关联特定基因的DNA甲基化与表达的变化和星形胶质细胞的转录活性 KCNJ10（Kir4.1）

该程序的总体目标是评估 KCNJ 10 在富集的星形胶质细胞群中的 DNA 甲基化状态，并将启动子的 DNA 甲基化变化与转录可选活性相关联。这是通过首先通过事实分类从整个啮齿动物大脑中分离出丰富的皮质星形胶质细胞群来实现的，然后从富集的星形胶质细胞群中分离 DNA。然后通过使用甲基化敏感的高分辨率熔解分析或 MS 评估 KC J 10 的 DNA 甲基化状态。人力资源管理局。

最后，KC J 10 启动子被高甲基化，并使用荧光素测定将启动子的 DNA 甲基化变化与转录活性相关联。最终，MS.HRMA 和荧光素酶测定用于测量 KCNJ 10 的 DNA 甲基化状态，并将启动子甲基化的变化与基因的转录活性相关联将看到演示该程序。我实验室的博士后研究员，所有动物均按照美国国立卫生研究院指南、阿拉巴马大学伯明翰分校动物护理和使用委员会批准的动物使用进行处理。

所有缓冲液和试剂均根据文本方案制备。从安乐死动物的头部解剖皮质后，根据文本协议，在 50 毫升锥形管的顶部切一个孔或粉碎一个孔，以便将管子送入管中。然后将 papin 溶液加入试管中。

将解剖的皮质放入含有平衡至 95%O 2 至 5%CO2 的解离培养基的 10 毫米培养皿中，并使用干净的剃须刀片将组织切成一平方毫米的小块。使用 10 毫升移液器，男性将组织转移到装有胡椒溶液的 50 毫升试管中。在排出之前，让组织沉降到移液管的底部。

为了在不使辣椒溶液起泡的情况下最大限度地减少携带的解离介质量，通过表面气体交换施加 95%O2 至 5%CO2 的恒定流量，同时在 37 摄氏度的水浴中孵育 20 分钟。孵育后，使用 10 mL 移液管缓慢调整组织，将混浊细胞悬液在室温下以 300 G 离心 5 分钟。通过表面气体交换平衡 DNA 的白蛋白抑制剂溶液，并将沉淀的细胞重悬于 3 毫升溶液中。

然后按照制造商的说明制备商业不连续密度梯度。将不连续密度梯度在 70 G 下离心 6 分钟。然后用移液管吸出培养基，从管底分离的细胞。

使用 2 至 3 毫升含 0.02% 牛血清白蛋白的 DPBS 和每毫升 1 毫克 DNA 或首选培养基。为了重新使用，悬浮解离的细胞。在根据文本方案进行事实分类和 DNA 或 RNA 提取之前，将细胞通过 40 微克过滤器。

针对亚硫酸氢盐转化的 DNA 序列设计引物并根据文本方案通过亚硫酸盐扩增 DNA 后，使用优选的 DNA 聚合酶和五个微摩尔引物，从同一动物物种转化每个样品的 500 至 1000 纳克 DNA 和甲基化 DNA 标准品，范围从 0 到 100%。设置 20 μL 反应进行 Ms HRM 扩增。根据此表，根据分析软件集、熔解曲线过渡前后开始和终止参数，一式三份运行所有样品，包括传真、DNA 和甲基化标准品。

设置 prem melt、start 和 prem melt stop 参数。所以两者之间的差异是 0.2 到 0.5 摄氏度。以类似方式设置熔解后、开始和停止，并使用甲基化标准品百分比及其相应的峰值温差提取每个样品的峰温差数据。

生成线性回归方程。在确定感兴趣的 CPG 岛并根据文本方案扩增和克隆 CPG 岛 Luke 2 质粒后，使用此线性回归方程估计未知样品的甲基化状态。使用首选的切割软件验证限制性酶切位点，以避免双重切割，并在用适当的酶消化样品后线性化 30 μg 质粒。

50 μL 反应中，在适当的温度和持续时间下加热灭活酶。使用 5 个单位的 CPG 甲基化物进行甲基化。700 μg 线性化质粒在 30 摄氏度下放置 13 至 19 小时。

按照文本方案中概述清洁 DNA 后，通过在 37 摄氏度下孵育 1 小时，对 1 微克甲基化 DNA 样品进行 HPA 双限制性消化。在 1% agros 上清洁 DNA 运行样品后，在 100 伏特下将 DNA 凝胶凝胶加热 45 分钟以进行可视化。接下来，将甲基化和非甲基化质粒与适当的限制性内切酶进行双重消化过夜，以释放全长 Luke 2 载体和 CPG 岛片段。

加热使消化后的酶失活。将双消化样品在 1% DNA agros 凝胶上以 100 伏电压运行一小时以分离载体并插入，然后在佩戴紫外线防护罩的情况下，将凝胶放在黑光下并用干净的手术刀片，根据文本方案在凝胶提取 DNA 后切除甲基化和非甲基化插入物， 使用 T 4 DNA 连接酶和比例为 1：4 的载体插入片段，将甲基化和非甲基化插入片段归为未甲基化载体。连接后在零下 20 摄氏度或在冰上孵育过夜。

通过在 1%DNA aros 凝胶上运行样品来清洁 DNA 并验证重新连接，并以每孔 140， 000 个细胞的速度评估 12 孔板上重新连接的质粒 CD 54 细胞的浓度。24 小时后。使用市售转染试剂转染等浓度的非甲基化 CPG 环 2 质粒加 RAN vanilla 或其他对照含铁载体或甲基化 c pg Luke 2 质粒加 ELLA 或其他对照荧光素载体的细胞，在进行荧光素检测前让细胞转染 24 小时。

根据制造商的说明，使用光度计读取每个孔，一式三份。计算萤火虫荧光素活动与运行原版或其他对照的比率。路西法活动。

通过将甲基化活性除以甲基化 luc 活性，将甲基化萤火虫对照荧光素酶活性标准化为非甲基化萤火虫对照荧光素酶活性。如此处所示，通过对 E-G-F-P-S 100 β 转基因动物进行传真分选获得富集的星形胶质细胞群。基于前向和侧向散射靶向门控细胞群，并使用溴化物死细胞指示剂确定活细胞群，此处显示的门控是解离后 EGFP 阳性星形胶质细胞的代表性图像，但在分选之前和分选之后，该图显示了分离的 EGFP 阳性细胞群，其星形胶质细胞特异性标志物的 mRNA 增加了 40 倍。

A LDH 一 L 一。此外，尽管 S 100 β 和 NG 两个阳性 OPC 和星形胶质细胞共享表达，但观察到 NG 两个 mRNA 减少了四倍，观察到少突胶质细胞前体细胞的标志物表明分离出富集的星形胶质细胞群。下表列出了从不同年龄和数量的动物中分离的总 RNA 和 DNA，并列为根据事实确定分子分子预期产量的参考。

最后，在将甲基化插入片段移动到非甲基化载体中后，使用双荧光素测定法评估目标基因高甲基化区域的转录活性。HPA two 仅消化非甲基化 DNA 用于验证质粒的甲基化状态。观看此视频后，您应该对如何使用事实分离富集的星形胶质细胞群以及如何测量基因的 DNA 甲基化以及如何使用甲基化敏感的高分辨率熔解分析和荧光素酶测定将启动子的 DNA 甲基化变化与转录活性相关联。