星形细胞瘤发病机制建模 体外 和 体内 利用条件性基因工程小鼠的皮层星形胶质细胞或神经干细胞

以下实验的总体目标是通过特定细胞类型构建基因工程化的星形细胞瘤模型，用于体外和体内表型特征分析。首先，从不表达Cree的新生条件性基因工程小鼠中分离野生型原代细胞，并进行体外培养。第二步，利用编码Cree重组酶的腺病毒载体感染原代细胞，从而在体外诱导F flox等位基因的基因重组。

接下来，对重组细胞进行连续培养，以进行表型鉴定。最终，通过在体外和体内对肿瘤发生相关表型的鉴定，确定特定神经细胞类型中定义的突变是否促进胶质细胞生成异常。该方法有助于回答神经肿瘤学中的关键问题，例如：与星形细胞瘤相关的突变具有哪些表型后果？

该技术的应用意义延伸至星形细胞瘤的临床前药物开发，因为这些基因定义的细胞可在体外以及免疫功能完整的同系小鼠体内使用。对该方法进行可视化展示至关重要，因为细胞收获和原位注射步骤在技术上较为困难，且需要对解剖结构进行准确定位。本实验操作将由本实验室的技术员 Ryan Bash 演示脑组织的收获过程。

首先，使用经乙醇消毒的解剖剪，在一只经基因工程改造的、已处死的1至3日龄新生小鼠的颅骨皮肤上，从脊髓至鼻部沿矢状方向进行剪切。接着，沿矢状缝在颅骨上进行切割，从脊髓端开始，向前延伸超过嗅球。然后，用弯头镊子轻轻夹住颅骨的每一侧半，用直头显微镊子将颅骨半侧从脑组织上向外侧剥离。

接下来，轻轻捏住每个大脑半球的背侧部分，注意避开小脑和嗅球，将脑组织放入含有H-B-S-S-N的组织培养皿中。在解剖显微镜下，使用两对显微镊子轻轻去除每个大脑半球的脑膜，然后将组织培养皿放回冰上，以保持脑组织的低温状态。首先，使用干净的刀片将大脑半球精细地切成小块。

然后将培养皿转移至组织培养罩内，将组织块移入无菌的15毫升锥形管中。用1毫升冰浴的HBSS冲洗培养皿，并将洗涤液一并转移至该管中。吸除多余的HBSS后，向管中加入2毫升室温的含EDTA胰蛋白酶溶液，并用1毫升移液器反复吹打约10次，进一步解离组织碎片。

将细胞悬液在37摄氏度下孵育15至20分钟。孵育后，每隔五分钟轻轻颠倒混匀细胞溶液一次，随后用移液器上下吹打10次，将3毫升完全培养基加入细胞悬液中，以抑制胰蛋白酶活性，操作方法如前所示。然后离心分离解离的星形胶质细胞。

用1毫升移液器小心吸除上清液，并将沉淀重悬于4毫升37摄氏度的完全培养基中。然后将星形胶质细胞悬液转移至T75螺口式组织培养瓶中，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养，直至收获后约16小时。

用 4 毫升 37 摄氏度的 HBSS 清洗烧瓶。然后加入 4 毫升完全培养基，并在 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下培养皮层星形胶质细胞。当细胞培养至约 95% 汇合时，在 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下振荡培养过夜。

然后移除含有脱落细胞的培养基，并用4毫升37摄氏度的HBSS洗涤培养板。随后加入4毫升新鲜的完全培养基，在富集皮层星形胶质细胞培养物后再次培养细胞24小时。用2毫升完全培养基更换培养液。

然后，在32摄氏度、5%二氧化碳条件下，将细胞与1毫升完全培养基共同孵育，培养基中含1微升浓度不低于每毫升1×10¹⁰空斑形成单位（pfu）的感兴趣腺病毒。Gfab CRE感染可使发生重组的Gfab星形胶质细胞获得增殖优势，经过5至9次传代培养后，星形胶质细胞纯度可从59%提高至90%以上。孵育6小时后，移除含病毒的培养基，并更换为新鲜的完全培养基继续孵育。

当皮层星形胶质细胞收获至约90%融合度时，将适当数量的细胞重悬于冰上预冷的5%甲基纤维素中。将250微升玻璃注射器插入重复加样器中，然后将一支钝头18号针头连接至注射器上。用18号针头将皮层星形胶质细胞吸入注射器，并去除所有气泡。

然后丢弃18号针头，并在注射器上安装一个27号针头。按压抗原分配器上的按钮，直至新针头中有液体排出，以植入星形胶质细胞。接下来，将一只3至6月龄的免疫功能健全的受体动物固定于立体定位仪中，在耳间与眼间沿矢状缝做一条长约0.5厘米的切口。

找到冠状缝与矢状缝的交点，即前囟中点（BRE MA），以及人字缝与矢状缝的交点，即人字点（Lambda）。在确认BMA与人字点处于同一水平面后，将注射器和重复抗原分配器固定在动物头部上方的立体定位仪框架上，并使针尖接触前囟中点（bgma）。将针尖略微抬离颅骨表面，从bgma向外侧移动2毫米，向前移动1毫米。

然后小心地将针头穿过颅骨，到达目标位置。在前囟（bregma）腹侧4毫米处，启动重复抗原分配器，注射一次，注入5 µL细胞悬液。

将针头留置原位两分钟，以使颅内压达到平衡，然后在30秒内缓慢拔出针头，同时使用棉签对可能出现的出血部位施加压力。最后，使用组织粘合剂闭合伤口边缘以关闭切口，并将动物置于清洁、温暖的笼子中恢复。已建立的人源细胞系异种移植需要免疫缺陷型宿主，且通常不能重现人类星形细胞瘤的组织病理学特征。

例如，U 87 MG 原位异种移植瘤会形成边界清晰的肿瘤，不会侵袭正常脑组织。相比之下，将 T RRP 敲除的星形胶质细胞注射到免疫功能正常且遗传背景相同的同系小鼠脑内，所形成的肿瘤能够重现其人类对应肿瘤的组织学特征，尤其是对正常脑组织的侵袭性。为了监测 TRP 敲除同种移植瘤的生长情况，在细胞注射后每五天处死一批小鼠，通过定量分析苏木精-伊红（H&E）染色脑切片上的肿瘤面积来确定肿瘤负荷。

肿瘤区域被确定随时间呈指数增长，将1×10⁵个TP-nll星形胶质细胞原位注射至受体脑内可导致神经系统发病，中位生存期为22天。已采用活体纵向成像技术来确定肿瘤生长动力学。

因此，在本实验中，将经过改造表达荧光素酶的TR-penal星形胶质细胞注射到免疫功能健全的同系小鼠的脑内，通过连续的生物发光成像监测肿瘤生长情况。在16天内观察到生物发光信号增加了15倍。

通过该实验流程，可开展体外和体内药物测试，以评估药物疗效并验证新型药物组合。观看本视频后，您应能够充分掌握如何从不表达crea的条件性基因工程小鼠中分离皮层星形胶质细胞，如何在体外诱导基因重组，以及如何在免疫功能健全的小鼠中利用原位同种移植模型模拟肿瘤发生过程。