Name: 关联特定基因的DNA甲基化与表达的变化和星形胶质细胞的转录活性 KCNJ10（Kir4.1） (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: 探索星形胶质细胞中KCNJ10基因的DNA甲基化状态及其与转录活性的关联。本研究采用甲基化敏感高分辨率熔解分析和荧光素酶检测技术，为神经科学和表观遗传学研究提供有效方法。

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本工作由 R01NS075062-01A1 项目资助。FACS 分选在阿拉巴马大学伯明翰分校综合流式细胞术核心实验室（P30 AR048311，P30 A1027767）完成。阿拉巴马大学伯明翰分校神经生物学核心实验室的 Scott Philips 博士和阿拉巴马大学伯明翰分校 CDIB 的 Susan Nozell 博士在荧光素酶检测的技术环节提供了协助。

所有动物操作均遵循美国国立卫生研究院的指导原则。动物使用已获得阿拉巴马大学伯明翰分校动物护理与使用委员会的批准。
1. 利用全脑组织中星形胶质细胞的荧光激活细胞分选（FACS）获取富集星形胶质细胞群体的RNA和DNA
<ol>
	<li>用CO₂麻醉动物2 1 分钟后迅速断头处死，按 Albuquerque 所述方法分离皮层 等人，26；无需去除软脑膜。 
	注意：由 Itakura 构建了在 S100β（星形胶质细胞标志物）启动子驱动下表达 eGFP 的转基因大鼠。 等27 用于星形胶质细胞的FACS分选。</li>
	<li>使用木瓜蛋白酶解离试剂盒在非无菌条件下按照制造商方案制备全脑匀浆。将木瓜蛋白酶在37 °C水浴中加热活化10分钟。注意：木瓜蛋白酶溶液由制造商提供，含有L-半胱氨酸和EDTA（见材料表）。
	<ol>
		<li>在50 ml锥形管顶部切割或打磨出一个孔，以便让输送95%O₂/5%CO₂混合气体的管路穿过25% CO₂2 装入封闭的锥形管中（图1A）。将分离的皮层组织置于含有解离培养基（MEM 添加 20 mM 葡萄糖和青霉素/链霉素（500 U/ml），并平衡至 95% O₂25% CO₂2）并使用洁净的剃须刀片将组织切成 1 x 1 mm 的碎块2 块。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用10 ml转移组织&#160;手动移液器将溶液转移至含有木瓜蛋白酶溶液的50 ml锥形管中。在排液前，让组织沉降到移液管底部，以尽量减少解离液的带入量。保持木瓜蛋白酶溶液与95% O₂平衡25% CO₂2 通过表面气体交换维持孵育全过程。切勿向木瓜蛋白酶溶液中通气。将组织孵育20分钟&#160;在37 °C水浴中。</li>
	<li>孵育于木瓜蛋白酶溶液后，用10 ml移液管吹打组织10次&#160;以慢速使用移液管转移。将浑浊的细胞悬液在1,000 x g下离心5分钟。&#160;室温下
	<ol>
		<li>通过表面气体交换平衡脱氧核糖核酸酶/白蛋白抑制剂溶液（由生产商提供），并将细胞沉淀重悬于3 ml脱氧核糖核酸酶/白蛋白抑制剂溶液中。按照生产商说明书制备商用不连续密度梯度液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在1,000 × g条件下离心6分钟，进行不连续密度梯度分离。用移液器吸取管底沉淀，收集解离的细胞。</li>
