可视化非裂解性胞吐作用 新型隐球菌 使用数字光学显微镜从巨噬细胞中分离

本实验的总体目标是观察新型隐球菌从原代骨髓源性巨噬细胞中的非裂解性胞吐过程。首先，将活化的巨噬细胞接种并用真菌细胞感染，以促进巨噬细胞对新型隐球菌的吞噬和内化。第二步是去除细胞外的真菌细胞，以确保获得一层清晰的感染与未感染巨噬细胞的单层培养物。

接下来，将巨噬细胞置于二氧化碳恒温培养箱中孵育，并连续记录24小时，以捕捉非裂解性外排现象及其他相互作用事件。最后一步是将24小时内获取的所有图像帧压缩生成视频。最终，通过数字光学显微镜对巨噬细胞进行可视化观察，以记录巨噬细胞在24小时感染过程中所经历的各种非裂解性外排类型。

该方法有助于回答宿主-病原体相互作用领域中的关键问题，例如细胞事件的时间进程和定量分析。在实验前一天，选择一个在Sbarro琼脂平板上培养的单个资深工蚁菌落，接种于10毫升Sbarro肉汤培养基中。将培养物在37°C下振荡培养过夜，振荡速度为250 RPM，具体操作参照书面实验方案中关于小鼠安乐死的步骤进行。

用70%乙醇对整个尸体进行消毒。取出两侧股骨和胫骨，并将骨骼置于无菌的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中。然后使用精细的擦拭材料去除多余的组织和肌肉，直至骨骼完全清洁。

将完整的骨骼放入含有70%乙醇的培养皿中，孵育3分钟以灭活相关微生物。取出骨骼并置于含有无菌DMEM的培养皿中。接着，小心剪去骨骼的两端。

将骨骼置于预置在冰上的50毫升MT锥形管上方，使用25号针头将10毫升冷DMEM培养基缓慢灌注通过每根骨骼。随后，在室温下以650 × g离心收集的细胞悬液10分钟。在离心过程中，按照文本方案所述，配制并过滤除菌骨髓巨噬细胞培养用培养基。接着，用10毫升培养基重悬所得沉淀。

将细胞悬液通过70微米细胞筛，以分散细胞团块并去除大块碎片。随后，取1毫升菌株细胞悬液接种于10毫升培养基中，放入指定用于组织培养的培养皿。在37°C、含10%二氧化碳的条件下孵育七天，使细胞贴壁生长。

按照文本方案所述，在实验前一天更换培养基。移除培养基以使巨噬细胞从培养板上脱离，并加入五毫升温和细胞剥离试剂，于37摄氏度孵育细胞5至10分钟。通过轻柔吹打收集巨噬细胞。

将细胞在650 × g条件下离心10分钟，使细胞沉淀，然后用1毫升培养基重悬沉淀。取细胞悬液10 µL，按1:20稀释，加入含有14 mm玻璃底的培养皿中，用血细胞计数板计算巨噬细胞浓度。将浓度为1 × 10⁵的巨噬细胞直接加入内层小室，内室最大容积为200 µL。

注意不要超过此体积。将培养皿置于37摄氏度培养箱中孵育一小时，使细胞贴附于玻璃培养皿表面。随后加入一至二毫升培养基，其中补充脂多糖至终浓度为一毫克每毫升，并加入干扰素γ。

在实验当天，以每毫升500个单位的浓度让细胞过夜孵育。取1毫升过夜接种的G细胞培养物，通过以420 × g离心5分钟收集酵母细胞。为去除培养基和胞外隐球菌产物，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞3次，每次均按前述方法进行离心。将酵母细胞沉淀重悬于1毫升无菌PBS中，进行1:100稀释后，取10微升稀释液加入血细胞计数板，计数细胞数量。

计算感染复数为一至五所需的酵母细胞浓度。将计算出的隐球菌细胞悬液体积加入到1毫升含单克隆抗体18B7的培养基中，抗体终浓度为每毫升10微克。将细胞悬液在室温下孵育5分钟。

接下来，从玻璃培养皿中移除培养基，并用无菌 PBS 清洗巨噬细胞一次。然后直接向孔中加入 100 微升经调理的 cmin，随后在 37 摄氏度、10% 二氧化碳条件下与酵母共孵育 2 小时。共孵育后，通过显微镜检查确认巨噬细胞是否已内化 c eForms；被判定为内化的隐球菌细胞应清晰地位于巨噬细胞内部，如大箭头所示。

较小的箭头指示未感染的巨噬细胞，无真菌细胞。用无菌 PBS 清洗培养皿三次，以去除所有胞外的新型隐球菌。然后加入一到两毫升不含单克隆抗体的培养基，以进行这些实验。

实验前需要准备一台配有孵育室的显微镜，孵育室需具备二氧化碳供给和加热装置。实验前至少将孵育室预热30分钟，温度设为37摄氏度。实验开始时，确保二氧化碳浓度读数为5%。

将玻璃底培养皿放置在显微镜载物台盖上，并打开二氧化碳灯，关闭所有门以确保热量不散失；使用10倍物镜并在相差显微镜模式下，聚焦于感染的巨噬细胞的清晰视野；设置显微镜软件，每4分钟拍摄一张图像，持续24小时。24小时后，实验结束，共采集361张图像。将这些图像以5%压缩率导出为JPEG格式。

使用 ImageJ 软件以每秒五帧的速度将图像作为视觉堆栈进行查看。视频的初始帧显示视野中存在大量巨噬细胞，其中部分未被感染，部分吞噬了数量不等的隐球菌细胞。随着视频的播放，所有细胞均为巨噬细胞，并可见其在视野中移动；在此视频中可以清楚地观察到，隐球菌细胞位于被感染巨噬细胞的内部。

巨噬细胞变得活跃，可见一个酵母细胞，但在FGA区域内，隐球菌细胞随后迅速被排出到周围环境中。第二个被感染的巨噬细胞经历非裂解性外排，更多的酵母细胞被释放到细胞外空间。宿主细胞在隐球菌外排后仍保持活性，表现为其继续运动的能力。

有时，巨噬细胞会以一种促进隐球菌细胞在宿主细胞间转移的方式相互作用。在此过程中，酵母细胞并未暴露于细胞外环境，且宿主细胞保持存活状态。在本视频中，两个被感染的巨噬细胞先后两次形成细胞间连接桥，将隐球菌细胞从一个巨噬细胞转运至另一个巨噬细胞。

观看本视频后，您应能充分理解如何利用数字光学显微镜观察巨噬细胞进行非裂解性胞吐的过程，以及其他宿主与病原体之间的相互作用。