Name: 优化小，解剖定义的大脑区域的DNA甲基化和基因表达分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 11 s
Description: 了解如何通过母体分离诱导早期应激，并从小鼠脑组织微量解剖样本中同时分离DNA和RNA，用于DNA甲基化和基因表达分析。该方法适用于组织量有限的表观遗传学研究。

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本工作由马克斯·普朗克精神病学研究所和欧盟玛丽·居里初始培训网络（NINA 合同编号 238665）资助。

1. 早期生活逆境的编程作用
通过定时妊娠的C57BL/6N小鼠所产的幼鼠（出生当天为出生后第0天（P0））进行母体分离（MS），以诱导其早期生命阶段的应激（ELS）。
<ol>
 <li>从出生后第1天至第10天（P1–10），每天将单个窝的幼鼠放入清洁笼具中（配备加热垫）3小时。</li>
 <li>对照组（非早期生活应激，non-ELS）幼鼠在整个期间留在母鼠巢穴中，不进行干扰。</li>
 <li>幼鼠断奶前一直与母鼠同笼（至P21），断奶后按性别分组饲养（每笼3–5只小鼠），置于标准实验动物饲养条件下。</li>
</ol>
2. 脑组织的分离与解剖
<ol>
 <li>小鼠在预定年龄通过颈椎脱位处死。 注意：由于本实验方案涉及应激范式，为避免干扰应激激素的正常生理调节，颈椎脱位前不给予麻醉。打开颅骨后小心取出脑组织，并立即浸入异戊烷-干冰中快速冷冻，随后于 - 存放80 °C.</li>
 <li>脑组织进行冷冻切片（10 μm 厚度）；切片置于 Superfrost 玻片上，并于 -20 °C参考标准小鼠立体定位图谱（例如 Paxinos 6用于验证解剖学定位的准确性，并确保目标区域被完整采集（例如，采集室旁核神经元时，应从室旁核前部水平开始，即前囟水平 -0.75 至 -0.85 处收集切片）。</li>
 <li>切片用焦油紫染色以方便识别不同的脑区结构。通过获取感兴趣区域（如室旁核）的0.8 mm钻孔组织样本， 原位 显微解剖</li>
</ol>
3. 从脑组织穿孔样本中提取核酸
本文描述了一种优化的方案，可从微小的神经解剖学定义脑区同时提取DNA和RNA，用于亚硫酸氢盐测序和基因表达分析7。
注意：由于RNA在GTC缓冲液中的稳定性低于DNA，我们建议优先处理RNA。用于DNA纯化的匀浆在此期间可室温（RT）保存。
<ol>
 <li>在室温下，使用移液器和涡旋振荡器将穿孔组织在400 μl胍硫氰酸盐（GTC）缓冲液（4.5 M 胍硫氰酸盐，2% N-月桂酰肌氨酸，50 mM EDTA pH 8.25 mM Tris-HCl pH 7.5，0.1 M β-巯基乙醇，0.2% 消泡剂A）中匀浆，通过皮下注射器（29G）反复吹打数次（图2）。</li>
 <li>将裂解液等分；可根据具体实验需求同时或分别提取RNA和DNA。</li>
 <li>进行RNA纯化时，向裂解液中加入1/10体积的NaOAc、1体积的AquaPhenol（Appligene，pH 4）以及1/2体积的氯仿:异戊醇（24:1）。每步操作后剧烈涡旋，冰上孵育10分钟，然后离心（4 °C下10,000 g离心20分钟）；向水相中加入等体积的70%乙醇。</li>
 <li>将混合物转移至RNA离心柱（例如Macherey-Nagel的Nucleospin RNA II），按制造商说明书进行柱上DNase消化和洗涤步骤；用25 μl H2O洗脱RNA。</li>
 <li>进行DNA纯化时采用Qiagen DNeasy Blood and Tissue试剂盒的优化方案。用等体积的Buffer AL和100%乙醇平衡裂解液，加载至离心柱中（室温下10,000 g离心1分钟），弃去穿流液。</li>
 <li>向柱中加入500 μl Buffer AW1，并加入5 μl RNase（1 mg/ml），室温孵育10分钟。离心（室温下10,000 g离心1分钟），弃去穿流液。</li>
 <li>用500 μl Buffer AW2洗涤离心柱，弃去穿流液，空柱离心干燥（15,000 g离心1分钟）。</li>
 <li>加入预热（70 °C）的Buffer AE，于70 °C孵育离心柱10分钟。通过离心（1分钟，10,000 g）洗脱，将穿流液重新上柱并重复离心步骤。</li>
