可视化的非溶胞胞吐作用新型隐球菌从巨噬细胞用数码光学显微镜
October 21st, 2014
我们将介绍如何可视化巨噬细胞C。新型隐球菌 （Cn）的相互作用进行实时，特别强调采用数字光学显微镜非溶胞胞吐过程。单独使用这种技术被感染的巨噬细胞可以研究，以确定这种现象的各个方面。
该程序的总体目标是可视化来自原代骨髓神经元巨噬细胞的新型隐球菌的非脂肪胞吐作用。这是通过首先用真菌细胞接种和感染活化的神经巨噬细胞来实现的，以允许 Xeomin 的吞噬作用和内化。第二步是去除细胞外真菌细胞，以确保感染和未感染的巨噬细胞的单层清晰。
接下来，将巨噬细胞在二氧化碳温控室中孵育并记录 24 小时，以捕获非糖核酸胞吐作用和其他相互作用的实例。最后一步是通过压缩 24 小时内制作的所有帧来创建电影。最终，使用数字光学显微镜对巨噬细胞进行可视化，以观察巨噬细胞在 24 小时感染过程中经历的各种非脂肪胞吐作用类型。
该方法可以帮助回答宿主病原体相互作用领域的关键问题，例如细胞事件的时间和定量 在实验前一天，选择一个在 sbarro 琼脂平板上生长的单个高级工头菌落并接种。10 毫升 sbarro 肉汤。让培养物在 37 摄氏度下生长过夜，按照书面方案中的说明对小鼠实施安乐死后以 250 RPM 的速度摇晃。
用 70% 乙醇对全身消毒。去除股骨和胫骨，并将骨骼放入无菌 duo 改良 eagle 培养基或 DMEM 中。然后使用精致的湿巾去除多余的组织和肌肉，直到骨骼完全干净。
仅将完整的骨骼放入含有 70% 乙醇的培养皿中，孵育 3 分钟以杀死相关微生物。取出骨头，放入装有无菌 DMEM 的培养皿中。接下来，小心地切开骨头的末端。
将骨头放在放在冰上的 MT 50 毫升锥形管上，并使用 25 号针头小心地将 10 毫升冷 DMEM 冲洗过每根骨头。然后将收集的细胞悬液在室温下以 650 倍 G 离心 10 分钟，在此离心过程中，按照文本方案中的说明准备和过滤对骨髓巨噬细胞补料培养基进行消毒。接下来，用 10 毫升补料培养基重悬所得调色板。
将细胞悬液通过 70 微米的细胞过滤器，以破坏细胞团块并去除大碎片。然后将 1 毫升应变细胞悬液接种到 10 毫升补料培养基中，即指定用于组织培养的培养皿中。让细胞在 37 摄氏度和 10% 二氧化碳下粘附 7 天。
在实验前一天按照文本协议中的说明更换进料培养基。去除补料培养基，从板中分离巨噬细胞，并在细胞孵育 5 至 10 分钟后向板中加入 5 mL 温和的细胞剥离试剂。在 37 摄氏度下，轻轻移液去除巨噬细胞。
以 650 倍 G 离心 10 分钟，使细胞沉淀，然后在 1 毫升补料培养基中重新弯曲沉淀。使用 1 比 20 稀释度，通过使用 14 毫米玻璃底将 10 微升细胞悬液移液到血细胞仪中来计算巨噬细胞的浓度。培养皿将 1 倍 10 至第五巨噬细胞的浓度直接放入内孔中，内孔最多可容纳 200 微升。
注意不要超过此体积。将培养皿放入 37 摄氏度的培养箱中 1 小时，让细胞粘附在玻璃培养皿上。然后加入 1 至 2 毫升补料培养基，补充有 1 毫克/毫升的脂多糖和干扰素 γ。
以每毫升 500 单位的浓度，让细胞在实验当天孵育过夜。取出 1 毫升接种过夜的 G 细胞培养物，离心 5 分钟 420 次，G.To 去除培养基和细胞外隐球菌产物，用磷酸盐缓冲盐水或 PBS 洗涤细胞 3 次，然后像以前一样离心。复苏后，将酵母细胞沉淀悬浮在 1 毫升无菌 PBS 中，并制备 1 比 100 稀释液，将 10 微升稀释液放入血细胞仪中，对细胞进行计数。
计算 1 到 5 的感染倍数所需的酵母细胞浓度。将计算体积的隐球菌细胞悬液加入 1 毫升补料培养基中，加入浓度为 10 微克/毫升的单克隆抗体 18 B 7。将细胞悬液在室温下孵育 5 分钟。
接下来，从玻璃培养皿中取出饲养培养基，并用无菌 PBS 洗涤巨噬细胞一次。然后将 100 微升调理素 cmin 直接加入孔中，然后在 37 摄氏度和 10% 二氧化碳面与酵母一起孵育 2 小时。共孵育后，通过显微镜检查巨噬细胞已经内化 c eForms 以被视为内化，应在巨噬细胞的范围内清楚地看到隐球菌细胞，如大箭头所示。
较小的箭头表示未感染的巨噬细胞，没有真菌细胞。用无菌 PBS 洗涤培养皿 3 次，以去除任何和所有细胞外新型 c 细胞。然后加入 1 到 2 mL 不含单克隆抗体的补料培养基进行这些实验。
实验前需要一台配备有附加培养室的显微镜，该培养室包括二氧化碳输送和加热装置。在 30 摄氏度下预热孵育室至少 37 分钟。确保二氧化碳单位在实验开始时读数为 5%。
将玻璃底培养皿放在显微镜平台盖上，点燃二氧化碳并关闭所有门以确保没有热量逸出，使用 10 倍物镜和相差显微镜，聚焦受感染巨噬细胞的清晰区域，设置显微镜软件每四分钟拍摄一次图像，持续 24 小时。24 小时后，实验将完成，总共将收集 361 张图像。将这些图像导出为 5% 压缩率的 JPEG。
使用 image J 软件以每秒 5 帧的速度将图像视为视觉堆栈。电影的第一帧显示了整个领域的许多巨噬细胞，其中一些未感染，而另一些则具有不同大小的隐球菌细胞。随着电影的进行，这些细胞都是 mo 的，在这部电影中可以看到它们在田野中移动，很明显隐球菌细胞位于受感染的巨噬细胞的范围内。
巨噬细胞变得激动，可以看到酵母细胞，但在 FGA 区内，隐球菌细胞随后迅速被清除到周围环境中。第二个受感染的巨噬细胞发生非糖化胞吐作用，更多的酵母细胞被释放到细胞外间隙。宿主细胞在隐球菌胞吐作用后仍保持活力，如它们继续移动的能力所示。
有时，巨噬细胞会以促进宿主细胞之间转移隐球菌细胞的方式相互作用。酵母细胞不暴露在细胞外环境中，宿主细胞保持活力。在这部电影中，两个受感染的巨噬细胞在两个不同的场合建立细胞间的桥梁，将隐球菌细胞从一个巨噬细胞穿梭到另一个巨噬细胞。
