Name: 一个实时的基于电阻抗技术测量癌细胞入侵内皮细胞单层 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: 学习使用实时电阻抗技术监测癌细胞穿透人脐静脉内皮细胞单层的侵袭过程。该方法可量化细胞相互作用，为研究肿瘤转移机制提供动态数据支持。

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本工作得到了巴尔的摩儿童癌症基金会（马里兰州巴尔的摩）、布兰登·卡林顿·李基金会（马里兰州银泉市）、美国国防部（W81XWH-10-1-0137）和美国国立卫生研究院（R01CA108641）的资金支持。
我们感谢 Anton Wellstein 博士及其实验室成员分享他们的经验，并帮助我们优化了本文所述的方法。

1. 准备
<ol>
	<li>所有步骤均须在组织培养罩内无菌条件下进行。</li>
 <li>xCELLigence 仪器应置于含 5% CO2 的 37°C 培养箱中。</li>
 <li>使用低代次 HUVEC 细胞，建议代次不超过第 6 代。同时，确保收获细胞时融合度不超过 75%。</li>
 <li>HUVEC 细胞在添加了 EGM-2 完全套装（Lonza Biosciences）的 EGM-2 培养基中培养，该套装包含生长因子、补充剂和 5% 胎牛血清。</li>
 <li>通过在 200×g 条件下离心细胞悬液，用 PBS 洗涤一次，并重悬至指定细胞密度，以彻底去除胰酶残留。</li>
 <li>用 0.1% 明胶在 37°C 孵育 1 小时或 4°C 过夜，对 xCELLigence E-16 板进行包被。用 PBS 洗涤后，加入 100 μL 重悬的 EGM-2 培养基。在 xCELLigence 系统上进行空白读数，以测定无细胞时的背景阻抗值。</li>
 
</ol>
2. 生成 HUVEC 单层细胞

<ol>
	<li>通过胰酶消化收获亚融合状态的 HUVEC 细胞。将细胞重悬于重构的 EGM-2 培养基中，调整终浓度为 2.5 x 105 个细胞/ml。</li>
 <li>向含有 100μL EGM-2 培养基的背景校准 E-板的每孔中，加入 100μL HUVEC 细胞悬液（含 2.5 x 104 个 HUVEC 细胞）。</li>
 <li>立即将 E-板安装至 xCELLigence 仪器中。</li>
 <li>设置 xCELLigence 软件以每 10 分钟进行一次阻抗读数。</li>
 <li>培养内皮细胞 18–21 小时，直至其形成单层，表现为细胞指数趋于平缓 （图 2）。</li>
</ol>

3. 添加侵袭细胞及数据归一化。
<ol>
	<li>当稳定的 HUVEC 单层形成后，通过胰酶消化法收集肿瘤细胞，并将其重悬于用于培养肿瘤细胞的培养基（如含 10% FBS 的 RPMI 或 DMEM 培养基）中，最终密度为 1 × 105 个细胞/mL。</li>
 <li>暂停 xCELLigence 软件中的阻抗读数，并将 E-Plate 从仪器中取出。</li>
 <li>通过抽吸去除 EGM-2 培养基。加入含有 1 × 104 个细胞的 100 μL 肿瘤细胞悬液。通常，接种的肿瘤细胞与内皮细胞的比例为 1:2.5 时，该实验效果最佳。然而，该比例可根据不同细胞系进行优化。</li>
 <li>将 E-Plate 放回培养箱中的 xCELLigence 系统上，并以每 10 分钟一次的频率继续进行阻抗检测。</li>
 <li>在接下来的 6–12 小时内可实时监测侵袭过程，表现为细胞指数下降，这是由于内皮细胞连接回缩以及侵袭性肿瘤细胞穿透所致。</li>
 <li>将结果归一化至肿瘤细胞加入的时间点。xCELLigence 软件允许对任意时间点进行归一化处理，结果可直接在软件窗口中查看。</li>
</ol>
4. 代表性结果：
图3展示了转移性和非转移性细胞侵袭HUVEC单层的示例。K7M2是一种具有转移性的骨肉瘤细胞系，该细胞系表达高水平的细胞骨架连接蛋白ezrin，这解释了该细胞系的侵袭特性13,14。当用K7M2细胞攻击HUVEC细胞时，6小时内电阻力显著下降，这种电阻力的降低反映了肿瘤细胞对HUVEC单层的侵袭能力。相比之下，K12细胞系表达的ezrin水平显著较低，因此其转移能力较弱13。用K12细胞攻击HUVEC单层时，电阻下降较为平缓，因为这些细胞难以黏附或侵袭穿过HUVEC单层（图3）。