</ol>
使用分光光度计测定 DNA 和 RNA 浓度。一次典型的下丘脑室旁核组织取样可获得约 600 ng DNA 和约 400 ng RNA。在进行定量 PCR（qPCR）基因表达分析时，逆转录反应中通常使用约 100 ng RNA。
4. 亚硫酸氢盐转化
亚硫酸氢钠用于将非甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶。相比之下，甲基化的胞嘧啶则不会被转化。因此，经亚硫酸氢盐处理后的PCR扩增产物在最终测序中检测到的所有胞嘧啶均代表原本甲基化的胞嘧啶。
亚硫酸氢盐转化会导致DNA显著降解，这可能成为PCR分析的限制因素。使用Qiagen的EpiTect Bisulfite试剂盒，可实现优化的反应条件，最大限度地提高胞嘧啶的转化率，减少DNA片段化，并在较低温度下仍保持单链DNA状态。据我们经验，从显微切割组织中纯化的约200 ng DNA即可为亚硫酸氢盐反应提供足够的起始材料。
为防止转化反应效率的差异，实验中所有样本的模板DNA用量应保持一致。此外，应通过检查非CpG位点的未转化率来严格评估测序读段的转化效率。该比率应超过98%。较低的数值表明亚硫酸氢盐转化不完全或效率低下，相应的序列应从分析中剔除。
5. 亚硫酸氢盐 PCR
<ol>
 <li>设计特异性针对亚硫酸氢盐转化后DNA的测序引物（见讨论部分）；Methyl Primer Express软件（<a href="https://products.appliedbiosystems.com/ab/en/US/adirect/ab?cmd=catNavigate2&amp;catID=602121" target="_blank">https://products.appliedbiosystems.com/ab/en/US/adirect/ab?cmd=catNavigate2&amp;catID=602121</a>）可辅助引物设计，并有助于在预实验中确定最佳退火温度。</li>
 <li>按以下组分配制PCR主混合液（单个反应）：
 2.5 μl 10x PCR缓冲液 
 0.5 μl 10 mM dNTPs 
 1 μl 10 μM 正向引物 
 1 μl 10 μM 反向引物 
 0.125 μl Qiagen Hotstart Taq Plus 
 用H2O补至23 μl </li>
 <li>向反应体系中加入2 μl亚硫酸氢盐处理后的DNA。</li>
 <li>按以下条件进行扩增：
 1个循环：95 °C，6分钟 
 45–50个循环：95 °C，1分钟；最佳退火温度，1分钟；72 °C，1分钟 
 1个循环：72 °C，5分钟 </li>
</ol>
取7 μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，以验证扩增片段的大小，并使用 commercially available PCR纯化试剂盒（例如Macherey-Nagel Nucleospin Extract）对剩余PCR反应产物进行纯化，用于后续连接反应。若出现额外的非目标PCR产物，建议进行凝胶纯化。
6. 亚硫酸氢盐测序
通过单克隆测序获得的高分辨率DNA甲基化谱能够检测DNA甲基化的微小变化，并鉴定对处理（环境编程）有响应的调控区域。亚硫酸氢盐测序过程包括三个连续的操作步骤：首先，将前期亚硫酸氢盐PCR获得的PCR产物连接至载体并转化入细菌中；其次，对单个克隆进行菌落PCR，以确定插入片段的正确大小；第三，对阳性菌落PCR产物进行纯化后，进行Big-Dye测序反应。经过纯化步骤后，产物在毛细管测序仪上进行电泳分析。
6.1 连接与转化
注意：我们常规使用pGEM-T载体克隆试剂盒（Promega）。根据我们的经验，克隆效率在很大程度上取决于待连接的插入片段。如果反复获得较少数量的重组克隆，应尝试不同的载体。
<ol>
 <li>设置连接反应：
 5 μl 2x 连接缓冲液 
 1 μl pGEM-T 载体 
 1 μl T4 连接酶 
 3 μl 纯化后的 PCR 产物 </li>
 <li>用移液器混匀反应体系，在 4 °C 过夜孵育。
 注意：也可在室温下反应 1 小时。为增加重组克隆的数量，推荐在 4 °C 过夜连接。 </li>
