Name: 建模星形细胞瘤发病机制在体外和体内使用星形胶质细胞或条件，遗传工程小鼠神经干细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: 了解利用条件性基因工程小鼠的星形胶质细胞或神经干细胞在体外和体内建立星形细胞瘤模型的方法。该技术通过腺病毒载体诱导基因重组，为神经肿瘤学研究提供重要的表型分析框架。

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CRM 是 Damon Runyon-Genentech 临床研究员。本工作部分由 Damon Runyon 癌症研究基金会（CI-45-09）、美国国防部（W81XWH-09-2-0042）以及北卡罗来纳大学癌症研究基金（UCRF）向 CRM 提供的资助支持。作者感谢 Daniel Roth 在小鼠饲养方面提供的协助。作者还感谢 Hannah Chae、Carter McCormick、Demi Canoutas、Stephanie Gillette 和 Susannah Krom 在组织培养和免疫荧光实验方面提供的协助。

作者无任何利益冲突需要披露。

确保正确收获和培养皮层星形胶质细胞最关键的步骤包括：1）切除大脑皮层时避免取到胼胝体下方的组织，2）彻底去除脑膜，3）充分解离细胞，以及4）富集GFAP阳性细胞。+ 星形胶质细胞。尽管我们采用了机械法（振荡）和遗传学方法（利用Ad5GFAPCre载体限制基因重组或使用显性转化转基因）TgGZT121）在下 GFAP 启动子对照）方法富集GFAP+ 星形胶质细胞，其他技术已被用于纯化皮层星形胶质细胞。例如，可通过用有丝分裂抑制剂处理汇合培养物，随后加入L-亮氨酸甲酯，以去除污染的微胶质细胞47在含血清培养基中通过机械法纯化并培养的星形胶质细胞，其形态和表达谱与急性分离的星形胶质细胞存在差异，前者被认为可能代表较不成熟的星形胶质细胞或反应性星形胶质细胞表型48,49最近，已开发出一种免疫筛选方法，可前瞻性地纯化皮层啮齿类动物星形胶质细胞，当在添加生长因子且不含血清的培养基中培养时，其表达谱更接近于急性分离纯化的星形胶质细胞49传统机械法与近期发展的免疫pan...

