Name: 近红外（NIR）光增加线粒体功能的标志物的表达，在鼠标前庭上皮细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: 探索近红外光对小鼠前庭感觉上皮细胞的神经保护作用，通过非侵入性经颅照射改善线粒体功能。该方法可检测抗氧化基因表达变化，为衰老相关研究提供新思路。

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作者谨此感谢 Paul Witting 博士和 Genevieve Fong 女士在 mRNA 提取和 PCR 实验方面的协助，以及 Garnett Passe 和 Rodney Williams 纪念基金会提供的支持。

伦理声明：以下所述所有操作程序均已获得悉尼大学动物伦理委员会批准。
1. 动物
注意：1 月龄及 8–9 月龄的小鼠（C57/BL6）购自澳大利亚珀斯的动物资源中心。小鼠饲养于悉尼大学的博世啮齿类动物设施中。
<ol>
	<li>标准鼠笼中饲养的家鼠，采用12小时光照/12小时黑暗循环，自由摄食和饮水 随意摄取.</li>
	<li>将每个年龄组的小鼠分为近红外光（NIr）处理组和假处理组（对照组）进行比较。</li>
</ol>
2. 近红外（NIr）照射与假照射处理
<ol>
	<li>使用电动剃刀尽可能贴近皮肤剃除小鼠头部和颈部区域的毛发，以防止在治疗方案完成前毛发快速再生。为维持小鼠的无病原状态，在不同动物间剃毛时，需用70%乙醇清洁器械；来自不同笼子的动物之间则使用F10兽用消毒剂进行消毒。此操作应在治疗开始前2 - 3天进行，以避免对动物造成过度操作。</li>
	<li>通过握住小鼠尾部近端固定其身体，并将其置于单手手掌或实验台面上使其放松，以尽量减少可能引起假性结果的应激反应。</li>
	<li>将近红外（670 nm）LED（发光二极管）设备置于暴露（已剃毛）区域上方1 - 2 cm处，并开启设备照射90秒（图1A）。 
	注意：在100 ml水中测得照射90秒所导致的温度变化为&#60;0.2 °C。</li>
	<li>对假处理组动物重复步骤2.2 - 2.3，但保持设备关闭状态（图1B）。</li>
	<li>对近红外光阻断处理组动物重复步骤2.2 - 2.3，但需用铝箔覆盖设备。</li>
	<li>每日重复步骤2.2 - 2.5&#160;，每次间隔约24小时，连续5天。</li>
	<li>在治疗后第五天，从小鼠双侧耳中提取前庭感觉上皮组织（3个壶腹嵴和1个椭圆囊斑）（见下文第3节）。</li>
</ol>
3. 组织提取20
<ol>
	<li>配制 300 ml 甘油基人工脑脊液（ACSF），其成分如下（单位：mM）：26 NaHCO₃3，11 葡萄糖，250 甘油，2.5 KCl，1.2 NaH2PO4，1.2 MgCl2，以及 2.5 CaCl2. 在加入 CaCl 之前2，用碳合气（95% O₂，5% CO₂）向溶液通气2 和5% CO₂2) 调节pH至7.4，以避免钙沉淀（溶液浑浊）。将溶液置于-80 °C冰箱中冷却45分钟，使形成冰浆。</li>
	<li>在已标记的螺旋盖微量离心管中配制RNA分离裂解缓冲液（可防止在液氮中冻融过程中因管内压力变化导致管盖弹开），具体操作按照制造商说明或实验室常规操作进行。准备好装有液氮的铝制杜瓦瓶。 
	注意：操作液氮时需穿戴防护服和护目镜。确保在通风良好的房间内使用液氮，因其气态体积约为液态时的700倍，可能导致窒息。</li>
	<li>通过腹腔注射氯胺酮（400 mg/kg）使小鼠深度麻醉。待后肢反射完全消失，作为小鼠已充分麻醉的指征。</li>
	<li>用锋利的不锈钢剪刀将小鼠断头，然后使用刀片（圆形#22）沿颅骨矢状面皮肤做切口。自此步骤起及后续操作中 步骤 3.5 - 3.9定期将冰冻的ACSF溶液施加于组织上，以尽可能保持颅骨穹窿、脑组织及下方前庭器官的低温状态。</li>
	<li>使用标准图案剪刀的尖头端在人字缝处的颅骨上做一个小切口，并沿矢状缝剪开。</li>
	<li>将浅口咬骨钳的一侧钳臂轻轻滑入顶骨下方，使钳刃尽可能贴近颅骨内面，但避免拖拽脑组织。固定后，将顶骨向侧方、枕骨向后方移除，直至暴露脑组织。</li>
	<li>使用小型不锈钢刮勺将脑组织从前颅窝和中颅窝抬起，以暴露前庭蜗神经（CN VIII）。切断该神经，以避免对直接支配前庭毛细胞的初级传入轴突产生不必要的张力。</li>
	<li>取出大脑 整体上 在切断前庭蜗神经（CN VIII）后。</li>
	<li>在颅中窝观察包含耳蜗和周围前庭器官的骨迷路。在每个骨迷路旁做两个小切口，握住前半规管并向外侧牵拉，完整切除该结构。</li>
	<li>立即将切除的迷路组织浸入含有冰冻人工脑脊液（ACSF）的解剖培养皿中（具体配制方法见下文描述）。 步骤 3.1）同时持续用碳合气灌注。</li>
	<li>在体视显微镜下，用镊子夹住耳蜗固定迷路，并将其固定在培养皿底部。
	<ol>
		<li>使用直型精细镊子在前半规管（SSC）壶腹上方的骨质上刮出一个小开口。</li>
		<li>轻轻触及骨性结构下方，向外侧快速拨动，以扩大此开口。操作时需格外小心，避免将镊子插入开口过深，以免损伤下方脆弱的膜迷路结构。以此方式继续操作，直至前庭、前半规管壶腹和外侧半规管壶腹均完全暴露。若条件允许，亦可一并去除后半规管壶腹。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用精细镊子轻轻将椭圆囊和壶腹从骨迷路中抬起，直至完全分离。尽可能通过与其相连的半规管进行夹持，以避免损伤感觉上皮。在某些情况下，可能需要用虹膜剪剪开膜性半规管的近端，以使壶腹从骨组织中释放。</li>
	<li>用镊子尖端牢固夹住前庭器官，并放入先前准备好的裂解缓冲液中 步骤 3.2轻轻晃动镊子周围的缓冲液，以确保前庭器官已从镊子上脱落。将镊子置于体视显微镜下观察，确认前庭器官是否已完全脱离。
	<ol>
		<li>拧上微量离心管盖，并立即在液氮中冷冻样品。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. RNA 提取与逆转录 PCR