<img src="/files/ftp_upload/2792/2792fig1.jpg" alt="HUVEC单层侵袭实验：使用xCELLigence RTCA系统分析肿瘤细胞的示意图。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 肿瘤细胞侵袭内皮细胞工作流程示意图。将HUVEC细胞接种于明胶包被的E-板中，使其形成融合的单层。待单层形成后加入恶性细胞，并通过细胞指数的变化实时监测肿瘤细胞对内皮单层的侵袭过程。

<img src="/files/ftp_upload/2792/2792fig2.jpg" alt="HUVEC单层形成图表；细胞指数与时间关系，细胞生长模式分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2. HUVEC单层形成。HUVEC细胞黏附并铺展在明胶包被的金电极上时，细胞指数的变化。18小时后细胞指数趋于稳定，表明已形成融合单层。 

<img src="/files/ftp_upload/2792/2792fig3.jpg" alt="侵袭动力学图；K7M2、K12在HUVEC细胞中的表现；细胞指数与时间关系，比较性数据分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. K7M2和K12骨肉瘤细胞对HUVEC细胞的侵袭。当高转移性的K7M2细胞加入后数小时内，细胞指数即出现急剧下降。相比之下，K12细胞的转移能力较弱，无法像K7M2细胞那样有效穿透内皮单层。当用K12细胞攻击HUVEC单层时，细胞指数下降较为平缓，反映了其较低的侵袭能力。对照组表示在无癌细胞条件下HUVEC单层的阻抗值。实验重复三次进行。

<ol><li>Klein, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer.+The+metastasis+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cancer. The metastasis cascade.</a> Science. 321, 1785-1787 (2008).</li>
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<li>Boyd, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell-microelectronic+sensing+technique+for+profiling+cytotoxicity+of+chemicals%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">A cell-microelectronic sensing technique for profiling cytotoxicity of chemicals.</a> Anal Chim Acta. 615, 80-87 (2008).</li>
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<li>Ren, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+actin-cytoskeleton+linker+protein+ezrin+is+regulated+during+osteosarcoma+metastasis+by+PKC%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The actin-cytoskeleton linker protein ezrin is regulated during osteosarcoma metastasis by PKC.</a> Oncogene. 28, 792-802 (2009).</li>
</ol>