 <li>通过乙醇沉淀法纯化连接产物：
 <ol class="lalpha">
 <li>向连接反应体系中加入 1 μl 糖原、1 μl 3M 醋酸钠和 25 μl 100% 乙醇，于液氮中沉淀 1 分钟。</li>
 <li>离心（15,0000 g，4 °C，30 分钟），弃上清。</li>
 <li>用 300 μl 70% 乙醇洗涤，离心（15,000 g，4 °C，20 分钟），弃上清，室温干燥沉淀（10 分钟）。</li>
 <li>将沉淀重悬于 10 μl H2O 中。</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
6.2 将连接产物转化至电转感受态细菌中
<ol>
 <li>将电穿孔杯（1 mm 宽度）置于冰上预冷，并将一份电转感受态 DH5α 菌在冰上解冻。</li>
 <li>将 45 μl DH5α 菌加入 10 μl 纯化后的连接产物（见上文）中，混匀后转移至电穿孔杯中。</li>
 <li>在 1.5 kV、200 Ω、15 μF 条件下进行细菌转化，电击后立即加入 1 ml 预热的 SOB 培养基。</li>
 <li>在 37 °C 下复苏细菌 1 小时，取 100 μl 菌液涂布于含有氨苄青霉素并涂有 IPTG/X-Gal 的 LB 平板上。</li>
 <li>将平板在 37 °C 下过夜培养。</li>
</ol>
6.3 菌落 PCR
注意： 对单克隆进行菌落 PCR 以确认插入片段具有预期大小。蓝/白筛选中颜色发育延迟、连接过程中发生非预期的重组事件、引物二聚体的形成或截短的 PCR 产物均可能导致测序结果错误。我们通常使用 T7 和 SP6 引物扩增克隆插入片段；此方法会额外扩增出约 150 bp 的载体序列。在后续步骤中，测序反应将使用 T7 引物。
<ol>
 <li>在96孔板中设置菌落PCR反应。每个反应使用：
 3 μl 2.5 mM MgCl2 
 2.5 μl 10x Taq缓冲液 
 1.5 μl 10 mM dNTP 
 2 μl 2.5 mM T7引物 
 2 μl 2.5 mM SP6引物 
 1 μl Fermentas Taq DNA聚合酶 
 用H2O补足至25 μl </li>
 <li>将25 μl主混合液加入96孔板的每个孔中。</li>
 <li>用移液器吸头挑取平板上的阳性（白色）克隆，并浸入PCR反应液中。</li>
 <li>使用以下条件进行扩增：
 1个循环：95 °C下4分钟 
 10个循环：94 °C下30秒，56 °C下30秒，72 °C下30秒 
 30个循环：94 °C下30秒，48 °C下30秒，72 °C下30秒 
 1个循环：72 °C下5分钟 </li>
 <li>取5 μl菌落PCR产物上样至琼脂糖凝胶，确定含有正确插入片段大小的反应。</li>
 <li>使用市售试剂盒（Macherey Nagel Nucleofast）对含有目标扩增产物的菌落PCR产物进行纯化。</li>
</ol>
6.4 大片段染料终止反应与测序
<ol>
 <li>准备Big-Dye反应的主混合液。每次反应使用：
 1 μl H2O 
 0.5 μl Big-Dye试剂 
 1.5 μl测序缓冲液 </li>
 <li>将3 μl主混合液加入96孔板的每个孔中，每孔再加入2 μl纯化后的菌落PCR产物，并在PCR仪上按照以下程序运行反应：
 96 °C孵育1分钟，1个循环 
 96 °C变性10秒、50 °C退火5秒、60 °C延伸4分钟，共35个循环 </li>
 <li>使用商业化试剂盒（Millipore Montage 96 Sequencing Clean-Up Kit）对Big-Dye反应产物进行纯化，随后在毛细管测序仪（例如ABI 3100 DNA）上进行测序分析。</li>
 <li>使用Biq Analyzer（<a href="http://biq-analyzer.bioinf.mpi-sb.mpg.de/" target="_blank">http://biq-analyzer.bioinf.mpi-sb.mpg.de/</a>）或在线工具BISMA（<a href="http://biochem.jacobs-university.de/BDPC/BISMA/" target="_blank">http://biochem.jacobs-university.de/BDPC/BISMA/</a>）分析测序结果，以获得目标DNA区域的甲基化模式（图4）。</li>
