建模星形细胞瘤发病机制在体外和体内使用星形胶质细胞或条件，遗传工程小鼠神经干细胞
August 12th, 2014
从用絮凝、条件致癌等位基因工程改造并通过病毒 Cre 介导的重组转化的小鼠中收获的表型野生型星形胶质细胞和神经干细胞可用于模拟体外和体内星形细胞瘤的发病机制，方法是将转化的细胞原位注射到同基因、免疫能力强的同窝同胞的大脑中。
以下实验的总体目标是从确定的细胞类型生成基因工程星形细胞瘤模型，用于体外和体内的表型表征。这是通过从非表达 Cree 的新生条件基因工程小鼠中收获野生型原代细胞进行体外培养来实现的。在第二步中，原代细胞被编码 Cree 重组的腺病毒载体感染，以在体外诱导 F flox 等位基因的基因重组。
接下来，连续培养重组细胞以获得其表型特征。最终，确定的突变是否促进特定神经细胞类型的神经胶质发育不全取决于体外和体内致瘤相关表型的表征。这种方法可以帮助回答关键的神经肿瘤学问题，例如星形细胞瘤相关突变的表型后果是什么？
该技术的意义延伸到星形细胞瘤的临床前药物开发，因为这些基因定义的细胞可以在免疫功能正常的同遗传小鼠的体外和体内使用。这种方法的视觉演示至关重要，因为细胞收获和原位注射步骤在技术上很困难，并且需要准确识别解剖结构。演示该程序的是 Ryan Bash，我实验室的一名技术员 To harvest the brain tissue。
首先使用乙醇消毒的解剖剪刀在一到三天大的安乐死新生转基因工程小鼠的头盖骨上的皮肤上从脊髓到鼻子做矢状切口。接下来，沿着矢状缝在颅骨上切开，从脊髓开始，一直延伸到嗅球。然后用弯曲的镊子轻轻地将颅骨的每个半球从大脑横向剥离。
接下来，轻轻捏掉每个皮质半球的背侧部分，注意避开小脑和嗅球，并将脑组织放入含有 H-B-S-S-N 的组织培养皿中。在解剖显微镜下，使用两对微型镊子轻轻地从每个皮质半球去除脑膜，然后将组织培养皿放回冰上以使脑组织均质化。首先，使用干净的剃须刀片最后将皮质半球切成丁。
然后将板移至组织培养罩中，并将组织块转移到无菌的 15 毫升锥形管中。用 1 毫升冰冷的 HBSS 冲洗板，并将洗涤液也转移到试管中。在 2 毫升室温下去除多余的 HBSS 后，用 EDTA 将 tripin 加入试管，并通过用 1 毫升移液管上下移液约 10 次来进一步结合组织碎片。
将细胞悬液在 37 摄氏度下孵育 15 至 20 分钟。孵育后每 5 分钟通过倒置小心混合细胞溶液，将 3 mL 完全培养基混合到细胞悬液中，通过上下移液 10 次来抑制胰蛋白酶，就像刚才所示。然后旋转解离的星形胶质细胞。
用 1 毫升移液管小心地去除 snat，并将沉淀重悬于 4 毫升 37 摄氏度中。完整媒体。然后将星形胶质细胞悬浮液转移到 T 75 螺口组织培养瓶中，并在收获后约 16 小时将皮质星形胶质细胞保持在 37 摄氏度的 5% 二氧化碳中。
用 4 毫升 37 摄氏度 HBSS 清洗培养瓶。然后加入 4 毫升完全培养基，并在 5% 二氧化碳中将皮质星形胶质细胞维持在 37 摄氏度。当培养物达到约 95% 汇合时，在 37 摄氏度的 5% 二氧化碳中摇动培养物过夜。
然后去除含有分离细胞的培养基，再用 4 毫升 37 摄氏度 HBSS 洗涤板。然后加入 4 毫升新鲜完全培养基，并在富集皮质星形胶质细胞培养物 24 小时后再次孵育细胞。用 2 mL 完全培养基刷新培养物。
然后用 1 毫升完全培养基孵育细胞，其中含有 1 微升至少是每毫升目标腺病毒中 10th pfu 的 10 倍 10 倍，在 32 摄氏度下在 5% 二氧化碳中。Gfab CRE 感染在重组的 gfab 星形胶质细胞中引起增殖优势，在培养 5 至 9 代后，星形胶质细胞纯度从 59% 增加到 90% 以上。6 小时后，去除含病毒的培养基，并在新鲜、完整的培养基中重新孵育培养物。
在以约 90% 汇合度收获皮质星形胶质细胞后，将适当的细胞数重悬于冰冷的 5% 甲基纤维素中。将 250 μL 玻璃注射器放入重复抗原分配器中，然后将 18 号钝针连接到注射器上。使用 18 号针头将皮质星形胶质细胞吸入注射器中并去除任何气泡。
然后丢弃 18 号针头，将 27 号针头安装到注射器上。按下抗原分配器上的按钮，直到液体从新针头中排出以植入星形胶质细胞。接下来，将 3 到 6 个月大的免疫功能正常的受体动物固定在立体定位框架内，并在耳朵和眼睛之间约0.5厘米长的矢状缝上切开一个切口。
找到冠状缝和矢状缝或 BRE MA 的交点，以及矢状缝或 Lambda 中 lambdoid 的交点。在确保 BMA 和 lambda 位于同一水平面上后，将注射器和重复抗原分配器连接到动物头部上方的立体定位框架上，并使针尖与 bgma 接触。将针头稍微抬离颅骨表面，并从 bgma 横向移动 2 毫米，向喙部移动 1 毫米。
然后小心地将针头穿过颅骨放下到目的地。距 breg MA 腹侧 4 毫米，并激活重复抗原分配器。一次注射 5 μL 的细胞悬液。
将针头留在原位两分钟，让颅内压达到平衡，然后在 30 秒内使用棉签缓慢抽出针头，以对可能发生的任何出血施加压力。最后，使用组织粘合剂接近伤口边缘并闭合切口，然后将动物放在干净、温暖的笼子中恢复。已建立的人类细胞系的异种移植物需要免疫缺陷宿主，并且通常不能概括人类星形细胞瘤的组织病理学。
例如，U 87 MG 原位异种移植物形成不侵入正常大脑的局限性肿瘤。相比之下，将 T RRP 缺失星形胶质细胞注射到免疫能力同基因小鼠的大脑中，产生的肿瘤概括了其人类对应物的组织学特征，特别是对正常脑组织的侵袭。为了监测 TRP 无效同种异体移植物的生长，细胞注射后每 5 天处死小鼠，并通过量化 h 和 e 染色脑切片上的肿瘤面积来确定肿瘤负荷。
确定肿瘤面积随着时间的推移呈指数增加，并且将 TP nll 星形胶质细胞的 10 倍到 5 倍的原位注射到受体大脑中导致神经系统发病率。中位生存期为 22 天。体内纵向成像已用于定义肿瘤生长动力学。
因此，在本实验中，TR 刑罚星形胶质细胞并被设计为表达荧光素酶，被注射到免疫能力同基因的大脑中。通过连续生物发光成像确定窝配对和肿瘤生长。在 16 天内观察到生物发光增加了 15 倍。