<ol>
	<li>根据制造商说明书或实验室常用方案，采用标准方法提取信使RNA（mRNA）。 
	注意：本实验方案中使用了一种商业试剂盒，该试剂盒利用载体RNA帮助分离少量mRNA。可使用较小的洗脱体积以提高mRNA的最终浓度。 
	注意：必须同时完成“无酶”阴性对照（NECs）和“无DNA模板”对照（NTCs），以确保所观察效应的有效性。</li>
	<li>采用标准方法将mRNA逆转录为互补DNA（cDNA），并扩增目标基因21-23。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性财务利益。

此处描述的代表性结果表明，与假照光处理的小鼠相比，对老年小鼠进行短暂的经颅近红外光照射（每天90秒，持续5天）足以提高其抗氧化蛋白的表达水平。尽管如大鼠前庭传入神经所报道的那样，发射的热量可能成为线粒体和/或神经元激活的一种来源24 – 我们对近红外LED设备发射的热量的测量结果为 &#60;90秒内温度升高0.2°C，因此不太可能引起此处所述的变化。此外，与上述报告不同，本研究中使用的近红外光治疗并未直接作用于感觉上皮或前庭传入神经元，因此也不太可能影响温度敏感性通道。例如， TRPV4）。最后，先前使用相同近红外设备在其他脑区的研究表明，观察到的差异并非由热效应引起。7,9.
尽管这些结果表明，在基因水平上，细胞对与年龄相关的氧化应激反应出现了上调，但目前尚不清楚这些变化是否在蛋白质水平上进一步表达，更重要的是，是否反映在小鼠整体平衡功能的表现上。此外，所观察到的上调仅针对一种普遍存在的抗氧化剂。该处理方案很可能影响细胞代谢的多个标志物。此外，由于mRNA是从前庭器官中提取的 整体上 (即，...