观看本视频后，您应该对如何利用数字光学显微镜来观察经历非溶解性胞吐作用和其他宿主病原体相互作用的巨噬细胞有很好的了解。
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概述
本研究展示了一种方法，可以实时可视化巨噬细胞与新型隐球菌的相互作用，重点关注使用数字光学显微镜的非溶解胞外排泄。该技术允许观察被感染的巨噬细胞在24小时内的变化，以捕捉各种胞外排泄事件。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 免疫学
- 微生物学
背景
- 巨噬细胞在对抗病原体的免疫反应中起着至关重要的作用。
- 新型隐球菌是一种可以逃避免疫反应的重要真菌病原体。
- 非溶解胞外排泄是一种巨噬细胞在不发生细胞死亡的情况下排出病原体的过程。
- 数字光学显微镜能够实时可视化细胞过程。
研究目的
- 可视化激活巨噬细胞对新型隐球菌的非溶解胞外排泄。
- 了解巨噬细胞与真菌的相互作用动态。
- 记录感染期间的各种胞外排泄类型。
使用的方法
- 原代骨髓源巨噬细胞被激活并感染真菌细胞。
- 移除细胞外真菌细胞以维持清晰的单层。
- 巨噬细胞在受控环境中孵育24小时。
- 使用数字光学显微镜捕捉并将图像编译成电影。
主要结果
- 成功实现了非溶解胞外排泄事件的实时可视化。
- 在24小时感染期间观察到了各种类型的胞外排泄。
- 该方法提供了对巨噬细胞在真菌感染中反应行为的洞察。
- 数字光学显微镜证明对于研究细胞相互作用是有效的。
结论
- 该技术增强了我们对巨噬细胞与病原体相互作用的理解。
- 非溶解胞外排泄是对新型隐球菌的免疫反应的重要机制。
- 该研究为更广泛的巨噬细胞在感染中的功能知识做出了贡献。
常见问题
Executive Industry Relevance
Visualizing non-lytic exocytosis of Cryptococcus neoformans from macrophages provides mechanistic insight into host-pathogen dynamics that can inform target validation in antifungal discovery. Real-time digital light microscopy enables quantitative tracking of pathogen release events without host cell lysis, supporting phenotypic screening and translational biomarker development. This approach enhances predictive confidence in preclinical models by capturing dynamic interactions missed in endpoint assays.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by visualizing pathogen expulsion mechanisms that leave both host and pathogen viable.
- Operational Value: Enables functional target validation through direct observation of exocytosis events over a 24-hour infection window.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by clarifying whether observed effects stem from lytic or non-lytic pathways.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream antifungal compound screening by establishing baseline exocytosis kinetics.
- Operational Value: Delivers quantitative, time-resolved outputs (e.g., event frequency, timing) suitable for assay standardization and reproducibility.
- Strategic Value: Enhances screening readiness by providing a dynamic readout that distinguishes between cytotoxic and non-cytotoxic mechanisms of action.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease relevance by using primary bone marrow-derived macrophages infected with clinically pertinent Cryptococcus neoformans strains.