	<li>将解离的细胞重悬于 2–3 ml 含 0.02% 牛血清白蛋白和 1 mg/ml DNase 的 DPBS 溶液中，或使用偏好的 HEPES 缓冲培养基。在进行 FACS 前，经 40 µm 滤膜过滤。图2A将细胞置于冰上直至分选。
	<ol>
		<li>进行 FACS28.</li>
		<li>在1.5 ml离心管中以2,000 × g离心5分钟收集细胞&#160;4 °C下 
		注意：离心获得的星形胶质细胞可立即使用，或保存于 -80 °C 直至进行 DNA 提取。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用首选的分离方法提取 RNA 和 DNA 2930通过分光光度计和生物分析仪评估RNA和DNA的浓度与质量 31. 
	注意：后续步骤中仅使用高质量的RNA和DNA，其260/280比值分别为2.0–2.2和1.8–1.9。必须通过Bioanalyzer分析评估RNA降解或DNA片段化情况。RNA或DNA可立即使用，或分别储存于-80 °C或-20 °C用于后续研究。</li>
</ol>
2. 使用甲基化敏感高分辨率熔解分析（MS-HRMA）评估基因的DNA甲基化状态
<ol>
	<li>将感兴趣的基因序列输入首选的在线甲基化图谱分析软件，以鉴定该基因中是否存在CpG岛32。
	<ol>
		<li>针对经亚硫酸氢盐转化的DNA序列设计引物33，并根据制造商说明书使用首选的DNA聚合酶进行扩增。通过在100 V电压下运行1%琼脂糖DNA凝胶电泳45分钟，验证扩增产物大小。将引物以20 µM的储存浓度保存于-20 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对每个样本500–1,000 ng的DNA以及来自相同动物物种、甲基化水平为0–100%的甲基化DNA标准品进行亚硫酸氢盐转化34。洗脱样本以获得20 ng/µl的浓度。通过分光光度计测定亚硫酸氢盐转化后DNA的浓度31。</li>
	<li>使用首选的DNA聚合酶和浓度为5 µM的引物，按照表1和表2设置20 µl的MS-HRM扩增反应体系。所有样本（包括FACS分离的DNA和甲基化标准品）均需设置三个重复。</li>
	<li>根据所用分析软件的要求，在熔解曲线相变区域前后设定起始和终止参数。设定预熔解起始和预熔解终止参数，使两者之差为0.2–0.5 °C；同样设定后熔解起始和后熔解终止参数。提取每个样本的峰值温度差数据。</li>
	<li>利用已知甲基化百分比标准品（y值）及其对应的平均峰值温度差（x值），建立线性回归方程（图3A-B，表3-4）。使用该线性回归方程估算未知样本的甲基化状态35。</li>
</ol>
3. 利用荧光素酶检测评估高甲基化启动子活性
<ol>
	<li>鉴定目标基因的CpG岛（步骤2.1）。PCR扩增目的区域 36 并克隆至上游 luc2 萤火虫荧光素酶报告基因用于构建CpG岛-luc2质粒 37.</li>
	<li>通过限制性内切酶消化线性化30 µg CpG-island-luc2质粒 38验证限制性酶切位点，使用首选的酶切分析软件避免重复切割 38根据制造商说明书，在消化后于适当温度和时间下热失活酶。线性化步骤中DNA的损失极小。</li>
	<li>使用CpG甲基化酶（M.SssI）在30 °C条件下对线性化质粒进行过夜甲基化处理，或根据试剂盒说明书进行未处理对照，但需遵循以下调整步骤。</li>
	<li>进行50 µl的反应体系。</li>
	<li>使用5单位的CpG甲基化酶对700 ng线性化质粒进行甲基化。</li>
	<li>过夜反应13-19小时。</li>