在此程序之后，可以在体外和体内进行药物测试，以确定疗效并测试新的药物组合。看完这个视频，你应该对如何从非 crea 表达的条件性基因工程小鼠中收获皮质星形胶质细胞、如何在体外诱导基因重组以及如何在免疫功能正常的小鼠中使用原位同种异体移植物模拟肿瘤发生有一个很好的了解。
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概述
本研究专注于从野生型星形胶质细胞和条件性基因工程小鼠中提取的神经干细胞生成基因工程星形细胞瘤模型。通过体外和体内表征这些模型，以了解星形细胞瘤相关突变的表型后果。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经肿瘤学
- 细胞生物学
- 基因工程
背景
- 星形细胞瘤是一种源自星形胶质细胞的脑肿瘤。
- 了解星形细胞瘤的遗传基础可以为治疗策略提供信息。
- 条件性基因工程允许对特定突变进行靶向研究。
- 体外和体内建立星形细胞瘤模型对于表型表征至关重要。
研究目的
- 生成星形细胞瘤模型以进行表型表征。
- 研究特定突变对神经胶质细胞生成的影响。
- 回答关于星形细胞瘤突变的神经肿瘤学中的关键问题。
使用的方法
- 从基因工程小鼠中提取野生型原代细胞。
- 用腺病毒载体感染原代细胞进行基因重组。
- 连续培养重组细胞进行表型分析。
- 体外和体内表征肿瘤相关表型。
主要结果
- 从特定细胞类型成功生成星形细胞瘤模型。
- 表征与突变相关的表型变化。
- 洞察特定突变在星形细胞瘤发展中的作用。
- 对理解和治疗星形细胞瘤的潜在影响。
结论
- 该研究为建立星形细胞瘤发病机制模型提供了框架。
- 研究结果有助于理解与星形细胞瘤相关的突变。
- 未来的研究可以在这些模型基础上探索治疗选择。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables biopharma R&D to model astrocytoma pathogenesis using genetically defined cortical astrocytes or neural stem cells from conditional GEM, providing a syngeneic, immunocompetent system that recapitulates human histopathological hallmarks including diffuse brain invasion. It supports mechanistic de-risking by linking specific oncogenic mutations to phenotypic outcomes in vitro and in vivo, improving target validation confidence. The orthotopic allograft model facilitates preclinical drug testing in a physiologically relevant microenvironment, enhancing translational continuity for neuro-oncology pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by defining phenotypic consequences of specific oncogenic mutations in relevant brain cell types.
- Operational Value: Provides a reproducible system for functional target validation through adenoviral Cre-mediated recombination in primary cells.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by linking mutations to transformation, proliferation, and drug response phenotypes.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates validated biological systems suitable for downstream compound screening after in vitro phenotypic characterization.
- Quantitative Outputs: Enables measurement of proliferation, transformation, and drug response as standardized endpoints for assay development.
- Scalability: Serial culture of recombined cells supports scalable preparation of transformed astrocytes for reproducible screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Orthotopic allografts in immune-competent syngeneic mice recapitulate histopathological hallmarks of human astrocytomas, including glioblastoma and diffuse parenchymal invasion.