</ol>
7. 代表性结果
为了深入了解早期生活应激（ELS）对Avp基因表达及甲基化状态的影响，按照上述流程处理C57BL/6N小鼠。简言之，一组C57BL/6N小鼠接受早期生活应激处理，而对照组小鼠则不予干扰。分别对室旁核（PVN）和视上核（SON）进行脑区穿孔取样，并从单个穿孔样本中同时提取DNA和RNA。将RNA逆转录为cDNA，通过qPCR分析检测Avp转录本水平，并以Hprt和Gapdh两个看家基因的表达量进行标准化。DNA经亚硫酸氢盐处理后，使用针对Avp增强子区域的特异性引物进行扩增（图4a），将PCR产物克隆并测序。每只小鼠/每次PCR至少分析20个重组克隆，以确定PCR扩增片段中所含CpG位点的甲基化频率（图4b）。与对照组相比，早期生活应激在Avp增强子的CpG10、CpG12、CpG13和CpG14位点诱导了显著的低甲基化（p &lt; 0.05，n = 6–8只动物），提示该调控区域可通过早期生活经历产生表观遗传标记。与PVN不同，在SON中，Avp增强子的甲基化水平不受早期生活应激的影响，表明表观遗传标记具有组织特异性（图4c）。在对照组动物（n = 6）中，对CpG10位点的DNA甲基化状态与Avp基因表达水平的分析显示二者呈负相关，提示DNA甲基化在精细调控AVP基因表达中发挥一定作用（图4d）。
<img alt="大脑解剖工作流程图；RNA表达、亚硫酸氢盐转化、PCR、DNA甲基化。" src="/files/ftp_upload/3938/3938fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 从小鼠脑组织解剖后获取对照组和早期生活应激小鼠的显微穿孔样本。在分离DNA和RNA后，通过qRT-PCR检测基因表达水平，而经亚硫酸氢盐处理的DNA则进行扩增，纯化产物克隆至合适的载体中，利用蓝白斑筛选鉴定重组克隆。通过菌落PCR验证插入片段大小正确后，进行Big-Dye反应并在毛细管测序仪上进行分析。使用适当的软件工具可视化甲基化模式。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3938/3938fig1large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看大图</a>。
<img alt="DNA 亚硫酸氢盐测序时间线；六天工作流程中样品制备和PCR步骤的详细说明。" src="/files/ftp_upload/3938/3938fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
图2. 从DNA/RNA提取到亚硫酸氢盐测序的时间线。
<img alt="RNA/DNA 提取示意图；RNA表达与DNA甲基化分析的逐步流程图" src="/files/ftp_upload/3938/3938fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
图 3. DNA 与 RNA 同时提取的工作流程。将下丘脑室旁核（一个微小的表达 Avp 基因的脑区）组织穿孔样本置于 400 μl GTA 缓冲液中，涡旋振荡至完全裂解，再通过注射器（29G）反复抽吸进一步匀浆。随后将匀浆液分装，用于RNA和DNA的纯化。分装比例可为1:1或其他比例，具体取决于特定的实验需求。匀浆样品应在数小时内完成处理。
<img alt="基因甲基化分析；A：CpG位点示意图；B-C：柱状图；D：相关性散点图。" src="/files/ftp_upload/3938/3938fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4"> 