	<li>CpG甲基化酶反应后，按照制造商说明书，使用标准的市售硅胶膜DNA纯化试剂盒进行DNA纯化。CpG甲基化酶反应后常发生显著的DNA损失，损失率为30%–60%。</li>
	<li>通过Hpa II限制性消化验证质粒的甲基化状态。</li>
	<li>取1 µg甲基化或非甲基化DNA，用Hpa II进行限制性消化反应1小时&#160;在37 °C下进行。每1 µg DNA使用5-10单位的Hpa II。Hpa II消化完成后，采用常用的商业化硅胶膜DNA纯化试剂盒进行DNA纯化。将CpG甲基化和非甲基化的质粒同时在TAE或TBE缓冲液中以1%琼脂糖DNA凝胶于100 V电泳45分钟&#160;用于可视化（图4B).</li>
	<li>对甲基化和非甲基化的质粒分别进行双酶切消化，使用适当的限制性内切酶释放全长的 luc 2（载体）片段和 CpG 岛（插入片段） 38过夜进行双酶切反应，温度按酶的最适条件设置，消化完成后根据制造商说明书热失活酶。双限制性酶切过程中DNA浓度的损失极小。</li>
	<li>在1% DNA琼脂糖凝胶中以100 V电压电泳1小时，对双酶切质粒进行检测&#160;以实现载体与插入片段的分离（图4C）。注意：佩戴防护性紫外面罩，将DNA凝胶置于台面式紫外灯上以观察条带。根据大小，使用洁净的手术刀切下甲基化和非甲基化的插入片段以及非甲基化的载体。</li>
	<li>使用饱和酚（pH 6.6）从凝胶中提取DNA。简而言之，称量含有载体或插入片段的DNA凝胶，每0.1克DNA凝胶使用100 µl酚。使用玻璃Dounce匀浆器在酚中匀浆DNA凝胶。</li>
	<li>加入氯仿（用量为酚体积的1/5），振荡样品20秒。室温孵育2–3分钟。4 °C、最大速度（16.1 × 1,000 × g）离心15分钟。</li>
	<li>去除水相，加入0.1倍体积的3 M乙酸钠和2.5倍体积的乙醇。在-80 °C下孵育样品1小时。孵育结束后，去除乙醇，并将DNA重新悬浮于30 µl所需的缓冲液中。在插入片段和载体纯化后，DNA会有显著损失，损失率为30–50%。</li>
	<li>使用T4 DNA连接酶将甲基化和非甲基化的插入片段重新连接至非甲基化的载体 38使用1:4的载体与插入片段比例进行连接反应。根据制造商说明书设置反应体系，总体积为50 µl，于-20 °C或置于冰桶中加盖冰上孵育过夜。</li>
	<li>连接反应后，使用优选的市售硅胶膜纯化试剂盒进行DNA纯化。连接反应后DNA损失显著，大约损失30-50%的DNA。通过在1%琼脂糖DNA凝胶中以100 V电泳45分钟验证重新连接情况&#160;并评估重新连接的质粒的浓度（图4D).</li>
	<li>使用商品化转染试剂，按照生产商说明书将甲基化或非甲基化质粒转染至D54细胞中。将D54细胞以0.14 x 10⁶密度接种于12孔板中。6 细胞/孔</li>
	<li>转染24小时后，用相同浓度的以下任一种质粒转染细胞：(1) 非甲基化CpG-luc2质粒 + Renilla或其他对照荧光素酶载体；或(2) 甲基化CpG-luc2质粒 + Renilla或其他对照荧光素酶载体。</li>
	<li>让细胞转染24小时&#160;在进行双荧光素酶报告基因检测前，按照试剂盒说明书进行操作。使用化学发光仪检测，每个孔做三个复孔读数。</li>
	<li>计算比值 萤火虫 荧光素酶活性至 海肾 或其他对照荧光素酶活性。对甲基化进行归一化处理 萤火虫：对照 荧光素酶活性至非甲基化 萤火虫：对照 通过将甲基化荧光素酶活性除以非甲基化荧光素酶活性来计算荧光素酶活性</li>
</ol>