平衡能力下降及随之而来的跌倒现象在自然衰老过程中十分常见，且不幸地成为老年人群的典型特征1。这种功能衰退不仅带来身体上的影响，也造成社会功能的受限，显著降低了老年人的生活质量。针对这一问题，物理治疗和康复训练一直是防跌倒研究的重点，但其在持续降低反复跌倒发生率方面的效果尚不明确。与此同时，针对外周或中枢前庭系统（负责维持平衡的系统）变化的研究较为匮乏，针对这些系统及其失衡根本原因的潜在治疗策略也十分有限。
年龄相关性神经退行性疾病（包括年龄相关性黄斑变性）的最新研究进展2-4，阿尔茨海默病模型5-8，以及帕金森病9-12 已证明近红外光（NIr）的简单无创应用具有神经保护作用。此外，在前庭系统中，NIr已被用于增强前庭初级传入神经元的活性。 体外13尽管近红外光（NIr）的作用机制尚未完全明确，但大多数使用NIr的研究均提示，NIr可刺激线粒体复合物IV（细胞色素c氧化酶）14-17 以促进细胞代谢。在前庭感觉上皮中，I型毛细胞的皮下板富含线粒体。18 因此可能是近红外光（NIr）治疗的作用位点。
本文介绍了一种简短、无创的经颅近红外光（NIr）治疗方案，可用于检测小鼠前庭感觉上皮中的细胞代谢（从而间接反映线粒体功能）。同时描述了前庭感觉上皮的制备方法，并展示了NIr可增加感觉上皮中一种普遍存在的抗氧化剂（超氧化物歧化酶1，SOD1）的表达——此前研究已证明该蛋白对耳蜗毛细胞的存活具有重要作用19。

<table><tbody><tr><td>Quantum WARP 10</td><td>Quantum Devices</td><td>2070N030-A</td><td></td></tr><tr><td>带螺帽的微量离心管</td><td>Quality Scientific Plastics</td><td>520-GRD-Q</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td>Parnell, 澳大利亚亚历山德里亚</td><td></td><td></td></tr><tr><td>标准图案剪刀</td><td>FST</td><td>14001-12</td><td></td></tr><tr><td>碳素钢外科刀片 #22</td><td>Livingstone</td><td>SBLDCL 22</td><td></td></tr><tr><td>弗里德曼-皮尔逊咬骨钳</td><td>FST</td><td>16221-14</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Leica Microsystems</td><td>A60S</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 SF 镊子</td><td>FST</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Isolate II RNA 微量提取试剂盒</td><td>Bioline</td><td>BIO-52075</td><td></td></tr></tbody></table>

近红外光可提高小鼠前庭感觉上皮中线粒体功能标志物的表达

Near Infrared (NIr) Light Increases Expression of a Marker of Mitochondrial Function in the Mouse Vestibular Sensory Epithelium

针对随年龄增长而出现的平衡功能衰退，目前的干预策略主要集中于物理治疗，包括平衡训练和运动锻炼。然而，这些方法并未解决平衡功能下降的根本原因。本研究利用小鼠评估了近红外光（NIr）对前庭感觉上皮细胞代谢的影响。所获得的数据表明，这种简单且安全的干预手段可能保护这些易受损的细胞免受自然衰老的有害影响。研究人员从分离的周围前庭感觉上皮（壶腹嵴和椭圆囊斑）中提取mRNA，并将其反转录为cDNA文库。随后，通过检测普遍存在的抗氧化基因（SOD-1）的表达水平来评估该文库。抗氧化基因的表达被用于量化细胞代谢活性。通过经颅方式向年轻（4周龄）和年长（8至9月龄）小鼠施加近红外光，并采用短期治疗方案（每天90秒，持续5天），本研究结果提示，仅使用近红外光即可有效改善前庭感觉上皮中的线粒体功能。鉴于目前尚无可用、经济且无创的疗法可用于改善前庭毛细胞功能，外源性近红外辐射的应用为对抗衰老对前庭感觉上皮细胞代谢影响提供了一种潜在策略。