图4. 6周龄对照组与早期生活应激（ELS）动物在Avp基因座的CpG甲基化情况。（A）Avp基因与oxytocin基因尾对尾排列的示意图，两者由基因间区域（IGR）分隔。外显子以带编号的空心方框表示。CpG残基的分布情况已标出，包含CpG10至CpG14的PCR扩增子的位置和大小以粗线标记。（B）对照组与ELS动物下丘脑室旁核（PVN）中Avp增强子的甲基化水平（n = 6–8）。（C）对照组与ELS动物下丘脑视上核（SON）中Avp增强子的甲基化水平（n = 8–10）。（D）Avp基因表达水平与CpG10位点甲基化程度的相关性分析（n = 6）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3938/3938fig4large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看高清大图</a>。

<ol><li>Jirtle, R. L., Skinner, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+epigenomics+and+disease+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Environmental epigenomics and disease susceptibility.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 253-262 (2007).</li>
<li>Murgatroyd, C., Spengler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+programming+of+the+HPA+axis%3A+Early+life+decides%5BTitle%5D)+AND+%22Stress+%28Amsterdam%2C+Netherlands%29%22%5BJournal%5D)">Epigenetic programming of the HPA axis: Early life decides.</a> Stress (Amsterdam, Netherlands). , (2011).</li>
<li>Gluckman, P. D., Hanson, M. A., Buklijas, T., Low, F. M., Beedle, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+mechanisms+that+underpin+metabolic+and+cardiovascular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Epigenetic mechanisms that underpin metabolic and cardiovascular diseases.</a> Nat. Rev. Endocrinol. 5, 401-408 (2009).</li>
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<li>Clark, S. J., Harrison, J., Paul, C. L., Frommer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+sensitivity+mapping+of+methylated+cytosines%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">High sensitivity mapping of methylated cytosines.</a> Nucleic Acids Res. 22, 2990-2997 (1994).</li>
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</ol>

无利益冲突声明。

表观遗传编程在健康与疾病中的重要作用正日益受到重视。本文介绍一种改进的方法，可从微小组织穿孔样本中同时分离DNA和RNA，并进一步通过亚硫酸氢盐测序获得DNA甲基化谱。优化后的实验流程便于研究环境刺激下大脑中表观遗传编程的变化。此外，由于在同一份样本中同时分析DNA甲基化与基因表达，该方法有助于探究二者之间的功能关联。最后，该策略可显著减少实验所需的动物数量。