作者无披露信息。

本方案描述了通过流式细胞分选（FACS）分离富集星形胶质细胞群体的方法，以及一系列可用于研究DNA甲基化与基因表达之间相关性及因果关系的技术。这些技术可单独或联合使用，特别适用于研究细胞异质性较高的组织，或关注特定基因或基因区域的DNA甲基化状态而非全基因组DNA甲基化变化的实验室。研究中枢神经系统（CNS）表观基因组的一个相对独特的挑战在于细胞群体的多样性。由于目标基因在中枢神经系统中可能以时空特异性的模式在不同水平上表达，使用整体组织常会导致转录和DNA甲基化研究的数据混杂不清。
Kir4.1 作为目标蛋白，在星形胶质细胞、少突胶质细胞和室管膜细胞中具有时空特异性的调控表达13,14,40-47。因此，使用 eGFP-S100β 转基因动物27进行 FACS 分选可富集得到更高纯度的星形胶质细胞群体15，从而更准确地评估该细胞群体中特异的基因转录水平和 DNA 甲基化状态。尽管具有这一优势，采用 FACS 分选的星形胶质细胞仍面临若干挑战。为进行 FACS 而制备单细胞悬液需要对完整组织进行显著的机械解离，并经历...

表观遗传学是研究能够影响基因组转录活性的化学修饰的学科。本质上，在不改变DNA序列的情况下，DNA甲基化、组蛋白乙酰化和组蛋白甲基化等表观遗传修饰足以可逆地改变基因表达模式1。其中，DNA甲基化是基因表达的一种强有力调控机制，也是目前研究最为清楚的表观遗传修饰。DNA甲基化是指甲基基团共价结合到胞嘧啶的C5位点上，通常发生在胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸（即CpG位点）中的胞嘧啶上。含有高密度CpG位点的区域被称为CpG岛（CGIs）。CGIs通常与转录起始位点（TSS）和基因启动子区域相关联1-3。因此，尽管CGIs处DNA甲基化的变化并不总是伴随细胞表达或功能的改变，但CGIs处的DNA甲基化变化仍可对转录活性产生强有力的调控作用2。
历史上，DNA甲基化被认为在胚胎发生、基因组印记和发育过程中至关重要，而在有丝分裂后的细胞中，DNA甲基化水平的变化较小（癌症相关基因的改变除外）4,5。然而，神经表观遗传学领域揭示了DNA甲基化在非发育过程中的重要作用。具体而言，认知表观遗传学将DNA甲基化重新定义为一种高度可塑的机制，该机制在介导学习与记忆过程中关键基因的转录激活和抑制方面发挥核心作用6。除认知表观遗传学外，模拟缺血性损伤和神经病理性疼痛的研究也表明，DNA甲基化是一种不稳定的机制，能够快速响应多种中枢神经系统（CNS）损伤7-9。关于星形胶质细胞，多项证据表明DNA甲基化在星形胶质细胞生成（astrogliogenesis）中发挥重要作用。Fan et al. 发现，在神经前体细胞（NPCs）中条件性敲除DNMT1会导致星形胶质细胞过早发育，并伴随整体低甲基化状态10。此外，Perisic et al. 得出结论，GLT-1启动子区域DNA甲基化水平的差异介导了皮层与小脑中谷氨酸转运体表达水平的不同，强调了DNA甲基化在建立脑区特异性星形胶质细胞基因表达模式中的作用11。总体而言，大量研究强调了DNA甲基化在中枢神经系统中的动态和不稳定特性，环境因素、药物和损伤均已被证明可改变DNA甲基化水平，并常常影响基因表达4,9。这些神经表观遗传学研究共同表明，DNA甲基化是一个可行的治疗靶点，具有缓解多种中枢神经系统病理状态的潜力。
随着表观遗传学领域对DNA甲基化在神经发育和疾病中作用的理解不断深入，将DNA甲基化推向治疗靶点所面临的关键挑战在于：不仅要开展相关性研究，更要进行因果性研究，以明确特定的基因靶点和位点。此外，针对脑区和细胞类型特异性的DNA甲基化变化进行系统分析，仍是神经表观遗传学领域持续存在且具有重要意义的独特挑战。本实验方案结合多种技术，包括星形胶质细胞的荧光激活细胞分选（FACS）、甲基化敏感性高分辨率熔解分析（MS-HRM）以及甲基化荧光素酶报告基因检测，用于研究KCNJ10基因的DNA甲基化状态。KCNJ10基因编码Kir4.1蛋白。Kir4.1是一种胶质细胞特异性的钾离子通道，在中枢神经系统（CNS）中表现出脑区和细胞类型的特异性表达模式12-16。从头端到尾端的CNS区域，Kir4.1的表达水平逐渐升高，其中在脊髓中的表达最高15。尽管该通道在室管膜细胞、少突胶质细胞及其前体细胞中均有表达，但其主要在星形胶质细胞中表达，并被认为对于维持钾离子的稳态水平至关重要，同时通过将星形胶质细胞的静息膜电位维持在超极化的-80 mV水平，支持谷氨酸的摄取12,16-19。重要的是，Kir4.1的表达在发育过程中以及多种中枢神经系统损伤后并非静态不变20-25。我们希望探究该通道在发育过程中特别是在星形胶质细胞中的表观遗传调控机制。所采用的技术可实现对特定基因及靶向CpG位点的分析，为DNA甲基化调控KCNJ10基因表达的作用提供因果性证据。这些技术也可应用于其他基因的研究。

