人 Intraepidermal 神经纤维内线粒体三维成像及分析

这种成像和分析技术的总体目标是从复杂信号中分离出特定信息。具体来说，该协议描述了如何用表皮内的其他线粒体可视化和量化神经特异性线粒体。这种方法可以帮助回答神经病学领域的关键问题，例如健康个体表皮内神经纤维内的线粒体与神经系统并发症患者的神经特异性线粒体相比如何。

这种技术的主要优点是我们获取复杂信号并从中提取特定信息。该协议可帮助我们将特定信号（例如这些吸管中的信号）与周围的信号隔离开来。首先根据此示意图标记 96 孔板，准备皮肤活检的荧光免疫组织化学染色。

然后移液 150 μL 原液信号增强剂溶液，以减少二抗与顶行每个孔中的非特异性结合。通过在 96 孔板的第 2 行和第 3 行的每个孔中加入 150 微升 1x 磷酸盐缓冲盐水来制备冲洗孔。然后将 150 微升 5% BSA 封闭溶液加入第 4 行的孔中。

在 1， 500 μL 的 1%BSA 冲洗液中稀释一抗 PGP9.5 和 PDH，并在第 5 行的每个孔中加入 150 μL。使用接种环将切片转移到第一行的信号增强剂溶液中。切片进入第 5 行的一抗溶液后，用实验室薄膜紧紧包裹板以防止蒸发，然后在室温下在平板摇床上搅拌样品 1 小时。

在 4 摄氏度下摇动孵育过夜。通过将 150 微升 1% BSA 冲洗溶液移液到 96 孔板第 6、7 和 8 行的孔中，开始程序的第二天。将荧光团偶联的二抗添加到 1， 500 μL 的 1% BSA 中。

然后将 150 μL 二抗溶液移液到第 9 行的每个孔中。通过第 6 、 7 和 8 口井冲洗切片。切片进入第 9 行的二抗溶液后，用封口膜包裹板并用铝箔覆盖以保护荧光信号。

像以前一样用摇动孵育。第三天，将 150 微升无菌过滤的 1x PBS 移液到第 10、11 和 12 行。将样品转移到第 10 行，然后用铝箔覆盖板。

在室温下摇晃冲洗 1 小时。接下来，通过将 50 微升过滤的 1x PBS 移液到载玻片上，准备用于安装切片的显微镜载玻片。冲洗完成后，将第 12 行的切片转移到玻片上，然后在切片顶部直接添加一到两滴含有 DAPI 的封片试剂。

轻轻地将 50 毫米 x 24 毫米 1.5 显微镜玻璃盖玻片放在切片上。将载玻片在室温下避光过夜，以固化封固剂，然后再储存载玻片或对载玻片进行成像。在倒置激光扫描共聚焦显微镜上选择 40X 油浸物镜。

选择合适的激光器和检测器对细胞核、神经纤维和线粒体进行成像。在显微镜软件中输入以下扫描参数，12 位强度分辨率，扫描速率为 500 赫兹，两帧平均，缩放为 2.2。通过选择 1024 x 1024 的扫描分辨率，设置显微镜软件以优化横向分辨率。

通过选择一个空气单元的共聚焦孔径，Z 步长为 210 纳米，优化轴向分辨率和光学切片。分别扫描每个信号并调整检测器电压和偏移量，以去除任何过度饱和和不足饱和的像素。激活神经信号的实时扫描并调整 Z 焦点控制，以在显微镜软件中查找和设置包含组织切片内神经信号的上下焦平面。

使用顺序扫描扫描最终的 Z 系列，以消除荧光信号串扰。通过使用选择工具在原始图像的复制图像上绘制表皮周围的区域，将表皮与角质层和真皮隔离开来。然后将图像裁剪为选区。

使用计算扩散函数功能计算绿色和红色荧光共聚焦信号的点扩散函数。然后将油的中等折射率参数设置为 1.515，将 40 倍油物镜的数值孔径设置为 1.25。将检测器针孔设置在一个空气单元上，并选择激光激发波长。

使用设置为 100% 置信度的迭代恢复，迭代限制为 10 个周期，以及绿色和红色 PSF 用于绿色和红色荧光信号的去融合。使用 create surface （创建表面） 工具在反卷积神经信号周围制作一个表面，选择 uncheck 平滑 feature， 绝对强度阈值， 下限阈值 3， 000 和上限阈值 65， 535。将表面保持在 10 个体素以上。

使用神经表面中的编辑选项卡选择单个非神经表面，或按住 Ctrl 键选择多个非神经表面，从而删除非神经表面。按 Delete 按钮删除选定的非神经表面。使用神经表面中的 edit （编辑） 选项卡，然后按 mask （掩码） 属性中的 mask all （全部掩码） 按钮。

在新窗口中，选择通道选择下的通道 5 mitochondria deconvolved （通道 5 mitochondria deconvolved），然后在应用掩码之前选中 duplicate channel（复制通道）。按下 constant inside/outside 的单选按钮，将 set voxels outside surface （设置的体素外部表面） 设置为 0.0，然后按 OK 按钮。最后，使用创建表面工具创建线粒体特异性表面，通过选择取消选中平滑功能并使用背景减法进行阈值化，在掩蔽的反卷积线粒体信号周围制作一个表面。

将最大球体的直径设置为 1.50 微米，将阈值下限设置为 2， 000，将阈值上限设置为最大值 65， 535。确保将表面保持在 1.0 体素以上。这张具有代表性的 3D 共聚焦显微镜图像说明了神经特异性绿色荧光信号。

神经信号创建以青色显示的 3D 表面。然后通过使用神经表面作为掩蔽工具，将神经特异性线粒体信号从其余的表皮线粒体信号中分离出来。由此产生的神经特异性线粒体红色荧光信号用于创建神经表面内线粒体周围显示为洋红色的表面，以青色显示。

这样可以详细地看到神经纤维中的线粒体。在这里，线粒体表面数据以大小频率直方图的形式呈现，以根据其体积可视化存在于每个不同弯曲中的线粒体的百分比。在尝试此程序时，在染色过程中照顾组织非常重要，以确保组织完全浸没在溶液中，从而在整个切片中提供均匀一致的染色。

观看此视频后，您应该对如何可视化和量化人类表皮内神经纤维内的线粒体有很好的了解。我们的详细方案旨在教其他研究人员如何对人体皮肤活检进行染色、成像、处理和分析，目的是了解基于线粒体的神经系统疾病（如神经病变）发病机制的潜在机制。