在执行本实验流程时，应遵循特定的预防措施和指导原则。鉴于大脑具有极高的复杂性和异质性，且甲基化与表达模式可能因细胞和组织类型而异，因此必须以标准化的方式进行显微切割。例如，Avp 的表观遗传编程仅在下丘脑的室旁核中被检测到，而在视上核中则未发现（图4b-d），尽管这两个区域均为下丘脑中表达 Avp 的区域4。在此方面，从同一组织穿刺样本中同时获得DNA和RNA具有优势，因为在某些情况下，可通过特定组织标志基因的RNA表达来确认所取区域的准确性。尽管显微切割可降低细胞异质性，但仍需注意，该方法并不能实现单一细胞类型或细胞群的分离。为解决这一问题，可考虑增加额外的纯化步骤。
对于亚硫酸氢盐测序，亚硫酸氢盐处理后用于PCR扩增的引物设计至关重要。由于亚硫酸氢盐处理会导致DNA降解，因此长度超过400 bp的PCR产物可能会带来问题。此外，若仅有少数完整的模板参与扩增过程，巢式PCR可能会产生偏差结果。应设计针对修饰后扩增片段特异的引物对；其序列中不应包含CpG二核苷酸，以避免甲基化偏向性扩增。同时，引物中应包含非CpG的胞嘧啶，以防止未修饰或未完全转化的DNA发生扩增。某些模板的扩增可能受益于热启动PCR。无论如何，均应在预实验中验证引物对的适用性，以避免珍贵实验样本的浪费。
亚硫酸氢盐测序是一种用于位点特异性甲基化分析的标准方法，因其能够可靠且精确地以等位基因特异性方式检测单个CpG位点的甲基化状态8。不建议直接对PCR产物进行测序，因为若某个CpG位点存在混合甲基化，则在电泳图谱中会表现为C/T双峰，从而阻碍对该位点甲基化程度的定量分析。因此，通常需增加一个中间克隆步骤，并对多个克隆（约20–30个）进行测序，以确定甲基化的程度。焦磷酸测序是另一种定量DNA甲基化的方法。该方法同样利用亚硫酸氢盐转化和亚硫酸氢盐PCR，但无需克隆，而是将扩增产物直接用于焦磷酸测序反应，其中CpG位点的甲基化状态表现为C/T单核苷酸多态性，可被轻松定量。两种方法检测到的甲基化水平相似9，但由于焦磷酸测序省去了克隆步骤，因此更节省时间。然而，受限于模板长度，每次仅能测序40–100个核苷酸，因此需要使用不同的测序引物进行多轮测序。这一限制尤为关键，因为焦磷酸测序需要较多的DNA模板（每反应约1 μg），而从微小的脑组织穿孔样本中获取的DNA量通常难以满足该要求。因此，对于数个千碱基范围内的区域，采用焦磷酸测序进行初步扫描似乎不如单克隆测序合适。但在确定了较小的目标区域后，应考虑使用焦磷酸测序。
综上所述，上述方案为快速、经济地分析脑组织微穿孔样本中的表观遗传学变化提供了一种准确、高效且简化的途径。单次实验可同时处理多个样本，该方法适用于中等规模实验的样本检测。

<table><tbody><tr><td>DNeasy 血液 &amp;amp; 组织试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td></td></tr><tr><td>Nucleospin RNA II</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740955.50</td><td></td></tr><tr><td>EpiTect 亚硫酸氢盐试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>59104</td><td></td></tr><tr><td>Nucleospin Extract</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609.50</td><td></td></tr><tr><td>pGEM-T 载体克隆试剂盒</td><td>Promega</td><td>A3600</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofast 96</td><td>Macherey-Nagel</td><td>743100.50</td><td></td></tr><tr><td>96孔测序纯化</td><td>Millipore</td><td>LSK09624</td><td></td></tr><tr><td>Hotstar Taq 聚合酶</td><td>Qiagen</td><td>203203</td><td></td></tr><tr><td>Taq 聚合酶</td><td>Fermentas</td><td>EP0401</td><td></td></tr></tbody></table>