<table><tbody><tr><td>木瓜蛋白酶解离系统</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LK003150</td><td></td></tr><tr><td>AllPrep DNA/RNA Mini试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>80204</td><td></td></tr><tr><td>甲基化引物设计软件</td><td>Applied Biosystems</td><td>online</td><td>用于定位CpG岛的软件</td></tr><tr><td>EZ DNA甲基化试剂盒</td><td>Zymo Research</td><td>D5001</td><td></td></tr><tr><td>大鼠预混校准标准品</td><td>EpiGenDx</td><td>80-8060R-Premix</td><td></td></tr><tr><td>CpG甲基转移酶（M.Sssl）</td><td>Zymo Research</td><td>E2010</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick凝胶回收&amp;nbsp;</td><td>QIagen</td><td>28704</td><td>用于凝胶回收和DNA纯化</td></tr><tr><td>限制性内切酶</td><td>New England BioLabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NEB cutter</td><td>New England BioLabs</td><td>online</td><td>验证限制性酶切位点</td></tr><tr><td>双荧光素酶报告基因检测系统</td><td>Promega</td><td>E1910</td><td></td></tr><tr><td>Luc2载体，pGL4.10</td><td>Promega</td><td>E6651</td><td></td></tr><tr><td>海肾荧光素酶载体，pGL4.74</td><td>Promega</td><td>E2241</td><td></td></tr><tr><td>TD-20/20 发光仪</td><td>Turner Designs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine LTX及Plus转染试剂</td><td>Life Technologies</td><td>A12621</td><td></td></tr><tr><td>苯酚，饱和pH 6.6/6.9</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 17501-100</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000/2000c 分光光度计</td><td>ThermoScientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MeltDoctor预混液</td><td>Life Technologies</td><td>4415440</td><td></td></tr><tr><td>高分辨率熔解（HRM）软件v2.0</td><td>Life Technologies</td><td>4397808</td><td></td></tr><tr><td>AB SDS软件v2.3</td><td>Life Technologies</td><td>online</td><td></td></tr><tr><td>AB高分辨率熔解分析入门指南&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>online</td><td></td></tr><tr><td>AB 7900HT快速实时定量PCR系统</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

关联星形胶质细胞 kcnj10（kir4.1）基因特异性 dna 甲基化变化与其表达及转录活性

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 (Kir4.1)

DNA甲基化通过将甲基共价连接到胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸中胞嘧啶的C5位点，从而调控基因表达。尽管DNA甲基化可导致基因表达发生持久且稳定的改变，但其甲基化模式和水平也会因多种信号和刺激而发生变化。因此，DNA甲基化作为基因表达的一种强大而动态的调控机制发挥作用。神经表观遗传学的研究揭示了多种生理和病理状态与全基因组范围及特定基因的DNA甲基化改变相关。具体而言，在神经精神疾病和神经退行性疾病中、突触可塑性过程中以及中枢神经系统（CNS）损伤后，基因表达变化与DNA甲基化之间存在显著的相关性。然而，随着神经表观遗传学领域对DNA甲基化在中枢神经系统生理功能中作用的理解不断深入，明确基因表达与DNA甲基化变化之间的因果关系至关重要。此外，就更广泛的神经科学领域而言，不同脑区和细胞类型之间存在广泛差异，因此在研究转录组、蛋白质组和表观基因组时，需要采用能够应对这些差异的技术。本文描述了通过FACS分选皮层星形胶质细胞，从而实现对RNA转录和DNA甲基化进行后续分析的方法。此外，我们详细介绍了检测DNA甲基化的技术——甲基化敏感性高分辨率熔解分析（MS-HRMA），以及荧光素酶启动子活性检测方法。通过结合使用这些技术，不仅能够探究DNA甲基化与基因表达之间的相关性变化，还可直接评估特定基因区域的DNA甲基化状态改变是否足以影响其转录活性。

通过FACS分选eGFP-S100β转基因动物获得富集的星形胶质细胞群体27。由于出生后第50天（p50）以上动物所分离的细胞及分子质量逐渐下降，因此p0-p40日龄的动物最适合此类实验。本实验使用皮层组织，每次实验将2至6只动物的皮层组织合并收集。FACS分选在阿拉巴马大学伯明翰分校综合流式细胞术核心实验室进行，使用BD公司的FacsAria II仪器完成分选。eGFP的激发采用488 nm激光，无需补偿调节。根据前向散射和侧向散射信号设定门控以选择目标细胞群体（图1B）。使用溴化乙锭作为死细胞标记物来确定活细胞群体并进行门控（图1C）。根据eGFP表达水平可观察到两个不同的细胞群体（图1D）。通过经验性验证，eGFP信号较强的细胞群体被确认为eGFP阳性细胞群体（图1F-F''）。对eGFP信号较弱的第二个群体进行显微观察，发现其为表达eGFP但无细胞核的细胞碎片，可能来源于星形胶质细胞突起的残余物（图1G-G''）。图中展示了组织解离后、分选...