本手稿的出版费用由罗氏应用科学慷慨提供。

实时HUVEC侵袭实验是一种简单而强大的侵袭监测方法。该方法能够实时提供结果，相较于依赖终点分析的其他传统技术具有显著优势。该实验可进行修改，用于检测药物、抗体、配体和蛋白质对转移的抑制或促进作用。同时也可以评估不同试剂对内皮细胞/癌细胞相互作用的影响。当在培养基中引入外源性试剂（如生长因子和药物）时，重要的是确保这些试剂不会影响HUVEC单层的完整性。可通过在无侵袭细胞存在的情况下加入外源性试剂，并观察细胞指数是否发生变化，来检测HUVEC单层是否受到破坏。因此，实验设计中应包含适当的对照组。
不同的细胞系在形成汇合单层时表现出不同的细胞指数曲线。曲线的形状以及达到的最大细胞指数具有细胞类型特异性。人脐静脉内皮细胞（HUVEC）在接种后4-6小时表现出细胞指数特征性的短暂平坦期，随后在16-18小时后细胞指数再次稳定升高。因此，在加入肿瘤细胞之前，必须让细胞至少培养18小时以形成完全汇合的单层。
由于细胞指数依赖于电极/细胞界面处的离子环境，除细胞覆盖培养孔底部的面积外，细胞形态和细胞间黏附质量等各种因素也会影响细胞指数。因此，肿瘤细胞侵袭时发生的细胞指数下降是多种因素共同作用的结果，其中包括内皮细胞连接的回缩以及随后的肿瘤细胞侵袭。
xCELLigence 仪器有三种不同的配置：实时细胞分析仪（RTCA）SP、RTCA MP 和 RTCA DP。RTCA SP 仪器可容纳一个 96 孔 E-板，而 RTCA MP 仪器可同时容纳最多六个 96 孔 E-板，适用于高通量药物和化合物筛选。本文所述实验采用 RTCA DP 仪器，该仪器可容纳三个 16 孔 E-板。每个 E-板放置位点均可独立操作，允许多位用户同时开展实验。RTCA DP 仪器还可使用 CIM-板研究细胞迁移。CIM-板为 16 孔板，其上下室由聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）膜分隔，膜的平均孔径为 8 µm。电子传感器位于上室多孔膜的底面。下室用作化学趋化因子的储存区，以吸引上室中的细胞。然而，与 CIM-板相比，HUVEC 侵袭实验的一个主要优势在于，前者的肿瘤细胞侵袭不受孔径大小的限制，因为内皮细胞的侵袭依赖于肿瘤细胞与内皮细胞之间的相互作用。
人脐静脉内皮细胞（HUVEC）侵袭实验也可在由 Applied Biophysics（美国纽约州特洛伊）生产的 ECIS Z 仪器上进行。ECIS Z 仪器采用的技术与 xCELLigence 仪器类似，但在阵列和电极构型方面存在差异。我们已成功使用 8 孔 ECIS 阵列完成 HUVEC 侵袭实验。需要注意的是，ECIS 阵列的孔底表面积较大，因此需要接种更多的内皮细胞和肿瘤细胞，分别为 2.5 × 105 和 1 × 105 个细胞。

<table><tbody><tr><td>xCELLigence RTCA DP 仪器</td><td><a href="http://www.aceabio.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Roche Group</a></td><td>05469759001</td><td></td></tr><tr><td>RTCA 控制单元</td><td><a href="http://www.aceabio.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Roche Group</a></td><td>05454417001</td><td>预装 RTCA 软件的笔记本电脑</td></tr><tr><td>E-Plate 16</td><td><a href="http://www.aceabio.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Roche Group</a></td><td>05469830001</td><td></td></tr><tr><td>HUVEC 细胞</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-2517</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 培养基</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-3156</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 子弹头试剂盒</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-4176</td><td></td></tr><tr><td>0.1% 明胶溶于无菌 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>EMD Millipore</td><td>MCPROTO045</td><td></td></tr></tbody></table>

一种基于实时电阻抗技术测定癌细胞侵袭内皮细胞单层的方法

A Real-time Electrical Impedance Based Technique to Measure Invasion of Endothelial Cell Monolayer by Cancer Cells

恶性细胞的转移扩散需要降解基底膜、肿瘤细胞黏附于血管内皮、内皮细胞连接回缩，最终肿瘤细胞穿过内皮层侵袭并迁移进入血液，以此作为运输途径到达宿主体内的远端部位1-3进入循环系统后，癌细胞会黏附于毛细血管壁，并迁移至周围组织形成转移性肿瘤4,5肿瘤细胞与内皮细胞相互作用的各个组分可通过将癌细胞与人脐静脉内皮细胞（HUVEC）单层共培养在体外进行模拟。电子显微镜和相差显微镜研究结果表明，该体外事件序列较为真实地再现了 体内 转移过程6在此，我们描述一种基于电学阻抗的技术，可实时监测并量化恶性肿瘤细胞对内皮细胞的侵袭。
Giaever 和 Keese 首次描述了一种技术，用于测量细胞群体在电极表面生长时阻抗的变化7,8。由 Roche 公司生产的 xCELLigence 仪器采用类似技术，通过覆盖在培养皿底部约 80% 面积的金微电极阵列，检测细胞贴附和铺展过程中电学阻抗的变化9-12。当细胞在电极表面贴附并铺展时，会导致电学阻抗增加。该阻抗以一个无量纲参数——细胞指数（cell-index）表示，其数值与细胞覆盖的组织培养孔底面积成正比。因此，细胞指数可用于监测细胞黏附、铺展、形态及细胞密度。
本文所述的侵袭实验基于恶性细胞群体穿过HUVEC单层时，电极/细胞界面处电学阻抗的变化（图1）。内皮细胞连接的破坏、内皮单层的回缩以及肿瘤细胞的取代会导致阻抗发生显著变化。这些变化与肿瘤细胞的侵袭能力直接相关，即高侵袭性细胞引起的细胞阻抗变化较大，反之亦然。该技术相较于现有的侵袭检测方法（如Boyden小室和Matrigel实验）具有双重优势：1）内皮细胞与肿瘤细胞的相互作用更接近于 体内 过程，且2）数据可实时获取，更易于量化，而其他方法则为终点分析。