大脑中微小解剖限定区域的dna甲基化与基因表达优化分析

Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain

在生命敏感期暴露于饮食、药物及早期生活逆境1,2，可导致基因表达发生持久性改变，进而影响生理和行为表型的表现。此类环境编程可能增加个体对代谢性疾病、心血管疾病和精神疾病易感性3,4。
DNA甲基化和组蛋白修饰被认为是介导基因与环境对话的关键过程，似乎也是环境编程的基础5。在哺乳动物中，DNA甲基化通常指在CpG二核苷酸背景下，胞嘧啶的5位碳原子上共价添加一个甲基基团。
CpG 甲基化以高度组织和细胞特异性的方式发生，这使得研究细胞异质性高且组织量有限的脑部微小区域变得具有挑战性。此外，由于基因表达与甲基化密切相关，通过在同一份样本中比较这两个参数，可以获得更高的研究价值。
本文以“母体分离”这一早期生活逆境模型为例，展示了一种研究大脑表观遗传编程的逐步实验方案（图1）。该方案描述了从不同年龄小鼠脑组织中制备显微穿刺样本的方法，可从同一组织样本中同时提取DNA和RNA，从而能够在同一样本中进行DNA甲基化和基因表达分析。

本文展示了一种用于研究生命早期应激下DNA甲基化和基因表达变化的简化工作流程。从新生小鼠的母体分离开始，到离散脑组织的分离，我们提供了一种从脑组织穿孔样本中同时提取DNA和RNA的实验方案，以用于后续的亚硫酸氢盐测序和逆转录PCR分析。

大脑中微小解剖限定区域的DNA甲基化与基因表达优化分析

在生命敏感期暴露于饮食、药物及早期生活逆境等因素中，可能导致基因表达发生持久性改变，进而促进……

本实验的总体目标是研究早期生命应激对 DNA 甲基化和基因表达的影响。首先，通过将新生小鼠幼崽进行母体分离以诱导早期生命应激；随后，通过原位显微解剖获取目标脑区（此处为下丘脑室旁核 PVN），并从单个组织穿刺样本中同时提取 DNA 和 RNA。接下来，对获得的DNA进行亚硫酸盐处理，然后通过亚硫酸盐PCR扩增目标区域。随后将扩增产物连接至载体并转化入细菌中。通过标记基因的表达和PCR片段大小来鉴定转化是否成功。最后，亚硫酸氢盐测序用于评估甲基化状态。该工作流程的主要优势在于能够方便地分析环境刺激所引发的表观遗传编程。该方法可为生命早期逆境所致的表观遗传编程提供深入见解。该方法也可应用于其他系统。只要是在高度组织特异性的环境中分析DNA甲基化和基因表达，且组织样本有限的情况下，均可使用。为诱导早期生命应激，需对定时妊娠的C57黑鼠（C57 Black Six）母鼠所产的幼鼠进行母婴分离处理。从出生后第1天至第10天，每天将每窝幼鼠转移至加热的清洁笼中3小时，而未受应激的对照组幼鼠则保持不受干扰。除每日3小时的分离外，所有幼鼠均与其母鼠共同饲养，直至出生后第21天断奶。随后，幼鼠按性别分组饲养，每笼3至5只，在标准饲养条件下饲养。为开始脑组织采集，将小鼠脑组织从颅骨中取出后立即用异戊烷在干冰上速冻，并在-80摄氏度下保存。当准备收集组织穿孔样本时，将脑组织从负80摄氏度冰箱中取出，并置于干冰上。从头侧到尾侧对脑组织进行冷冻切片，切为10微米厚的冠状切片。将切片贴附于防脱玻璃载玻片上，并干燥以备结晶紫染色。可额外制备切片并保存在零下20度，用于后续分析，例如原位杂交。当准备进行穿孔取样时，使用氯化甲基紫对切片进行染色，以识别目标脑区结构。然后使用穿孔针，通过原位显微解剖法，获取直径0.8毫米的目标区域组织样本。穿孔样本应保存在负80摄氏度。微穿孔操作必须以标准化方式进行，因为基因表达和甲基化具有高度组织特异性，这一点至关重要。使用移液器在400 µL硫氰酸胍缓冲液中匀浆穿孔样本，然后在室温下涡旋振荡。接下来，将所得裂解液通过29号针头的注射器反复抽吸数次，直至看不到组织块为止。将裂解液等量分装。一种用于处理RNA，应首先进行；另一种用于处理DNA，可在室温下保存，直至进行RNA纯化。在RNA纯化过程中，加入十分之一体积的醋酸钠、等体积的水相苯酚以及半体积的24:1氯仿:异戊醇，涡旋剧烈混合。每次加入后均需充分涡旋，并将最终混合物置于冰上孵育10分钟，随后离心该混合物。收集水相，并加入等体积的70%乙醇。