关联特定基因的DNA甲基化与表达的变化和星形胶质细胞的转录活性 KCNJ10（Kir4.1）
September 26th, 2015
DNA 甲基化能够维持稳定的基因表达水平，并允许基因表达响应于各种刺激而发生动态变化。我们详细介绍了允许研究 DNA 甲基化的基因特异性变化以及这些变化对基因表达的影响的技术。
该程序的总体目标是评估 KCNJ 10 在富集的星形胶质细胞群中的 DNA 甲基化状态，并将启动子的 DNA 甲基化变化与转录可选活性相关联。这是通过首先通过事实分类从整个啮齿动物大脑中分离出丰富的皮质星形胶质细胞群来实现的，然后从富集的星形胶质细胞群中分离 DNA。然后通过使用甲基化敏感的高分辨率熔解分析或 MS 评估 KC J 10 的 DNA 甲基化状态。人力资源管理局。
最后，KC J 10 启动子被高甲基化，并使用荧光素测定将启动子的 DNA 甲基化变化与转录活性相关联。最终，MS.HRMA 和荧光素酶测定用于测量 KCNJ 10 的 DNA 甲基化状态，并将启动子甲基化的变化与基因的转录活性相关联将看到演示该程序。我实验室的博士后研究员，所有动物均按照美国国立卫生研究院指南、阿拉巴马大学伯明翰分校动物护理和使用委员会批准的动物使用进行处理。
所有缓冲液和试剂均根据文本方案制备。从安乐死动物的头部解剖皮质后，根据文本协议，在 50 毫升锥形管的顶部切一个孔或粉碎一个孔，以便将管子送入管中。然后将 papin 溶液加入试管中。
将解剖的皮质放入含有平衡至 95%O 2 至 5%CO2 的解离培养基的 10 毫米培养皿中，并使用干净的剃须刀片将组织切成一平方毫米的小块。使用 10 毫升移液器，男性将组织转移到装有胡椒溶液的 50 毫升试管中。在排出之前，让组织沉降到移液管的底部。
为了在不使辣椒溶液起泡的情况下最大限度地减少携带的解离介质量，通过表面气体交换施加 95%O2 至 5%CO2 的恒定流量，同时在 37 摄氏度的水浴中孵育 20 分钟。孵育后，使用 10 mL 移液管缓慢调整组织，将混浊细胞悬液在室温下以 300 G 离心 5 分钟。通过表面气体交换平衡 DNA 的白蛋白抑制剂溶液，并将沉淀的细胞重悬于 3 毫升溶液中。
然后按照制造商的说明制备商业不连续密度梯度。将不连续密度梯度在 70 G 下离心 6 分钟。然后用移液管吸出培养基，从管底分离的细胞。
使用 2 至 3 毫升含 0.02% 牛血清白蛋白的 DPBS 和每毫升 1 毫克 DNA 或首选培养基。为了重新使用，悬浮解离的细胞。在根据文本方案进行事实分类和 DNA 或 RNA 提取之前，将细胞通过 40 微克过滤器。
针对亚硫酸氢盐转化的 DNA 序列设计引物并根据文本方案通过亚硫酸盐扩增 DNA 后，使用优选的 DNA 聚合酶和五个微摩尔引物，从同一动物物种转化每个样品的 500 至 1000 纳克 DNA 和甲基化 DNA 标准品，范围从 0 到 100%。设置 20 μL 反应进行 Ms HRM 扩增。根据此表，根据分析软件集、熔解曲线过渡前后开始和终止参数，一式三份运行所有样品，包括传真、DNA 和甲基化标准品。
设置 prem melt、start 和 prem melt stop 参数。所以两者之间的差异是 0.2 到 0.5 摄氏度。以类似方式设置熔解后、开始和停止，并使用甲基化标准品百分比及其相应的峰值温差提取每个样品的峰温差数据。
生成线性回归方程。在确定感兴趣的 CPG 岛并根据文本方案扩增和克隆 CPG 岛 Luke 2 质粒后，使用此线性回归方程估计未知样品的甲基化状态。使用首选的切割软件验证限制性酶切位点，以避免双重切割，并在用适当的酶消化样品后线性化 30 μg 质粒。
在50 μL 反应中，在适当的温度和持续时间下加热灭活酶。使用 5 个单位的 CPG 甲基化物进行甲基化。700 μg 线性化质粒在 30 摄氏度下放置 13 至 19 小时。
按照文本方案中概述清洁 DNA 后，通过在 37 摄氏度下孵育 1 小时，对 1 微克甲基化 DNA 样品进行 HPA 双限制性消化。在 1% agros 上清洁 DNA 运行样品后，在 100 伏特下将 DNA 凝胶凝胶加热 45 分钟以进行可视化。接下来，将甲基化和非甲基化质粒与适当的限制性内切酶进行双重消化过夜，以释放全长 Luke 2 载体和 CPG 岛片段。
加热使消化后的酶失活。将双消化样品在 1% DNA agros 凝胶上以 100 伏电压运行一小时以分离载体并插入，然后在佩戴紫外线防护罩的情况下，将凝胶放在黑光下并用干净的手术刀片，根据文本方案在凝胶提取 DNA 后切除甲基化和非甲基化插入物， 使用 T 4 DNA 连接酶和比例为 1：4 的载体插入片段，将甲基化和非甲基化插入片段归为未甲基化载体。连接后在零下 20 摄氏度或在冰上孵育过夜。
通过在 1%DNA aros 凝胶上运行样品来清洁 DNA 并验证重新连接，并以每孔 140， 000 个细胞的速度评估 12 孔板上重新连接的质粒 CD 54 细胞的浓度。24 小时后。使用市售转染试剂转染等浓度的非甲基化 CPG 环 2 质粒加 RAN vanilla 或其他对照含铁载体或甲基化 c pg Luke 2 质粒加 ELLA 或其他对照荧光素载体的细胞，在进行荧光素检测前让细胞转染 24 小时。
根据制造商的说明，使用光度计读取每个孔，一式三份。计算萤火虫荧光素活动与运行原版或其他对照的比率。路西法活动。
通过将甲基化活性除以甲基化 luc 活性，将甲基化萤火虫对照荧光素酶活性标准化为非甲基化萤火虫对照荧光素酶活性。如此处所示，通过对 E-G-F-P-S 100 β 转基因动物进行传真分选获得富集的星形胶质细胞群。基于前向和侧向散射靶向门控细胞群，并使用溴化物死细胞指示剂确定活细胞群，此处显示的门控是解离后 EGFP 阳性星形胶质细胞的代表性图像，但在分选之前和分选之后，该图显示了分离的 EGFP 阳性细胞群，其星形胶质细胞特异性标志物的 mRNA 增加了 40 倍。