为了比较近红外光（NIr）处理对年轻（4周龄）和年老（8-9个月龄）小鼠的影响，我们检测了接受NIr处理、假处理或NIr阻断的年轻小鼠（n = 16）和年老小鼠（n = 20）中抗氧化酶超氧化物歧化酶1（SOD-1）的表达水平。图2显示，与假处理的年轻小鼠（p &lt; 0.01）和NIr阻断的年轻小鼠（p &lt; 0.01）相比，接受NIr处理的年轻小鼠中经β-actin归一化的SOD-1表达水平显著升高，增幅超过2倍。与NIr阻断的年老小鼠相比，接受NIr处理的年老小鼠SOD-1表达也上调了2倍以上（p &lt; 0.05）。
<img alt="在实验室设置中对小鼠进行荧光成像方法的光学激发实验" src="/files/ftp_upload/52265/52265fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 近红外光（NIr）处理。（A）</str...

线粒体功能障碍是细胞衰老的一个标志。本文采用无创近红外（NIr）治疗来改善衰老小鼠前庭感觉上皮中的线粒体功能。

延缓随年龄增长而出现的平衡功能下降的策略主要集中于物理治疗，包括平衡训练任务及其他……

以下实验的总体目标是研究近红外光对小鼠前庭感觉上皮可能具有的神经保护作用。该研究通过在不同发育阶段对小鼠进行简单、短期的经颅近红外光照射来实现。第二步，解剖经处理小鼠的骨迷路，以分离前庭感觉上皮。接下来，通过逆转录聚合酶链式反应（R-T-P-C-R）检测目标抗氧化基因的表达，以评估该处理对线粒体功能的影响。最后，通过密度测定法评估短时间近红外光处理对小鼠特定抗氧化基因表达的影响。这种近红外光处理技术的主要优势在于其操作简便且无创，可在处理后继续进行后续的生理学、分子生物学及行为学分析。该技术的应用前景包括在正常衰老过程中对周围前庭系统的潜在神经保护作用，或在前庭系统疾病或功能缺损后改善平衡能力。实验开始前两到三天，尽可能贴近皮肤剃除每只小鼠头部和颈部的毛发，以防止在治疗方案完成前动物毛发重新生长。为维持动物的无病原状态，每次剃毛后需用70%乙醇清洁器械。然后，在每次对动物进行处理当天，抓住小鼠尾巴的近端，将其置于一只手的掌心，使其放松，以尽量减少近红外处理组动物的应激反应。对每只动物，将670纳米的LED装置置于脱毛区域上方1至2厘米处，开启装置照射90秒。对于假手术组，以相同方式重复处理操作，但装置保持关闭状态；对于阻断近红外组，处理方式与近红外处理组相同，但需用铝箔覆盖装置。在连续五天内，每隔24小时对每组动物重复一次上述处理后，将新配制的基于甘油的人工脑脊液（A CSF）置于-80摄氏度冰箱中冷冻45分钟，直至形成冰浆。接下来，对每只小鼠，使用22号圆刃剃刀沿颅骨矢状面皮肤做切口，并持续将冰冻的A CSF定期滴加于组织表面，以尽可能保持颅骨、脑组织及下方前庭器官处于低温状态。然后，使用标准剪刀的尖头端在Lambda点处对颅骨做一小切口，并沿矢状缝剪开。然后将浅U形牵开器的一臂轻轻滑至顶骨下方，再将顶骨向外侧牵拉，同时将枕骨向后牵拉，直至暴露脑组织。接着使用小型不锈钢刮匙将脑组织从前颅窝和中颅窝抬起分离。为暴露前庭耳蜗神经，应横断该神经，以避免对直接支配前庭毛细胞的初级传入轴突造成不必要的牵拉张力。然后整体取出脑组织，观察位于颅中窝内包含耳蜗和周围前庭器官的骨迷路。现在在每个骨迷路旁做两个小切口，抓住并向外牵拉前半规管，以切除整个结构。随后立即将切除的迷路浸入含有冰冻人工脑脊液（A CSF）的解剖皿中，并持续用碳氧混合气（carbogen）灌注。该操作中最困难的部分是为每只动物获取数量一致且具有活性的组织，我们建议练习时仔细观察组织，并使用特定的照明。接下来，在体视显微镜下，用镊子夹住耳蜗以固定迷路，并用直头精细镊子将组织固定在培养皿底部。在前半规管上方的骨质处轻轻刮开一个小孔。然后立即伸至该骨性结构下方，向外侧轻弹，远离上半规管，以轻柔扩大开口。以此方式继续操作，直至椭圆囊以及前半规管和外半规管壶腹均完全暴露。随后使用精细镊子轻柔地将椭圆囊和壶腹从骨迷路抬起，直至完全分离。最后，用镊子尖牢固地夹住前庭器官，并将其放入新配制的裂解液中，置于带螺口盖的微量离心管内，轻轻晃动镊子使前庭器官脱离。随后在体视显微镜下确认镊子上无残留组织后，拧紧微量离心管管盖，并立即将样本置于液氮中速冻，以比较近红外处理对年轻与年老小鼠的影响。信使RNA被逆转录为互补DNA，随后通过密度测定法分析抗氧化酶超氧化物歧化酶1（SOD1）的表达。与年轻假处理动物和年轻近红外阻断动物相比，在年轻近红外处理动物中观察到经β-肌动蛋白归一化的SOD1表达量显著增加，增幅超过两倍。与老年近红外阻断动物相比，老年近红外处理动物的SOD1表达也上调了两倍以上。在此基础上，可进一步开展行为学、分子生物学或生理学实验，以回答其他问题，例如：近红外光是否增加前庭感觉上皮中其他基因或蛋白质的表达？或者近红外光能否改善经处理小鼠的整体平衡能力？