使用RNA离心柱试剂盒，进行柱上DNA消化，然后用25 µL水洗脱RNA。现在使用经过修改的试剂盒方案纯化DNA，修改内容包括加入RN a's消化步骤，并在使用前将洗脱缓冲液和洗脱柱预热至70摄氏度。洗脱柱在70摄氏度下孵育10分钟即可。最后，使用分光光度计测定DNA和RNA的浓度。典型的PVN穿孔可获得约600纳克DNA和约400纳克RNA，其中约100纳克RNA用于在亚硫酸盐扩增前通过定量PCR进行基因表达分析。使用市售试剂盒处理200纳克分离得到的DNA，以扩增甲基化区域的DNA。订购专为亚硫酸氢盐转化DNA设计的引物。在亚硫酸氢盐PCR中，最佳引物设计至关重要，因为PCR扩增片段的质量和特异性决定了后续步骤的成功与否。引物到达后，通过预实验确定其最佳退火温度。每次25微升PCR反应体系中，使用2微升经亚硫酸氢盐处理的DNA作为模板。从95摄氏度下6分钟的变性开始，进行45至50个扩增循环，最后在72摄氏度下延伸5分钟，以扩增混合物。取7微升PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳分析，以验证扩增片段的大小。使用 commercially available 的PCR纯化试剂盒对剩余的PCR产物进行纯化，用于后续连接反应。如果获得非目标PCR产物，可使用凝胶纯化法分离本方案所需的目标产物。本实验采用商业化的克隆试剂盒。克隆效率在很大程度上取决于插入片段。因此，如果反复获得的重组克隆数量较少，可尝试更换不同的克隆载体。设置一个10 µL的连接反应，其中包含1 µL载体和3 µL纯化后的PCR产物。用移液器吹打混合反应体系，并于4°C过夜孵育，次日继续操作。通过经典的乙醇沉淀法纯化连接反应产物，并用产物转化细菌。在电击转化后立即加入1毫升预热的SOB培养基，将转化后的细菌转移至反应管中。在37摄氏度下复苏细菌1小时后，取各菌液100微升涂布于含氨苄青霉素和IPTG的LB平板上。当菌落可挑取时，将平板在37°C孵育过夜。在96孔板中设置25微升的菌落PCR反应体系，每反应加入3微升2.5毫摩尔的氯化镁。用移液枪头挑取呈阳性的白色克隆，并通过简单浸入的方式将其转移至PCR混合液中。开始PCR，进行4分钟的变性循环。随后进行10个扩增循环，退火温度为56摄氏度。每个循环的每一步持续30秒。然后将退火温度降至48摄氏度，再进行30个扩增循环。最后进行一个5分钟的延伸循环。现在将每个产物取5微升上样至琼脂糖凝胶，鉴定含有正确大小插入片段的反应。使用市售试剂盒纯化目标 PCR 产物，以便利用 Big Dye 终止物循环测序法进行测序。在 96 孔板中，每孔加入三微升 Big Dye 反应主混合液，随后加入两微升经纯化的菌落 PCR 产物。将反应置于热循环仪中运行，程序起始于 96 摄氏度下 1 分钟，随后进行 35 个循环：96 摄氏度 10 秒、50 摄氏度 5 秒、60 摄氏度 4 分钟。在完成大剂量反应后，使用大剂量纯化板对反应进行纯化。获得测序结果后，利用在线大剂量分析工具或B-I-S-M-A工具分析数据，以确定所研究DNA区域的甲基化模式，从而深入了解早期生活压力（ELS）对精氨酸加压素（VP）表达及其甲基化状态的影响。C57黑鼠按照所述方案进行处理，取下丘脑室旁核和视上核组织以分离DNA和RNA，DNA经亚硫酸氢盐处理后，使用特异性针对VP增强子区域的引物进行扩增，将PCR产物克隆并测序，每只小鼠至少分析20个重组克隆。通过PCR分析确定了PCR扩增子中所包含的CpG位点的甲基化频率。在P-V-N-E-L-S诱导下，AVP增强子区域的四个位点出现了显著的低甲基化，提示早期生活经历可通过表观遗传修饰标记这一调控区域。相比之下，在视上核（SON）中，AVP增强子的甲基化状态不受早期生活应激（ELS）的影响，说明该表观遗传效应具有组织特异性。在对照动物中，CpG 10位点的DNA甲基化状态与AVP基因表达呈负相关，表明DNA甲基化在AVP基因表达的精细调控中发挥作用。完成该流程后，可对分离得到的RNA进一步开展其他方法，如UPCR，以回答有关分析组织中基因表达变化等其他科学问题。观看本视频后，您应能充分理解如何研究环境因素或经验依赖性刺激所引发的 DNA 甲基化变化。

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