A LDH 一 L 一。此外，尽管 S 100 β 和 NG 两个阳性 OPC 和星形胶质细胞共享表达，但观察到 NG 两个 mRNA 减少了四倍，观察到少突胶质细胞前体细胞的标志物表明分离出富集的星形胶质细胞群。下表列出了从不同年龄和数量的动物中分离的总 RNA 和 DNA，并列为根据事实确定分子分子预期产量的参考。
最后，在将甲基化插入片段移动到非甲基化载体中后，使用双荧光素测定法评估目标基因高甲基化区域的转录活性。HPA two 仅消化非甲基化 DNA 用于验证质粒的甲基化状态。观看此视频后，您应该对如何使用事实分离富集的星形胶质细胞群以及如何测量基因的 DNA 甲基化以及如何使用甲基化敏感的高分辨率熔解分析和荧光素酶测定将启动子的 DNA 甲基化变化与转录活性相关联。
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概述
本研究调查了KCNJ10基因在星形胶质细胞中的DNA甲基化状态及其与转录活性的相关性。采用甲基化敏感高分辨率熔解分析和荧光素酶测定等技术来评估这些变化。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 表观遗传学
- 基因表达
背景
- DNA甲基化在调节基因表达中起着关键作用。
- DNA甲基化的变化可以影响细胞对各种刺激的反应。
- 星形胶质细胞是中枢神经系统中的关键参与者，其基因表达可以受到表观遗传修饰的影响。
- KCNJ10基因因其在离子运输和神经元功能中的作用而备受关注。
研究目的
- 评估星形胶质细胞中KCNJ10启动子的DNA甲基化状态。
- 将DNA甲基化的变化与KCNJ10的转录活性相关联。
- 使用特定的测定方法有效测量这些变化。
使用的方法
- 使用FACS分选从啮齿动物脑中分离皮层星形胶质细胞。
- 从富集的星形胶质细胞群体中分离DNA。
- 使用甲基化敏感高分辨率熔解分析（MS.HRMA）评估DNA甲基化状态。
- 使用荧光素酶测定评估DNA甲基化变化与转录活性的相关性。
主要结果
- 在KCNJ10启动子区域识别高甲基化。
- 证明甲基化状态与转录活性之间存在相关性。
- 验证用于评估DNA甲基化和基因表达的方法。
- 洞察DNA甲基化在调节星形胶质细胞中KCNJ10表达中的作用。
结论
- DNA甲基化是星形胶质细胞中KCNJ10表达的重要调节因子。
- MS.HRMA和荧光素酶测定是研究基因特异性甲基化变化的有效工具。
- 理解这些机制可以提供对星形胶质细胞功能和基因调控的洞察。
常见问题
Executive Industry Relevance
Understanding gene-specific DNA methylation dynamics in astrocytes provides mechanistic de-risking for targets like KCNJ10 in neuropsychiatric and neurodegenerative disease programs. Correlating promoter methylation with transcriptional activity enables predictive confidence in target validation and supports early-stage hypothesis interrogation. This approach enhances translational biomarker alignment by linking epigenetic states to functional outputs in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by testing whether DNA methylation changes at the KCNJ10 promoter are sufficient to alter transcriptional activity.
- Operational Value: Enables biological de-risking through direct assessment of epigenetic regulation in a disease-relevant cell type.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by establishing correlative and causal links between epigenetic marks and gene expression in astrocytes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated astrocytic models for downstream epigenetic screening using MS-HRMA and luciferase readouts.
- Operational Value: Standardizes quantitative methylation and transcriptional measurements for reproducible compound screening.
- Scalability: Enables platform reuse across CNS targets by combining FACS enrichment with locus-specific methylation and expression analysis.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with disease-relevant systems by examining KCNJ10 methylation in astrocytes, a key cell type in CNS disorders.