星形细胞瘤是最常见的原发性脑肿瘤，而胶质母细胞瘤（GBM）是星形细胞瘤的Ⅳ级亚型，为最常见且最具侵袭性的类型，其中位生存期为12至15个月1,2弥漫性星形细胞瘤（尤其是胶质母细胞瘤，GBM）的侵袭性导致无法完全手术切除，限制了辅助治疗的效果，并不可避免地引起治疗后复发3患者最初表现为初发性（原发性）胶质母细胞瘤，或表现为不可避免地进展为继发性胶质母细胞瘤的低级别星形细胞瘤4胶质母细胞瘤（GBM）在基因组上具有异质性，其特征是调控三条核心信号通路的基因存在互斥性及共现性突变：G1/S（Rb）细胞周期检查点、受体酪氨酸激酶（RTK）和 TP53 通路5-7胶质母细胞瘤（GBM）包含四种具有不同基因表达谱的基因组亚型，其表达特征类似于不同类型脑细胞，提示GBM亚型受其起源细胞的影响。6,8,9需要更好的星形细胞瘤模型来明确特定突变组合在星形细胞瘤发病过程中对特定细胞类型的作用。利用这些模型进行更高效的临床前药物开发，最终将有助于改善患者的预后。目前的星形细胞瘤模型包括已建立的人源细胞系、患者来源的异种移植模型（PDX）、基因修饰的正常人星形胶质细胞以及神经干细胞。&#160;（NSC）和基因工程小鼠（GEM）10-14我们开发了一种替代性的非生殖系基因工程小鼠（nGEM）模型15 利用携带不同组合的floxed致癌等位基因的GEM中分离出的原代脑细胞——皮层星形胶质细胞和NSC。目标是构建具有明确遗传背景的星形胶质细胞瘤模型，这些模型可通过表型特征进行表征 体外 和 体内 并可能用于免疫健全小鼠的临床前药物开发。
建立的人类细胞系是研究星形细胞瘤发病机制和药物反应最常用的模型 体外 和 在体内 它们在技术上操作简便，广泛可得，且在免疫缺陷小鼠中原位异种移植后具有明确的动力学特征和致瘤性。10,11,16-18其缺点包括无法从低级别星形细胞瘤中建立稳定的细胞系，从而限制了研究仅能针对高级别星形细胞瘤；缺乏明确的细胞起源；存在复杂的基因组异常，其基因组特征常与原始患者样本显著不同；以及在含血清的连续传代培养过程中易发生表型和基因型漂移11,17,19-22在已建立的人类胶质母细胞瘤（GBM）细胞系中，单个致癌突变的表型效应可能被实际存在的多种异常所掩盖，这通常阻碍了基因型-表型直接关联的阐明。
PDX 是通过将患者来源的星形细胞瘤细胞皮下接种至免疫缺陷小鼠体内，或先在特定的无血清培养基中以非贴壁球状体形式进行培养，再将其正位注射到免疫缺陷小鼠脑内而建立的12,23PDX 能更准确地维持人类星形细胞瘤的基因组特征，但与已建立的人类细胞系类似，由于其基因组复杂性，单个致癌突变的表型效应可能被掩盖19,24为了明确特定致癌突变的表型后果，尤其是在应对新型治疗时，通常利用已建立的人源细胞系或患者来源的异种移植模型（PDX）进行研究，以建立基因型-表型之间的关联，验证结果的普适性，并最大限度地减少细胞系特异性效应的影响。尽管PDX模型能够准确再现人类星形细胞瘤的组织病理学特征，包括侵袭性，但已建立的人源细胞系在原位异种移植时通常无法再现这些特征。21,23,25此外，已通过基因工程对正常人星形胶质细胞和神经干细胞引入特定的致癌突变，以模拟星形细胞瘤的肿瘤发生过程 体外 和 体内13,14,26这些细胞缺乏已建立的人类细胞系和PDX模型所具有的基因组复杂性，但能准确再现人类星形细胞瘤的组织病理学特征，需在免疫缺陷啮齿类动物中进行异种移植。 体内由于所有人源细胞模型都需要免疫缺陷型啮齿类宿主以防止免疫介导的异种移植物排斥反应，这些模型无法重现同基因系统中天然的肿瘤-间质相互作用，且缺乏完整的免疫系统，从而限制了针对间质和免疫调节疗法的临床前研究10,11.
GEM 可用于研究预设的致癌突变组合所产生的表型后果 体内 在……期间 原位 肿瘤发生。非条件性基因工程小鼠（GEM）在发育过程中所有组织均携带突变，而条件性GEM具有两侧带有loxP位点的致癌等位基因，可通过使用细胞类型特异性启动子将Cre介导的重组限制在特定细胞类型中，从而实现对突变的靶向控制。10,11,15,18条件性星形细胞瘤基因工程小鼠模型已被用于阐明致癌突变在完整大脑不同细胞类型中的功能作用11. 临床前研究中的实用性 原位 使用条件性GEM研究胶质瘤发生受到多种因素的限制，包括1）缺乏一种 体外 相关性，2）难以生成具有复杂基因型的大型小鼠群体，3）潜伏期长 原位 肿瘤发展，4）以及随机性肿瘤进展。