DNA甲基化能够维持基因表达的稳定水平，同时也能在多种刺激条件下介导基因表达的动态变化。本文详细介绍了用于研究DNA甲基化在特定基因上的变化及其对基因表达影响的技术方法。

关联星形胶质细胞 KCNJ10（Kir4.1）基因特异性 DNA 甲基化变化与其表达及转录活性

DNA甲基化通过将甲基共价连接到胞嘧啶的C5位点，从而在...中调控基因表达

本实验的总体目标是评估富集的星形胶质细胞群体中 KCNJ10 的 DNA 甲基化状态，并将启动子区域的 DNA 甲基化变化与转录活性的变化相关联。该目标通过以下步骤实现：首先通过流式细胞分选技术从整个啮齿类动物脑组织中分离出富集的皮层星形胶质细胞群体，随后从该富集的星形胶质细胞群体中提取 DNA。然后采用甲基化敏感的高分辨率熔解曲线分析（MS.HRMA）来评估 KCNJ10 的 DNA 甲基化状态。最后，KCNJ10 启动子呈现高甲基化状态，通过荧光素酶报告基因检测（luciferase assay）来分析启动子区 DNA 甲基化水平的变化与转录活性之间的相关性。最终，采用 MS-HRMA 和荧光素酶报告基因检测来测定 KCNJ10 的 DNA 甲基化状态，并分析启动子甲基化水平变化与基因转录活性之间的关联。本实验操作流程将由我实验室的一名博士后研究员进行演示。所有动物实验均依照美国国立卫生研究院（NIH）实验动物护理与使用指南进行，并经阿拉巴马大学伯明翰分校动物护理与使用委员会批准。所有缓冲液和试剂均按照文字方案配制。根据文字方案，从安乐死动物头部解剖出皮层后，在50毫升锥形管顶部切割或使用磨具钻孔，以便将管路插入管内，然后向管中加入木瓜蛋白酶溶液。将解剖得到的皮层组织置于含有已平衡至95% O2与5% CO2的解离液的10毫米培养皿中，使用洁净的剃刀将组织切成1毫米×1毫米大小的碎块。用10毫升移液器将组织转移至含有pepase溶液的50毫升离心管中。在排出液体前，让组织在移液器内充分沉降至管底。为尽量减少解离介质的残留量，同时避免胰蛋白酶溶液产生气泡，在37摄氏度水浴中孵育20分钟期间，通过表面气体交换持续通入95% O₂与5% CO₂的混合气体。孵育结束后，使用10毫升移液管缓慢吹打组织10次，随后将浑浊的细胞悬液在室温下以300 G离心5分钟。通过表面气体交换平衡DNA酶-白蛋白抑制剂溶液，并将沉淀的细胞重悬于3毫升该溶液中。然后按照生产商的说明制备商用的不连续密度梯度。以70 G离心6分钟。接着用移液器吸取管底的解离细胞，去除培养基。使用2至3毫升含0.02%牛血清白蛋白及每毫升1毫克DNA或选用的培养基。为重复使用，悬浮已解离的细胞。在按照文本方案进行流式分选以及DNA或RNA提取前，需将细胞通过40微米滤膜过滤。针对亚硫酸氢盐转化的DNA序列设计引物后，按照文本方案进行DNA扩增：使用优选的DNA聚合酶和5微摩尔引物，对每个样本的500至1000纳克DNA以及来自相同动物物种、甲基化程度从0%到100%的甲基化DNA标准品进行亚硫酸氢盐转化。设置20微升反应体系用于Ms-HRM扩增。根据此表格，将所有样本（包括样本DNA和甲基化标准品）每个设置三个复孔进行运行，具体参数依据分析软件的要求设定熔解曲线相变区域前后的起始与终止参数。设定预变性起始和预变性终止参数，两者之间的温差为0.2至0.5摄氏度。以相同方式设定变性后起始和终止温度，并利用不同甲基化百分比的标准品及其对应的峰值温度差，提取每个样本的峰值温度差数据。生成线性回归方程。在确定感兴趣的CpG岛并根据文本方案扩增和克隆CpG岛Luke两个质粒后，使用该线性回归方程估算未知样本的甲基化状态。使用首选的限制性内切酶分析软件验证限制性消化位点，以避免双重切割，并在样本经适当酶消化后，将30微克质粒线性化。在50 µL反应体系中，于适当温度和时间条件下热失活酶。