إعداد بسيط ضوء مجهر ورقة ل

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصوير تطور C Allergan باستخدام مجهر الورقة الضوئية الفلوري. ويتم تحقيق ذلك أولاً من خلال إعداد المجهر القائم على الورقة الضوئية، والذي يتكون من مجهر رأسي ومجموعة صغيرة من العناصر البصرية الميكانيكية لتوليد الورقة الضوئية. وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في تثبيت الجنين.

تتمثل الخطوات الأخيرة في ضبط ورقة الضوء على الجنين وتسجيل مراحل نموه. ويمكن أن تُظهر النتائج ديناميكيات البروتينات الموسومة فلوروسنتياً خلال نمو *C. elegans* عبر تحليل مقاطع الفيديو ثلاثية الأبعاد والفيديوهات ذات الفاصل الزمني. وتتمثل المزايا الرئيسية لمجهر ورقة الضوء مقارنة بالطرق الحالية الأخرى، مثل المجهر البؤري، في أنه يسمح بتصوير أسرع مع سمية ضوئية أقل.

ثالثاً، يمكن لهذه الطريقة أن توفر رؤية متعمقة حول تطور الختم. كما يمكن تطبيقها على أنظمة أخرى مثل الرؤي أو أسماك الزبرا. وسيكون عرض الإجراء واضحاً.

شيلز، مهندس من مختبري، وبولين ليناك، مهندسة من مختبر فان. يصف هذا القسم عملية تجميع التجهيزات، ويمكن تركها مجمعة لجميع التجارب. بمجرد وضع الليزرات والمراشحات والتلسكوب والميريسكوب على الطاولة البصرية، قم بتثبيت العدسة الأسطوانية لتوليد الشريحة الضوئية.

يتم ضبط عدسة أخرى للتركيز. يجب أن تتطابق النقطة البؤرية لعدسة الإضاءة مع النقطة البؤرية للجسم لعدسة الكشف. الآن، قم بإسقاط الشعاع على الجدار أو الشاشة وحرك عدسة الإضاءة على طول محور الشعاع حتى تصبح حدود الإسقاط حادة.

قم بتضمين مرشح انبعاث رباعي الخطوط وكاميرا E-M-C-C-D في إعداد المجهر. ثبت مرحلة الترجمة اليدوية الثانية إلى الأولى بشكل عمودي. ثم قم بربط المجموعة ببراغي إلى منصة المجهر الموجودة.

بعد إزالة هدف إضاءة العدسة الأسطوانية المحددة، ضع التجميعة على المجهر وأعد وضع مجموعة الإضاءة على المنصات. قم بتثبيت حامل qve عند التقاطع العمودي لمسار الإضاءة ومسار الكشف. والآن، افحص الشريحة الضوئية.

املأ وعاءً زجاجياً بمحلول الفلورسين وثبته في الحامل الموجود على المنصة. يجب أن تكون الشريحة الضوئية مرئية، وأن تكون أفقية وفي المركز بالنسبة لعدسة الشيئية الخاصة بالكشف.

بعد ذلك، قم بإزالة العدسة الأسطوانية. قم بتحسين ورقة الضوء عن طريق الإزاحة ثلاثية الأبعاد لعدسة الإضاءة، ثم التقط صورة لقياس سمك ورقة الضوء. وتعتمد هذه القيمة على فتحة عدسة الشيئية.

بعد ذلك، تأكد من استبدال العدسة الأسطوانية. أولاً، قم بقص قطعة من الزجاج بسمك 1 ملم، وبأبعاد 10 ملم في 20 ملم. استخدم قلم تحديد ماسي.

بعد ذلك، أضف 20 µL من poly L lysine إلى جانب واحد، وبمجرد أن تجف، ضعها بمحاذاة شريحة ثانية. وفي وضع ثابت، أضف قطرة من agar بتركيز 5% وقم بتسويتها باستخدام وزن شريحة ثالثة توضع في الأعلى. بعد جفاف agar، قم بإزالة الشريحة الثالثة وقص وسادة agar على بعد 3 mm من حافة الشريحتين المتبقيتين فوق الشريحة التي لا تحتوي على poly L lysine.

بعد ذلك، قم بإزالة الشريحة المثبتة، مع ترك جزء بارز من الآغار. قم بتغطية الآغار بـ 20 µL من poly L lysine واتركه حتى يجف. الآن، ضع ديدان GR في زجاجة ساعة مملوءة بوسط M nine تحت مجهر تشريحي.