由于 原位 肿瘤发生缺乏相应的 体外 模型，药物测试 体外 无法通过传统的条件性GEM模型实现。与其他癌症不同，星形细胞瘤的条件性GEM模型极少由单一致癌突变诱导产生11因此，需要复杂的育种方案来构建具有多个致癌突变的条件性GEM。此外，在这些模型中，星形细胞瘤的启动通常在较长的潜伏期后以可变的外显率发生，而向高级别星形细胞瘤的进展通常以非均一的、随机的方式进行，最终产生具有复杂基因组特征和快速生长动力学的肿瘤。27,28条件性基因工程小鼠（GEM）模型中恶性进展的可变外显率和随机性，要求在将其纳入临床前药物试验前，必须通过放射影像学成像对每只小鼠进行个体化筛查，以检测高级别星形细胞瘤的存在及其位置。综上所述，这些局限性阻碍了临床前药物测试所需的大规模条件性GEM群体的生成与验证。
RCAS-tva 基因工程小鼠（GEM）系统利用禽类逆转录病毒（RCAS）载体感染经基因改造后在特定神经细胞类型中表达病毒受体（tva）的小鼠，已被广泛用于建立星形细胞瘤发生模型11。与条件性基因工程小鼠模型相比，该系统能够在特定细胞类型中引入多个致癌突变，而无需复杂的育种方案。然而，该系统存在局限性，包括突变表型外显率不稳定、需要细胞处于活跃分裂状态才能实现病毒整合，以及外源基因随机插入宿主基因组等问题29。
非生殖系GEM（nGEM）模型利用从GEM中获取的细胞构建，正变得日益重要，因其克服了其他模型系统的诸多局限性15起始细胞类型及共现突变在星形细胞瘤发病机制中的作用，难以通过已建立的人类胶质母细胞瘤（GBM）细胞系或患者来源的异种移植模型（PDX）加以确定，因为这些模型来源于终末期肿瘤，其在恶性进展过程中已在未明确定义的细胞类型中积累了大量遗传突变。相比之下，通过在特定纯化的脑细胞类型中诱导明确的遗传突变，可利用nGEM对所有级别的星形细胞瘤进行建模。11,30因此，可以确定特定基因突变和细胞类型对细胞和分子表型的影响。 体外 和 体内与已建立的人源GBM细胞系相似，初始 体外 使用nGEM进行药物测试可用于优先筛选候选药物 体内 使用相同细胞进行测试。肿瘤发生 体内 然后可通过将nGEM细胞原位异体移植到免疫功能健全的同系同窝动物的脑内来确定30因此，这些原位同种异体移植模型允许 体内 不仅可测试传统的细胞毒性药物和靶向治疗，还可评估免疫调节疗法和靶向肿瘤微环境的疗法。最后，通过比较在相同细胞类型中携带相同突变的nGEM模型与传统GEM模型的实验结果，能够确定微环境在肿瘤发生和进展中的作用。
我们及其他研究者已利用从GEM中分离的原代细胞（如星形胶质细胞、神经干细胞或少突胶质细胞前体细胞）建立了星形胶质瘤的nGEM模型30-34开发星形细胞瘤nGEM的原理是创建一种模型，用于确定特定细胞类型中致癌突变的表型后果，该模型有望用于临床前药物测试。 体外 和 体内 在免疫功能健全的动物中。我们从不表达Cre、条件性GEM且维持在特定背景下的小鼠中分离获得表型为野生型的皮层星形胶质细胞和神经干细胞。 &#62;94% C57/Bl6 背景，RB 通路条件性敲除 - Rb1loxP/loxP，或 TgGZT121 - 以及条件性敲除 RTK/RAS/PI3K 通路 - Nf1loxP/loxP, KrasG12D, PtenloxP/loxP&#160;– 不同组合的基因35-39我们诱导了基因重组 体外 使用编码Cre重组酶的腺病毒载体。由于皮层星形胶质细胞的分离物中含有多种细胞类型的混合物，我们采用了Ad5GFAPCre载体或显性致癌性转基因，例如 TgGZT121 由人 GFAP 启动子驱动，以富集 GFAP+ 这些培养物中的皮层星形胶质细胞。我们定义了G的表型后果1/S（Rb）、MAPK 和 PI3K 通路突变在皮层星形胶质细胞和 NSC 中 体外 和 体内MAPK 和 PI3K 通路激活的 G1/S 期缺陷型星形胶质细胞在分子特征上模拟了人类前神经型胶质母细胞瘤，经原位注射后，可在预设位置形成肿瘤，具有均一的生长动力学、较短的潜伏期以及人类胶质母细胞瘤的组织病理学特征30肿瘤生长的纵向监测 体内 通过标准化治疗组和定量分析治疗后的肿瘤生长情况，辅助临床前药物测试40我们通过纵向生物发光成像检测表达荧光素酶的皮层星形胶质细胞注射小鼠的肿瘤生长动力学。因此，来源于条件性GEM的皮层星形胶质细胞和神经干细胞为定义与星形细胞瘤相关突变的功能后果提供了可操作的模型系统，并为临床前药物开发提供了潜在的模型平台。