near-infrared-nir-light-increases-expression-marker-mitochondrial

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

近红外（NIR）光增加线粒体功能的标志物的表达，在鼠标前庭上皮细胞

携带帕金森病致病基因突变的患者成纤维细胞是一种易于获取的 离体...

利用原代人类成纤维细胞监测帕金森病领域中的线粒体表型

来源：Zhang, L., et al．近红外（NIr）光增强小鼠前庭感觉上皮中线粒体功能标志物的表达．J. Vis.

利用近红外光在小鼠模型中调控感觉神经元信号传导

本视频展示了一种利用临床3 T磁共振扫描仪对 naïve 小鼠视觉投射通路进行增强磁共振成像的方法，并可用于对急性视神经 crush 损伤及敲除小鼠（p50KO）中慢性视神经退行性变开展重复性和纵向的 in vivo...

体内小鼠视神经纤维完整性的对比增强MRI成像

非相干氙灯光源通过窄带干涉滤光片和中性密度滤光片，以向培养细胞递送不同波长和强度的光。该方案用于评估红光/近红外光治疗对活性物质生成的影响...

评估不同波长和强度的红光/近红外光疗法对氧化应激影响的方法 体外

光生物调节疗法是一种创新的非侵入性治疗手段，可用于治疗多种神经系统和精神疾病，同时也能改善健康大脑的功能。本方案提供了通过经颅光照递送在小鼠中实施脑部光生物调节的逐步操作指南，该方法可适用于其他实验啮齿类动物。...

小鼠经颅光生物调节治疗方案

本文介绍一种利用近红外染料结合免疫组织化学与高分辨率扫描，检测脑区蛋白质的实验方案。...

利用近红外荧光与高分辨率扫描检测啮齿类动物脑组织中的蛋白质表达

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利用近红外光谱技术探究婴儿、儿童及成人的认知功能

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Hi-C：一种研究基因组三维结构的方法

探索近红外光对小鼠前庭感觉上皮细胞的神经保护作用，通过非侵入性经颅照射改善线粒体功能。该方法可检测抗氧化基因表达变化，为衰老相关研究提供新思路。

近红外光可提高小鼠前庭感觉上皮中线粒体功能标志物的表达

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