- Translational Continuity: Bioluminescence imaging of luciferase-expressing allografts enables longitudinal in vivo tumor growth monitoring for pharmacokinetic/pharmacodynamic studies.
- Preclinical Utility: Facilitates drug efficacy testing in vitro and in vivo using the same genetically defined cell system, supporting go/no-go decisions.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical validation by providing a genetically defined, immunocompetent model system for astrocytoma.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling controlled recombination of floxed oncogenic alleles in cortical astrocytes or NSCs.
- Screening: Delivers assay-ready transformed cells with quantifiable phenotypes (proliferation, transformation, drug response) for reliable compound evaluation.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements (tumor area via histopathology, bioluminescence signal) that enable cross-condition comparison and growth kinetics modeling.
- Translational Research: Connects in vitro findings to in vivo tumorigenesis through orthotopic allografts that mirror human astrocytoma histopathology.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying multiple oncogenic combinations across cell types, reducing reliance on xenograft models requiring immunosuppression.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through isogenic, cell-type-specific modeling.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization via defined genetic inputs and syngeneic host systems.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets using a model that avoids late-stage failures due to poor histopathological fidelity.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement decisions by providing data on tumorigenic potential and drug response in a clinically relevant context.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary neural cell harvest, adenoviral transduction, and stereotaxic orthotopic injection.
- Dependent on access to conditional genetically engineered mice with floxed oncogenic alleles and tissue culture facilities for primary cell expansion.
- Necessitates standardization across teams for consistent Cre recombination efficiency and allograft implantation coordinates.
- Involves adaptation considerations when extending the model to neural stem cells or different oncogenic combinations beyond astrocytes.
- Practical limitations include the technical difficulty of neonatal brain dissection and intracranial injection, which require specialized training to ensure viability and reproducibility.
