥发罐</td><td>WPI</td><td>EZ-155</td><td></td></tr><tr><td>细线加热垫</td><td>WPI</td><td>EZ-211</td><td></td></tr><tr><td>空气罐</td><td>WPI</td><td>EZ-258</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;药物&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>卡洛芬</td><td>Centravet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rimadyl</td><td>Centravet</td><td>RIM011</td><td></td></tr><tr><td>布托啡诺</td><td>Centravet</td><td>BUP001</td><td></td></tr><tr><td>拜有利</td><td>Centravet</td><td>BAY001</td><td></td></tr><tr><td>右美托咪定</td><td>Centravet</td><td>DEX010</td><td></td></tr><tr><td>阿替美唑</td><td>Centravet</td><td>ANT201</td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘溶液</td><td>Centravet</td><td>VET002</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Centravet</td><td>VET066</td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于研究损伤后呼吸神经可塑性的颈椎脊髓损伤小鼠模型

A Murine Model of Cervical Spinal Cord Injury to Study Post-lesional Respiratory Neuroplasticity

颈段脊髓损伤可导致永久性瘫痪，并常引发呼吸功能障碍。迄今为止，尚未开发出有效治疗手段以改善高位颈段脊髓损伤（SCI）后出现的呼吸衰竭。本文提出一种小鼠高位颈段脊髓损伤的临床前模型，损伤部位位于颈椎第2节段（C2），用于研究多种损伤后呼吸相关神经可塑性变化。该技术通过在C2水平实施手术部分损伤，造成膈肌偏瘫，原因是支配膈肌的膈运动神经元与脑干呼吸中枢之间的传入连接被切断。损伤对侧保持完整，使动物能够恢复部分功能。与其他影响运动功能的脊髓损伤（如胸段或腰段损伤）不同，呼吸功能不依赖动物主观动机，其功能缺损与恢复的量化评估较为简便（如膈肌和膈神经记录、整体通气功能检测）。这种C2脊髓损伤的临床前模型是一种强大、实用且可靠的工具，可用于在不同层次（从分子到生理水平）研究多种呼吸与非呼吸相关的神经可塑性现象，并可用于测试多种潜在治疗策略，以期改善脊髓损伤患者的呼吸功能。

损伤程度
该特定实验模型的成功性与可重复性取决于操作者/外科医生的经验。C2 损伤后呼吸功能恢复的程度（膈神经活性和膈肌活性）与残留的腹外侧 spared 白质相关21。由于该损伤为“手工”制备，需要外科医生经过一定训练，因此每次损伤的范围必须通过组织学技术（4% 多聚甲醛固定组织、冷冻切片、焦油紫染色）进行检测，以确定受损组织的精确大小（图 2B）。
电生理记录
C2脊髓损伤（SCI）后，同侧膈神经活动消失（图3A，方法见Vinit et al.17）。对侧膈神经活动不受损伤影响，可维持动物存活（图3B）。损伤后7天，部分动物同侧可记录到微弱的神经活动，主要源于对侧交叉至同侧中线的颈脊神经前支（CPP）（图3A</strong...

呼吸衰竭是颈段脊髓损伤后死亡的首要原因。建立一种由部分颈段损伤诱导呼吸衰竭的可重复、可量化且可靠的临床前动物模型，将有助于理解继发的呼吸与非呼吸相关的神经可塑性，并可用于验证潜在的修复策略。