<table><tbody><tr><td>DMEM高糖培养基（1X）</td><td>Invitrogen</td><td>11995065</td><td>DMEM也可从其他供应商购买，包括GIBCO Sigma和Cellgro</td></tr><tr><td>胎牛血清，常规型</td><td>Cellgro</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>尖头解剖剪刀</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-395</td><td></td></tr><tr><td>弯头软骨镊</td><td>Fisher Scientific</td><td>1631</td><td></td></tr><tr><td>Miltex 17-301 型珠宝镊，精细，4号</td><td>Miltex</td><td>17-301</td><td></td></tr><tr><td>乙醇（200 proof）</td><td>Decon Labs</td><td>2710</td><td></td></tr><tr><td>剃须刀片</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>汉克平衡盐溶液（HBSS）（1x），液体</td><td>Invitrogen</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express（1x），含酚红</td><td>Invitrogen</td><td>12605-010</td><td>其他胰蛋白酶溶液也适用于皮层星形胶质细胞的分离与培养</td></tr><tr><td>培养皿，60 × 15 mm</td><td>Thomas Scientific</td><td>9380H77</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 离心管</td><td>BD Biosciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 离心管</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>腺病毒原液</td><td>Gene Transfer Vector Core, U. Iowa</td><td>Ad5CMVCre</td><td>分装为5 &amp;micro;l 每管，-80 &amp;deg;C保存。具有危险性。需采用BSL2级安全防护措施</td></tr><tr><td>硫酸钠（Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;）&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>238597</td><td></td></tr><tr><td>硫酸钾（K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221325</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁（MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙（CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746495</td><td></td></tr><tr><td>HEPES钾盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0527</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>酚红</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3532</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠（NaOH）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>木瓜蛋白酶</td><td>Worthington</td><td>LS003127</td><td></td></tr><tr><td>L-半胱氨酸盐酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1276</td><td></td></tr><tr><td>注射器滤器（0.22 &amp;micro;m 孔径）</td><td>Millipore</td><td>SLGP033NS</td><td></td></tr><tr><td>NeuroCult增殖培养基试剂盒（小鼠）</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5702</td><td>该试剂盒包含神经干细胞（NSC）培养所需的NeuroCult NSC基础培养基和NeuroCult NSC补充剂</td></tr><tr><td>0.2% 肝素溶液</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7980</td><td></td></tr><tr><td>EGF&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>PMG8041</td><td></td></tr><tr><td>bFGF&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0261</td><td></td></tr><tr><td>汉克平衡盐溶液（HBSS）（10x）</td><td>Invitrogen</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>硫酸镁（MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠（NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>E-64</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3132</td><td>用DMSO配制成10 mM储存液，-20 &amp;deg;C保存</td></tr><tr><td>6孔板</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-83</td><td></td></tr><tr><td>细胞筛（40 &amp;micro;m 孔径）</td><td>Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>干细胞解离溶液</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5707</td><td>也可使用温和的酶解溶液，如Accutase</td></tr><tr><td>甲基纤维素 15 cP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7027</td><td></td></tr><tr><td>DMEM培养基 2x</td><td>Millipore</td><td>SLM-202-B</td><td>用于配制5%甲基纤维素溶液</td></tr><tr><td>1.7 ml 带盖微量离心管</td><td>Corning</td><td>3620</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton微量注射器，250 &amp;micro;l LT，无针头</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-815-92</td><td></td></tr><tr><td>PB600-1 抗原分配器</td><td>Hamilton</td><td>&amp;nbsp;83700</td><td></td></tr><tr><td>一次性18 G针头</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9015638</td><td></td></tr><tr><td>27号，1/2&quot; 鲁尔接头针头</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-48</td><td></td></tr><tr><td>2,2,2-三溴乙醇（Avertin）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9386574</td><td></td></tr><tr><td>普拉露眼用软膏</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9689910</td><td></td></tr><tr><td>Model 900 立体定位仪</td><td>Kopf Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VETBOND</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9259532&amp;nbsp;</td><td>组织粘合剂&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>利多卡因&amp;nbsp;</td><td>ShopMedVet</td><td>RXLIDO-EPI</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter 96 AQueous One 溶液细胞增殖检测试剂盒（MTS）</td><td>Promega</td><td>G3580</td><td></td></tr><tr><td>抗Sox2抗体</td><td>Millipore</td><td>AB5603</td><td></td></tr><tr><td>兔多克隆抗胶质纤维酸性蛋白（GFAP）抗体</td><td>Dako</td><td>Z0334&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Kinetic</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>用于&lt;em&gt;in vivo&lt;/em&gt;成像</td></tr><tr><td>D-荧光素钾盐生物发光底物</td><td>PerkinElmer</td><td>122796</td><td>用于&lt;em&gt;in vivo&lt;/em&gt;生物发光成像</td></tr><tr><td>EdU成像试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>C10340</td><td></td></tr><tr><td>MSCV 荧光素酶 PGK-潮霉素抗性载体</td><td>Addgene</td><td>18782</td><td></td></tr></tbody></table>