- Operational Value: Ensures continuity from discovery through preclinical validation by linking epigenetic modulation to functional outcomes.
- Risk Mitigation: Supports risk-adjusted advancement decisions by validating mechanistic de-risking of epigenetic targets.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates FACS-enriched astrocytes with locus-specific methylation and transcriptional analysis, supporting workflows from target validation to preclinical modeling in CNS drug discovery.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by correlating KCNJ10 promoter methylation with astrocytic gene expression.
- Screening: Delivers assay readiness through quantitative, reproducible outputs from MS-HRMA and luciferase assays.
- Analytics: Provides methylation percentage and transcriptional activity readouts that enable condition comparison and target ranking.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by using disease-relevant astrocytic models to assess epigenetic regulation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for studying gene-specific epigenetic mechanisms across multiple CNS targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in epigenetic regulation.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of methylation-expression correlation workflows.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in CNS programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on epigenetic target validation.
Implementation Considerations
- Required expertise in FACS sorting, epigenetic analysis, and luciferase reporter assays.
- Instrumentation needs include flow cytometer, qPCR or melt analysis platform, and luminometer.
- Cross-team standardization requires alignment between molecular biology, epigenetics, and assay development groups.
- Adaptation considerations include model system validity and promoter-specific assay design for other targets.
- Practical limitations include tissue yield from FACS and sensitivity of methylation detection in heterogeneous samples.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:25
RNA and DNA Isolation from an Enriched Astrocytic Population using FACS
4:03
Assessing DNA Methylation Status of a Gene Using Methylation-sensitive High Resolution Melt Analysis
5:26
Assessing Hyper-methylated Promoter Activity using a Luciferase Assay
8:50
Results: DNA Methylation Analysis of KCNJ10 in Astrocytes
10:42
Conclusion