脊髓颈段损伤可导致永久性瘫痪，并常引发呼吸困难。迄今为止，尚未开发出有效的治疗方法……

本实验的总体目标是建立一种可量化、可靠且可重复的临床前动物模型，用于研究由颈段脊髓损伤引起的呼吸功能不全及非呼吸功能障碍。首先需准备实验所需器械和药物；第二步为对动物实施麻醉，随后进行气管插管并将其连接至啮齿类动物呼吸机。接下来，暴露脊髓并诱导颈段脊髓损伤。缝合动物后，撤除麻醉并提供适当的术后护理。最终，采用组织学技术以及神经和肌肉记录来评估颈段损伤的程度及其影响。与现有方法（如面板撞击致挫伤）相比，该技术的主要优势在于损伤更小且边界清晰。演示该操作的将是我实验室的一名工程师。手术准备期间，需清洗并高压灭菌手术器械。另准备一支2×1毫升注射器，加入预先配制的麻醉前用药，并用乳酸林格液补足至1毫升。在另一支注射器中，准备好麻醉前用药的逆转剂。皮下注射麻醉前用药溶液后，将动物放回笼中，等待约20分钟，直至镇静效果显现。然后将大鼠放入一个密闭的舱室中，舱室内充满5%的异氟烷和100%的氧气，等待约30秒，直至其呼吸节律减慢。随后将大鼠从舱室中取出，并仰卧置于插管台上。接着，用一条带子固定其头部，将门齿绑在台面上以固定头部。使用光纤光源照亮胸腔空间。然后将喉镜插入动物口腔以观察声带。接着将气管导引器从声带之间滑入气管，再沿导引器插入经口-气管导管。然后移除导引器，在口-气管导管末端放置喉镜，检查是否有湿气，以确认导管已置于气管内。随后，将导管连接至呼吸机，并将氟烷浓度调整至2%。接着使用手术胶带将口-气管导管固定在动物的吻部。进行手术时，将动物翻转，使其仰卧于加热的手术板上，鼻部朝向与术者呈90度角。手术过程中维持体温在37.5摄氏度左右。使用电推剪剃除肩胛骨之间的毛发后，用纱布清除毛发，并清洁皮肤，先用聚维酮碘，再用70%酒精。接下来，使用剪刀做一个4到5厘米长的侧向皮肤切口。在肩胛骨之间进行分离。切开斜方肌的肩峰部，并沿肌腱进行分离，以防止出血。然后分离菱形肌以暴露脊柱周围的脊肌，找到脊肌上可见的隆起部位，该隆起即为第2颈椎棘突的标志。利用该解剖标志，从第一颈椎（C1）至第三颈椎（C3）椎骨处切开棘肌。接着，使用无菌棉签清理椎骨背侧周围的肌肉组织。使用Ron Jour器械，小心去除第二颈椎（C2）的棘突。然后仔细继续进行椎板切除术，注意避免损伤硬膜和任何动脉。完成背侧半椎板切除术后，暴露背侧脊髓。用55号镊子夹住硬膜。使用显微剪刀沿颈椎第二节横向解剖硬脑膜。然后分别向头侧和尾侧的外侧继续分离。根据需要吸除脑脊液，以进行脊髓损伤操作。首先，确定第二颈段背根，该背根将是第一个可见的神经根。使用显微剪在第二颈段背根的侧方进行横切。根据需要，使用无菌棉签清除任何血液。使用显微解剖刀确认损伤范围已足够接近脊髓中线。然后使用显微解剖刀再进行一次切割，以完成损伤。确保损伤范围从背侧至腹侧，并从外侧延伸至中线。HEMI 手术步骤完成后，缝合肌肉和皮肤，并用浸有碘伏的无菌纱布清洁伤口。关闭异氟烷蒸发器后，肌肉注射拮抗药物，并检测体温。当动物开始对抗呼吸机自主呼吸时，将气管插管与呼吸机断开并拔除插管。手术后，将动物置于加热的笼子中以供恢复。术后前两天，每12小时给予一次抗生素、抗炎药和止痛药，并皮下注射液体以防止脱水。术后最初几天，术后第一天允许大鼠自由摄取凝胶化水，之后几天提供软食和饮水，并监测其体重和食物摄入量。颈段C2损伤后脊髓的横切面可实现对损伤的重建。灰色阴影显示了脊髓损伤前损伤的范围。在C2节段部分损伤后，动物两侧的膈神经活动相似。损伤后7天，同侧的膈神经活动消失，但对侧的膈神经活动保持完整。由于交叉膈神经通路的存在，同侧膈神经活动出现部分恢复。C2节段部分性损伤消除了同侧膈肌的活动性。损伤后7天可见轻微活动，主要归因于交叉膈神经通路的活动。在同侧记录到的信号节律性偏转是由于心电图的伪影所致。请注意，在C2水平损伤后，对侧膈肌的活动与损伤前保持相同，使动物在损伤后仍能存活。该技术为呼吸生理学领域的研究人员探索促进损伤后恢复的新型治疗手段奠定了基础。

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医学

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