使用5个单位的CPG甲基化酶，在30 °C下对700 µg线性化质粒进行甲基化，反应时间为13至19小时。按照文本方案中的步骤纯化DNA后，取一微克甲基化DNA样品，在37摄氏度下孵育一小时，进行HPA两种限制性酶切消化。纯化DNA后，将样品在1%琼脂糖凝胶中以100伏电压电泳45分钟，以便观察。接下来，将甲基化和非甲基化的质粒用相应的限制性内切酶进行过夜双酶切消化，以释放全长Luke2载体和CPG岛片段。消化完成后，对酶进行热灭活。将双酶切的样品在1%的琼脂糖凝胶中以100伏电压电泳运行一小时，以分离载体和插入片段；然后在佩戴防紫外线护具的条件下，将凝胶置于紫外灯下，使用洁净的手术刀切下甲基化和非甲基化的插入片段。根据文本方案进行DNA胶回收后，使用T4 DNA连接酶，按载体与插入片段1:4的比例，将甲基化和非甲基化的插入片段连接至非甲基化载体中。连接完成后，在-20摄氏度或冰上孵育过夜。用1% DNA琼脂糖凝胶电泳检测样品，纯化DNA并验证重连接效果，评估重连接质粒的浓度。在12孔板中接种CD54细胞，每孔140,000个细胞。24小时后，使用商用转染试剂，将等浓度的非甲基化CPG环状质粒加RAN vanilla或其它对照载体，或甲基化cpg Luke质粒加ELLA或其它对照荧光素酶载体转染入细胞。转染24小时后，进行荧光素酶活性检测。根据制造商的说明，使用光度计对每个孔进行三次重复读数。计算萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶或其他对照的比值。荧光素酶活性。通过将甲基化的荧光素酶活性除以非甲基化的荧光素酶活性，对甲基化的海肾荧光素酶对照活性进行归一化处理。如本实验所示，通过流式分选E-G-F-P-S 100 beta转基因动物，获得了富集的星形胶质细胞群体。根据前向散射和侧向散射设定门控目标群体，并使用溴化物死细胞指示剂确定活细胞群体。此处所示门控图像为解离后、分选前及分选后的EGFP阳性星形胶质细胞代表性图像。该图显示了一个分离出的EGFP阳性细胞群体，其星形胶质细胞特异性标志物的mRNA水平提高了40倍。LDH 一 L 一。此外，尽管 OPCs 和星形胶质细胞共同表达 S100β 和 NG2，但观察到 NG2 mRNA（少突胶质前体细胞的标志物）减少了四倍，表明已成功分离出富集的星形胶质细胞群体。该表格列出了从不同年龄和数量的动物中分离得到的总 RNA 和 DNA，可作为参考，用于评估后续实验中分子产物的预期得率。最后，通过将甲基化插入片段转移至非甲基化载体后，采用双荧光素酶报告基因检测来评估目的基因高甲基化区域的转录活性。使用仅切割非甲基化DNA的HPAⅡ酶来验证质粒的甲基化状态。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用FACS分离富集的星形胶质细胞群体，以及如何检测基因的DNA甲基化水平，并通过甲基化敏感高分辨率熔解曲线分析和荧光素酶报告基因检测，分别将启动子区DNA甲基化的改变与转录活性相关联。

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科研

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Biology

生物学

关联特定基因的DNA甲基化与表达的变化和星形胶质细胞的转录活性<em&gt; KCNJ10</em&gt;（Kir4.1）

本文展示了一种用于研究生命早期应激下DNA甲基化和基因表达变化的简化工作流程。从新生小鼠的母体分离开始，到离散脑组织的分离，我们提供了一种从脑组织穿孔样本中同时提取DNA和RNA的实验方案，以用于后续的亚硫酸氢盐测序和逆转录PCR分析。...