本文描述了一种 体外 一种用于实时监测癌细胞侵袭内皮细胞单层的技术。数据通过检测培养孔底部电极表面阻抗变化而实时获取。

恶性细胞的转移扩散需要降解基底膜、肿瘤细胞与血管内皮的黏附、内皮回缩……

本视频演示了一种利用基于实时电学阻抗的技术，监测癌细胞侵袭内皮细胞单层的方法。首先，将人脐静脉内皮细胞（称为VE）接种于16孔EPL板中，该板孔底涂有金电极。为形成融合的单层，加入癌细胞，这些细胞会附着于VE细胞并侵入HVAC单层，破坏内皮细胞间的连接。随后采集阻抗读数，该读数取决于细胞覆盖的孔底总面积。随后可根据电阻抗的变化来确定侵袭程度。与现有方法（如小室法和METROGEL分析）相比，该技术的主要优势在于内皮细胞与肿瘤细胞之间的相互作用更接近体内转移过程，且数据可实时获取，相较于其他方法的终点分析更易于量化。尽管该方法可为癌细胞侵袭提供深入见解。它还可应用于其他系统，例如研究免疫系统中的细胞间相互作用。此外，实验的初始阶段，即我们观察UX细胞生长的过程，可用于评估任何细胞系的细胞增殖，无需进一步的侵袭步骤，从而证明该方法的普适性。Rahim博士，我实验室的研究生，将演示该实验流程。本实验方案的所有步骤均须在无菌条件下于组织培养生物安全柜中进行。本实验所用的Xcel系统需永久放置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中，该培养箱在首次使用时即专用于此仪器。仪器应在培养箱中至少静置16小时，以平衡至新的温度和湿度环境。接下来，在37摄氏度条件下，用0.1%明胶对Thence EPL 16进行包被处理，持续1小时。包被完成后，用 PBS 洗涤一次。然后加入 100 微升重悬的 e gm two 培养基，以进行空白读数，用于测量无细胞条件下的背景阻抗。将EPL放入计算机上的Excel代理系统中。通过点击桌面上的RTCA软件图标，在软件窗口中打开Excel代理软件。点击布局选项卡，并选择含有样品的孔。设置实时数据采集的频率。单击“计划”选项卡，然后单击“添加步骤”图标，其中“扫描次数”表示读数的次数，“时间间隔”表示读数之间的时间间隔。这两项参数默认分别设置为1和1.00分钟。该程序将设置系统执行背景读数。点击“添加步骤”，在扫描次数框中输入300，在时间间隔框中输入10分钟。这将使仪器持续进行阻抗测量，最长可达50小时。开始实验时，点击“启动步骤”图标。在完成背景测量后，将测量每个孔的背景阻抗。窗口会显示消息。准备进入下一步，请点击。接下来开始下一步操作。此时可加入细胞，并可按照所述方法监测单层细胞的形成。在下一节中，所用的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）在添加了含有生长因子补充剂和5% FBS的EGM-2 BulletKit的EGM-2培养基中进行培养。细胞应维持在37°C、含5%二氧化碳的培养箱中。实验当天，在显微镜下检查HUVECs的汇合度，细胞应为低代次，最好不超过第六代，且汇合度低于75%，以形成均匀的单层。用胰酶消化法收集细胞。待细胞从培养瓶表面脱离后，通过200 × g离心去除所有残留的胰酶。离心后，用PBS洗涤细胞一次。然后重悬细胞，并用eGM-2培养基重悬至浓度为每毫升2.5×10⁵个细胞。细胞重悬后，从EXOGEN系统中取出已完成背景校准的EPL，将100微升HX细胞悬液加入到平板中已有的100微升eGM-2培养基中。立即将EPL放入Excel系统细胞分析仪中。通过点击软件窗口中的“开始”按钮开始获取阻抗读数。让内皮细胞继续生长，系统将每10分钟自动采集一次阻抗读数。细胞接种后4至6小时，细胞指数会表现出特征性的短暂降低，随后在16至18小时后再次趋于稳定。因此，必须让细胞培养至少18小时，以形成融合的单层细胞。一旦单层细胞形成，即可加入侵袭性细胞，为侵袭实验做好准备。制备侵袭性肿瘤细胞。此处使用骨肉瘤细胞。首先用胰蛋白酶消化收集细胞。通过以200 G离心细胞并用PPS洗涤一次，去除胰蛋白酶的所有残留。洗涤后，将细胞重悬于用于培养肿瘤细胞的培养基中（如含10% FBS的RPMI或DMEA培养基），调整最终细胞密度为每毫升1×10⁵个细胞。在软件窗口中单击暂停步骤图标，暂停实验。去除EPL，并用真空泵吸去血管内皮细胞单层上的EGM-2培养基。加入含有1 × 10⁴个细胞的100微升肿瘤细胞悬液。通常，肿瘤细胞与内皮细胞的数量比为1:2.5时，该检测效果最佳。然而，该比例可根据不同细胞系进行优化。将EPL放回培养箱中的Excel试剂系统内。单击继续步骤，以每10分钟为间隔继续采集阻抗读数。在接下来的6至12小时内实时监测侵袭过程。当内皮细胞连接回缩并被侵袭性肿瘤细胞穿透时，细胞指数将下降。实验结束后，使用Exergen软件将结果归一化至侵袭性肿瘤细胞加入的时间点。Exergen 软件允许将任何时间点的数据进行归一化处理，VEX 细胞在此系统中培养的情况如本视频所示，在单层细胞形成后，加入 K7M2 细胞或 K12 细胞。如图所示，加入 K7M2 细胞数小时后，细胞指数急剧下降。K7M2 是一种高度转移性的骨肉瘤细胞系。这些细胞高表达细胞骨架连接蛋白ene，这解释了该细胞系的侵袭特性。另一方面，K 12细胞的转移能力较弱，穿透内皮单层的效率也不如K seven M two细胞。这表现为细胞指数下降幅度较小，如此处所示。此处所示的对照代表葡萄膜单层的阻抗。在没有癌细胞的情况下，实验重复进行了三次。观看本视频后，您应充分了解如何通过生成内皮细胞单层并用癌细胞挑战该单层，实现实时监测细胞侵袭过程。通过阻抗法评估细胞增殖时，可利用涉及 HU XL 单层形成的实验初始步骤。二。