星形细胞瘤发病机制建模 体外 和 体内 利用条件性基因工程小鼠的皮层星形胶质细胞或神经干细胞

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

目前的星形细胞瘤模型在界定致瘤性突变在疾病发生过程中对特定脑细胞类型的作用，以及在临床前药物开发中的应用方面存在局限性。为了针对这些应用设计更优的模型系统，研究人员从携带不同组合的floxed致瘤等位基因的条件性基因工程小鼠（GEM）中分离出表型为野生型的皮层星形胶质细胞和神经干细胞（NSC），并在体外进行培养。通过诱导基因重组 体外 通过腺病毒介导的Cre重组，实现突变癌基因的表达和肿瘤抑制基因的缺失。通过检测细胞增殖、转化能力及药物反应，确定这些突变的表型效应。 体外. 通过将转化细胞立体定向注射到免疫健全、遗传背景相同的同窝幼鼠脑内，建立同位异体移植模型，以明确致癌突变和细胞类型在肿瘤发生中的作用 体内与大多数已建立的人胶质母细胞瘤细胞系异种移植模型不同，将经转化的GEM来源的皮层星形胶质细胞注射到免疫健全同窝幼鼠脑内，可产生星形细胞瘤，包括最具侵袭性的亚型——胶质母细胞瘤，其组织病理学特征与人类星形细胞瘤高度相似，表现为向正常脑实质的弥漫性浸润。通过生物发光成像技术，对经基因工程改造后表达荧光素酶的转化星形胶质细胞所形成的原位同种移植瘤进行监测 在体 随时间推移的肿瘤生长情况。因此，利用从携带条件性致癌等位基因的基因工程小鼠（GEM）中分离的星形胶质细胞和神经干细胞构建的星形胶质瘤模型，为研究星形胶质瘤发病机制中的遗传学和细胞生物学提供了整合性研究系统 体外 和 体内 在这些严重疾病的临床前药物开发中可能具有应用价值。

我们开发了一种nGEM模型系统，该系统采用来自携带floxed条件性致癌等位基因的新生GEM的皮层星形胶质细胞和NSC，可进行表型表征 体外 和 体内 (图1). 为了专门研究癌基因突变在皮层星形胶质细胞中的影响 体外, 首先对星形胶质细胞进行富集至关重要。皮层星形胶质细胞收获物中包含小胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞、少突胶质前体细胞（OPC）和神经元的混合物，但可通过机械和遗传方法实现星形胶质细胞的富集。在常规培养条件下，神经元会死亡，而小胶质细胞和少突胶质细胞可通过过夜震荡去除41,43此外，针对GFAP的floxed致癌等位基因的遗传重组+ 使用 Ad5GFAPCre 可富集星形胶质细胞。我们采用该方法感染 Rb1 的皮层组织收获物loxP/loxP 带有 Nf1 基因条件性等位基因的小鼠幼崽loxP/loxP 和/或 PtenloxP/loxP 等位基因。Ad5GFAPCre 感染在重组的 GFAP 中导致增殖优势+<...