大脑中微小解剖限定区域的DNA甲基化与基因表达优化分析

本文描述了从分离的海马体制备急性脑切片的方法，以及在刺激Schaffer侧支的同时，对辐射层中的星形胶质细胞和神经元进行同步电生理记录的技术。同时演示了药理学分离星形胶质细胞钾离子和谷氨酸转运体电流的方法。...

急性海马脑片中突触激活的星形胶质细胞与神经元反应的双通道电生理记录

本研究描述了一种新型神经元轴突与（星形）胶质细胞共培养平台的建立步骤。在此共培养系统中，可实现对单个轴突（及单个胶质细胞）之间直接相互作用的操控，从而能够对神经元与胶质细胞之间的相互信号传导机制进行分析。...

基于微流控培养平台（MCP）的神经元轴突与胶质细胞共培养系统中神经元-胶质细胞相互作用的成像分析

本文介绍了一种用于诱导神经元稳态可塑性的方案改良方法，以研究星形胶质细胞G蛋白偶联受体的可塑性。该方法近期已被用于检测幼年小鼠星形胶质细胞I型代谢型谷氨酸受体（mGluRs）的变化，也可应用于测量成年小鼠组织中多种星形胶质细胞GPCR的表达上调或下调，可在原位（in situ）和在体（in...

通过调控神经元放电频率诱导星形胶质细胞受体的可塑性

星形胶质细胞内 Ca²⁺ 的特性与功能2+ 纹状体中的信号仍未能得到充分研究。本文描述了利用血清型2/5的腺相关病毒（AAV2/5）在纹状体星形胶质细胞中表达基因编码钙指示剂的方法，以及可靠地对钙信号进行成像的操作流程。2+ 纹状体星形胶质细胞内的信号 原位.

使用基因编码钙指示剂对成年小鼠纹状体星形胶质细胞中的细胞内 Ca2+ 信号进行成像

本实验方案的目的是利用荧光激活细胞分选（FACS）技术分选出特定类型的神经细胞，以便后续分析细胞类型特异性的基因表达、表观遗传标记和/或蛋白质表达。...

利用荧光激活细胞分选技术分析大鼠脑组织中特定细胞类型的基因表达

本报告的目的是描述在发育中和有丝分裂后的小鼠视网膜中对表观遗传标志物5-甲基胞嘧啶（5mC）和5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）进行可靠免疫组织化学检测的实验方案。...

小鼠发育期及有丝分裂后视网膜中5-甲基胞嘧啶与5-羟甲基胞嘧啶的免疫组织化学检测

星形胶质细胞在大脑皮层中均匀分布，这使得在细胞水平上分析其复杂形态具有挑战性。本方案采用基于子宫内电穿孔的多色标记方法，以标记单个皮层星形胶质细胞，并结合用户友好的图像分析流程，对其体积和形态进行分析。...

子宫内电穿孔法将多靶点基因组整合彩色（MAGIC）标记递送至个体小鼠皮层星形胶质细胞

本文介绍了一种利用DeepSpaceDB的实验方案，DeepSpaceDB是一个用于空间转录组学的动态交互式数据库，提供分析工作流程和示例，以探索组织结构和疾病相关基因表达。...

利用 DeepSpaceDB 挖掘空间转录组数据集

本方案全面描述了一种可同时记录多个与记忆相关脑区中神经元和星形胶质细胞钙信号的方法，并展示了其在学习与记忆行为范式中的应用。...

一种双色光纤光度法用于记录学习与记忆行为过程中多个脑区的星形胶质细胞-神经元活动

探索星形胶质细胞中KCNJ10基因的DNA甲基化状态及其与转录活性的关联。本研究采用甲基化敏感高分辨率熔解分析和荧光素酶检测技术，为神经科学和表观遗传学研究提供有效方法。

关联星形胶质细胞 KCNJ10（Kir4.1）基因特异性 DNA 甲基化变化与其表达及转录活性

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