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一个实时的基于电阻抗技术测量癌细胞入侵内皮细胞单层

本视频介绍了一种基于电阻抗的三室阵列侵袭实验。该技术用于测量在肿瘤微环境中常驻基质细胞所分泌的可溶性因子影响下，癌细胞的侵袭潜能。...

基于三室阵列的阻抗检测法：通过测量电学阻抗实时分析癌细胞侵袭潜能的技术

来源：Mudduluru, G.，等. 基于阻抗的癌细胞迁移与侵袭实时检测方法。J. Vis. Exp.

基于阻抗的脑癌细胞侵袭性测量

本方案综述了电细胞基底阻抗传感技术，该方法用于记录和分析贴壁细胞的阻抗谱，以定量检测细胞黏附、增殖、运动性以及细胞对药理和毒性刺激的反应。重点强调内皮细胞通透性的检测以及细胞间和细胞-基底相互作用的评估。...

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癌症因其能够转移至不同器官而成为一种致命疾病。确定癌细胞在各种治疗条件下的迁移和侵袭能力，对于评估治疗策略至关重要。本方案介绍了一种用于评估胶质母细胞瘤细胞系实时转移能力的方法。...

基于阻抗的癌细胞迁移与侵袭实时检测

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共培养物中侵袭性细胞亚群的实时检测与捕获

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用于测量TGF-β诱导侵袭的球体侵袭实验

学习使用实时电阻抗技术监测癌细胞穿透人脐静脉内皮细胞单层的侵袭过程。该方法可量化细胞相互作用，为研究肿瘤转移机制提供动态数据支持。

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