表型正常的星形胶质细胞和神经干细胞取自携带floxed条件性致癌等位基因的基因工程小鼠，通过病毒介导的Cre重组进行转化，可用于建立星形细胞瘤发病机制的模型 体外 和 体内 通过将转化细胞原位注射到同系、免疫功能健全的同窝幼鼠脑内。

目前的星形细胞瘤模型在定义致癌突变于疾病过程中在特定脑细胞类型中的作用方面存在局限性……

以下实验的总体目标是通过特定细胞类型构建基因工程化的星形细胞瘤模型，用于体外和体内表型特征分析。首先，从不表达Cree的新生条件性基因工程小鼠中分离野生型原代细胞，并进行体外培养。第二步，利用编码Cree重组酶的腺病毒载体感染原代细胞，从而在体外诱导F flox等位基因的基因重组。接下来，对重组细胞进行连续培养，以进行表型鉴定。最终，通过在体外和体内对肿瘤发生相关表型的鉴定，确定特定神经细胞类型中定义的突变是否促进胶质细胞生成异常。该方法有助于回答神经肿瘤学中的关键问题，例如：与星形细胞瘤相关的突变具有哪些表型后果？该技术的应用意义延伸至星形细胞瘤的临床前药物开发，因为这些基因定义的细胞可在体外以及免疫功能完整的同系小鼠体内使用。对该方法进行可视化展示至关重要，因为细胞收获和原位注射步骤在技术上较为困难，且需要对解剖结构进行准确定位。本实验操作将由本实验室的技术员 Ryan Bash 演示脑组织的收获过程。首先，使用经乙醇消毒的解剖剪，在一只经基因工程改造的、已处死的1至3日龄新生小鼠的颅骨皮肤上，从脊髓至鼻部沿矢状方向进行剪切。接着，沿矢状缝在颅骨上进行切割，从脊髓端开始，向前延伸超过嗅球。然后，用弯头镊子轻轻夹住颅骨的每一侧半，用直头显微镊子将颅骨半侧从脑组织上向外侧剥离。接下来，轻轻捏住每个大脑半球的背侧部分，注意避开小脑和嗅球，将脑组织放入含有H-B-S-S-N的组织培养皿中。在解剖显微镜下，使用两对显微镊子轻轻去除每个大脑半球的脑膜，然后将组织培养皿放回冰上，以保持脑组织的低温状态。首先，使用干净的刀片将大脑半球精细地切成小块。然后将培养皿转移至组织培养罩内，将组织块移入无菌的15毫升锥形管中。用1毫升冰浴的HBSS冲洗培养皿，并将洗涤液一并转移至该管中。吸除多余的HBSS后，向管中加入2毫升室温的含EDTA胰蛋白酶溶液，并用1毫升移液器反复吹打约10次，进一步解离组织碎片。将细胞悬液在37摄氏度下孵育15至20分钟。孵育后，每隔五分钟轻轻颠倒混匀细胞溶液一次，随后用移液器上下吹打10次，将3毫升完全培养基加入细胞悬液中，以抑制胰蛋白酶活性，操作方法如前所示。然后离心分离解离的星形胶质细胞。用1毫升移液器小心吸除上清液，并将沉淀重悬于4毫升37摄氏度的完全培养基中。然后将星形胶质细胞悬液转移至T75螺口式组织培养瓶中，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养，直至收获后约16小时。用 4 毫升 37 摄氏度的 HBSS 清洗烧瓶。然后加入 4 毫升完全培养基，并在 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下培养皮层星形胶质细胞。当细胞培养至约 95% 汇合时，在 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下振荡培养过夜。然后移除含有脱落细胞的培养基，并用4毫升37摄氏度的HBSS洗涤培养板。随后加入4毫升新鲜的完全培养基，在富集皮层星形胶质细胞培养物后再次培养细胞24小

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建模星形细胞瘤发病机制在体外和体内使用星形胶质细胞或条件，遗传工程小鼠神经干细胞

星形胶质细胞已被确认为多功能细胞，参与多种基本生物学过程，在正常脑发育、功能维持及中枢神经系统修复中发挥重要作用。本文介绍一种快速获取纯化小鼠星形胶质细胞培养物的实验流程，用于研究这类主要中枢神经系统细胞的生物学特性。...