اقطع الديدان باستخدام مشرط بمستوى الفرج، مما يؤدي إلى تحرير البويضات. بعد ذلك، حدد الأجنة التي تمر بالمرحلة المراد دراستها واجمعها باستخدام ماصة شعرية دقيقة. انقل الأجنة إلى الجزء البارز من الآجار في الشريحة المجهزة، بجوار حافة الشريحة مباشرةً، وليس على حدود الآجار.

بعد ذلك، قم بمحاذاة الأجنة باستخدام ماصة شعرية دقيقة أثناء إزالة السائل. ومن خلال عملية الشفط، ستلتصق الأجنة بـ polyol lysine. من المهم جداً وضع الأجنة بشكل جيد للحصول على تسجيل دقيق، وهذا يتطلب استخدام ماصة شعرية ذات فتحة مناسبة.

إذا كان الحجم صغيراً جداً، فسيصعب تحرير الأجنة. أما إذا كان كبيراً جداً، فسيصعب التحكم بدقة في التدفق المتسرب ومحاذاة الأجنة. قم بتغطية الشريحة بوسط M nine في طبق بتري وتأكد من أن الأجنة لا تزال ملتصقة بالأجار باستخدام التكبير. الآن، قم بتثبيت الشريحة المجهزة والأجنة بحامل العينات الذي يتناسب مع جهاز vete.

الحامل هو أداة مصنعة داخلياً ومصممة لتناسب جهاز vete. بعد ذلك، قم بتثبيت جهاز vete على منصة Pizo electric، وتحت إضاءة المجال المضيء (brightfield)، حدد موقع الجنين. والآن، قم بتشغيل الحزمة البرمجية التي تتحكم في الموالف البصري الصوتي (acoustic optic tuneable).

قم بتصفية الكاميرا والمنصة. لقد كُتب هذا البرنامج داخلياً، ولكن يمكن أيضاً استخدام البرامج المجانية من Micromanager. أولاً، اختر خط الليزر.

بعد ذلك، قم بضبط المنصة على طول المحور x حتى تصل ورقة الضوء إلى أقصى سطوع لها. ثم اضبط البعدين الآخرين، Y و Z، حتى تصل نسبة الإشارة إلى الضجيج إلى أفضل مستوياتها. قد يتطلب الأمر تكرار هذه العملية لكل جنين.

يعد هذا المفتاح أساسياً لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء للحصول على تسجيل جيد من خلال ترجمة المرحلة الحرة، ودعم الهدف والقضاء عليه عندما تكون العلاقة مجرد وسيلة للحصول على محاكاة دقيقة للجنين وأفضل تباين. الآن، للحصول على مجموعة صور بنظام التصوير الزمني (time lapse)، قم بضبط قدرة الليزر، ووقت التعرض، والربح (gain)، والفاصل الزمني للتصوير وفقاً لمستوى الفلورة في الجنين وسرعة العملية البيولوجية التي يتم تحليلها. لزاك.

تم تحديد المسافة بين المقاطع ومواقع بدايتها ونهايتها في تصوير خلايا expressing a histone GFP construct. تم إجراء تصوير بفاصل زمني لمدة ساعتين باستخدام مجموعات مكونة من 20 مقطعاً تم التقاطها كل 37 ثانية. كانت انقسامات الخلايا مرئية بوضوح في سلالة تعبر عن tubulin مدمج مع GFP و histone مدمج مع m cherry، حيث تم أخذ التسجيلات لمدة 16 دقيقة كل 105 ثوانٍ.

تظهر عمليات التصيير ثلاثي الأبعاد عند ثلاث نقاط زمنية. وتظهر خيوط المغزل الانقسامي والكروموسومات المكثفة بوضوح، ويمكن تتبعها بسهولة خلال انقسامات الخلايا. وفي سلالة ثالثة، تم تصوير بروتين APO lipoprotein vit two المدمج مع GFP مع وسم غشاء الخلية بـ mCherry.

على مدار 13 دقيقة، تم التقاط 10 مجموعات من المقاطع كل 27 ثانية. كان من السهل تتبع جسيمات البروتينات الدهنية سريعة الحركة. نستخدم هنا ورقة الضوء التي تم تشكيلها باستخدام طرق أكثر تعقيداً لإنتاجها.

يمكن تنفيذ تقنية ورقة الضوء لتحسين الدقة المكانية بشكل أكبر.