用于定量分析内皮细胞增殖、屏障功能及迁移活性的细胞电阻传感技术

以下实验的总体目标是利用电细胞基质阻抗传感技术（即EIS）来表征细胞行为。该方法通过在电极阵列上培养细胞，并以不同模式进行测量，以定量分析内皮屏障的形成、成熟及其功能。随后可进行电损伤及添加刺激物等操作，以检测细胞迁移能力与屏障功能。根据EIS结果，可获得关于细胞黏附、增殖、迁移、内皮通透性检测以及细胞-细胞和细胞-基质相互作用的详细信息。

该方法有助于回答细胞生物学领域的一些关键问题，例如在标准细胞培养条件下，对处于自然汇合状态的细胞进行在线定量数据生成和表征。通常，初学者在使用该方法时会遇到困难，因为其背后的理论看似复杂，且在开始实验前需要了解若干基本注意事项。首先，必须对电极阵列进行清洁和稳定化处理，以防止电极漂移，提高实验重复性，并增强信号强度比率。

因此，在室温下15分钟后，向八孔阵列的每个孔中加入200微升10毫摩尔的EL溶液。用两次超纯水洗涤去除EL胱氨酸，避免使用磷酸盐缓冲液。此外，在包被前切勿将电极暴露于含血清的溶液中，因为这可能干扰蛋白质的吸附。接下来，向每个孔中加入200微升预热的1%明胶溶液，并将阵列在37摄氏度下孵育半小时。

为了去除明胶，使用超纯水操作，并确保电极表面不干燥。然后向孔中加入 400 微升完全培养基，此时培养基中可含有血清。将芯片装入支架中。

检查九个金色方块，它们应与POGO针脚接触。用手小心固定阵列位置，然后在计算机上拧紧调节螺丝。

打开测量软件。按下设置，然后在“采集数据”部分进行检查，以在默认频率 4,000 赫兹下对每个孔进行快速阻抗测量。测量值将存储在注释部分中。

请确保在阵列示意图的“孔配置”部分，准确选择了正在使用的EIS阵列类型。红色和绿色指示连接的功能状态。如果清洗和编码成功，八个W一个E系统阵列的电容值应约为五到六纳法，八个W 10 E阵列也应如此。

因此，细胞接种前50至60纳法的基线电阻约为2000欧姆。要使用RB alpha和cm对数据进行建模，需在培养基失效阵列上开始MFT记录。采集15分钟无细胞数据后，完成实验以加入细胞。

现在移除阵列，并将400微升单细胞悬液接种到每个孔中。为研究细胞生长，起始接种密度为每平方厘米10,000个细胞；若希望起始时细胞接近汇合状态，则接种密度为每平方厘米60,000个细胞。将阵列装入支架后，在“孔板配置”部分选择需要检测的孔。

然后进入数据采集选项，选择在固定频率下进行时间序列测量的模式，选择 SFT，并选择测量频率以测定电极覆盖率以及建模 RB 和 alpha；选择 MFT 后，设备将自动在所有可用频率下进行测量。应尽可能在多频率模式下运行测量，因为这需要所有可用频率的数据，从而提供最全面的分析信息。

进行微运动分析时，选择RTC并调整采样频率。标准时间分辨率为1赫兹，但可提高采样频率以追踪阻抗的快速变化。z轴和theta轴的采样频率可提高至25赫兹。

为了从多个孔中连续测量微运动，请选择帮助菜单，然后选择显示专家工具栏菜单项，并进行多孔实时监测。在数据采集部分，务必以小时为单位指定时间限制。

使用此设置时，软件将在开始数据采集后提示输入循环次数。使用 SFT 或 MFT 收集数据时，请选择以秒为单位指定的测量时间间隔。如需最大数据采集量，请不要选中此选项。

现在按“开始”并指定数据的存储位置。通过按“结束”来停止运行。按“暂停”可停止数据采集，但实验时钟将继续运行。

现在移除阵列，并在超净工作台中操作各孔。将阵列放回支架后，单击“检查连接”以验证电连接，然后单击“继续实验”以继续采集数据。如果操作后细胞无需保持无菌状态，则可在数据采集期间直接向孔中加入刺激物（如凝血酶）。

此类引入的变化可通过按下标记按钮并添加注释在实验时钟上进行标记。另一种方法是通过电刺激对细胞进行划痕。该方法的设置需要适当调整，以获得较短的划痕时间，但作用时间不宜过长，否则可能损坏电极。

首先使用软件提供的默认设置，然后在此基础上进行操作。转到“伤口电泳设置”部分并启用伤口功能。接着在孔板配置下选择需要划伤的孔。

仅选中的孔将进行划痕处理。点击“激活”会弹出窗口，提示进行划痕操作。划痕后，请检查信号是否下降至接近无细胞电极的水平。

如果无需重复进行损伤操作即可使用数据，请使用导出数据选项并选择导出至 Excel。然而，RB 和 alpha 建模可在软件内部完成。请注意，根据 MFT 数据，建模仅在汇合的细胞层中有效。

不要忘记添加无细胞参照。首先，在频率扫描建模与分析部分的查找功能下自动选择一个无细胞参照，然后点击“设置”以确认该值。

接下来按下模型以开始计算。如果耗时几分钟，请不必担心。在典型的实验过程中，细胞会从生长期进入平台期。

当细胞达到汇合时，可直接从电极获取此过程中的图像。下一阶段是内皮细胞屏障的形成与成熟。随后利用电场损伤研究细胞迁移。

信号特征性地下降至基线水平，随后重新建立汇合状态。最后，实时追踪细胞对刺激的反应。在此，施加了血管活性试剂凝血酶。

这导致细胞收缩，从而在屏障中短暂形成微小间隙，引起阻抗电阻下降，而电容测量则在最敏感的检测条件下提供了有关细胞黏附和生长阻力的补充信息。频率反映了细胞屏障的质量和功能，并考虑了对细胞旁路和跨细胞电流流动的阻力。当细胞附着在电极上时，会限制电流通过，电容随之成比例下降。

该阶段可提供电极覆盖情况的整体测量结果，最好在记录高于40千赫兹频率下的电容时进行量化。电阻值能够清晰反映细胞阻断电流能力的强弱，从而体现细胞屏障的质量。因此，不同代次和不同类型的细胞具有不同的电阻值。

我们的 RB 和 alpha 参数有助于区分细胞间黏附与细胞-基质黏附。RB 表示细胞间接触对电流流动的电阻性，或可视为通透性的倒数测量指标。alpha 用于衡量细胞-电极连接处对阻抗的贡献。

RB值和alpha值均可在ISIS软件中进行计算。电阻信号中的微小波动可能由汇合细胞层的细微运动或微运动引起。这些波动可通过一个E阵列在最敏感的频率下进行测量，并利用电化学阻抗谱（EIS）软件中的快速傅里叶变换进行分析，从而精确地揭示细胞行为的相关信息。

例如，可以制造一个250微米的电损伤伤口，该伤口将在数小时内闭合，从而用于研究细胞迁移。阻抗谱技术也非常适合分析添加物质的影响。如前所述，凝血酶通过降低基础细胞张力使细胞屏障通透性升高；而使用ROCK激酶抑制剂，则可减弱凝血酶的作用。在进行该实验操作时，必须注意：阻抗谱技术对细胞环境的变化极为敏感，例如温度、pH值、培养基耗竭等因素均可能产生显著影响。

该技术开发完成后，为 ology 领域的研究人员提供了实时研究血管活性物质对汇合细胞培养物作用趋势和效应的途径。