小鼠皮层星形胶质细胞的分离与培养

我们建立了小鼠皮层原位胶质母细胞瘤模型，用于活体双光子显微镜观察，该模型可重现肿瘤生长过程中通常存在的生物物理约束条件。通过以慢性玻璃窗替代肿瘤上方的颅骨，可利用双光子显微镜对肿瘤进展进行长期动态追踪。...

一种保留脑实质物理约束并适用于活体双光子显微成像的原位胶质母细胞瘤小鼠模型

大脑是一个具有独特特性的部位，其特性无法通过 体外 或异位分析。通过使用立体定位固定仪和低压注射泵进行颅内注射，可可靠地建立具有可重复位置和生长特征的原位小鼠模型。...

创建解剖学上精确且可重复的人脑肿瘤颅内异种移植模型

星形胶质细胞在大脑皮层中均匀分布，这使得在细胞水平上分析其复杂形态具有挑战性。本方案采用基于子宫内电穿孔的多色标记方法，以标记单个皮层星形胶质细胞，并结合用户友好的图像分析流程，对其体积和形态进行分析。...

子宫内电穿孔法将多靶点基因组整合彩色（MAGIC）标记递送至个体小鼠皮层星形胶质细胞

我们描述了一种将人皮肤来源的成纤维细胞重编程为诱导性神经前体细胞（iNPCs），并进一步将其分化为诱导性星形胶质细胞（iAs）的实验方案。该方法可快速、可重复地大量生成iNPCs和iAs。...

利用成纤维细胞直接转化为神经祖细胞并分化为星形胶质细胞的体外神经疾病建模

本文报道了一种3D生物打印小鼠皮层星形胶质细胞的方法，用于构建类神经组织，以研究星形胶质细胞在中枢神经系统中的功能，以及胶质细胞在神经系统疾病及其治疗机制中的作用。...

利用小鼠皮层星形胶质细胞进行类神经组织工程的3D生物打印

在此，我们描述了一种用于胶质母细胞瘤（GBM）的临床前原位小鼠模型，该模型通过将来源于基因工程小鼠模型肿瘤的细胞进行颅内注射而建立。该模型呈现出人类GBM疾病的典型特征。在转化研究中，小鼠脑肿瘤可通过影像学手段进行追踪 体内 MRI 与组织病理学...

多形性胶质母细胞瘤的转化性原位模型

利用具有常见患者突变驱动的免疫健全、同源性肿瘤模型进行临床前测试，对免疫治疗研究至关重要。本方案描述了一种通过电穿孔递送质粒DNA来构建脑肿瘤小鼠模型的方法，该模型可模拟常见患者突变，从而提供一种准确、可重复且稳定的小鼠模型。...

建立脑肿瘤模型 体内 利用电穿孔法递送代表患者突变特征的质粒DNA

本文介绍了一种从废弃的人类胎儿皮质组织中分离和培养神经干细胞的简单且可靠的方法。来源于已知人类神经系统疾病的人源组织培养物可用于病理性的细胞与分子过程的表征，并可作为评估药理学疗效的平台。...

从废弃的人类胎儿皮质组织中生成神经干细胞

偏头痛及其向慢性偏头痛的转化是重大的医疗负担，亟需更有效的治疗方案。我们致力于阐明神经免疫信号如何调节偏头痛的易感性，通过体外建模 体外...

使用扩散性抑制建模发作性与慢性偏头痛的神经免疫信号传导 体外

了解利用条件性基因工程小鼠的星形胶质细胞或神经干细胞在体外和体内建立星形细胞瘤模型的方法。该技术通过腺病毒载体诱导基因重组，为神经肿瘤学研究提供重要的表型分析框架。

星形细胞瘤发病机制建模体外和体内利用条件性基因工程小鼠的皮层星形胶质细胞或神经干细胞

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星形细胞瘤发病机制建模 体外 和 体内 利用条件性基因工程小鼠的皮层星形胶质细胞或神经干细胞

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