- Operational Value: Ensures translational continuity from discovery through preclinical validation by capturing dynamic host-pathogen interactions over time.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by revealing whether test compounds alter exocytosis without inducing macrophage death.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target validation to lead identification, where dynamic visualization of non-lytic exocytosis supports hypothesis testing and biological de-risking before compound progression.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling direct observation of whether pathogens are expelled via lytic or non-lytic mechanisms.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized, reproducible quantification of exocytosis events per macrophage over time.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements (e.g., exocytosis event count, latency) that allow comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by using primary macrophages and pathogenic fungal strains reflective of human infection contexts.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable imaging platform applicable to multiple host-pathogen systems beyond Cryptococcus neoformans.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in host-pathogen interaction studies.
- Operational Value: Promotes standardization and reproducibility through controlled environmental incubation and automated time-lapse imaging.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of compounds that inadvertently trigger lytic pathways and associated inflammation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying molecules that modulate exocytosis without compromising host cell viability.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary macrophage isolation, fungal pathogenesis, and live-cell imaging techniques.
- Dependent on stage-top incubators with precise CO2 and temperature control for 24-hour imaging.
- Necessitates standardized operating procedures for extracellular pathogen washing to ensure clear monolayers.
- Involves adaptation considerations when translating to other macrophage sources or pathogen species.
- Limited by phototoxicity risks over extended imaging periods, requiring optimization of light exposure and frame rate.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:27
Isolation and Preparation of Primary Bone Macrophages from C57/B16 Mice
4:51
Co‐incubation of Primary Murine Macrophages and C. neoformans
6:56
Visualizing Non‐lytic Exocytosis in Real‐time Utilizing Digital Light Microscopy
8:11
Results: Primary Murine Macrophages Undergo Different Types of Non‐lytic Exocytosis of C. neoformans
9:36
Conclusion
