优化小，解剖定义的大脑区域的DNA甲基化和基因表达分析
2012年7月12日
一个精简的工作流程，研究DNA甲基化和基因表达变化后早期生活压力。从新生鼠和离散脑组织隔离母体分离开始，我们代表的协议，同时为随后的亚硫酸氢钠测序和RT-PCR分析DNA和RNA分离脑组织拳。
该程序的总体目标是研究 DNA。早期生活压力下的甲基化和基因表达变化。这是通过首先将新生小鼠幼崽进行母体分离以诱导早期生活压力来实现的，作为这里感兴趣的大脑区域的第二步，PVN 是通过局部显微解剖获得的，并且 DNA 和 RNA 同时从单个组织打孔中分离。
接下来，通过亚硫酸盐处理获得的 DNA，并通过亚硫酸氢盐 PCR 扩增感兴趣的区域。然后将其连接到载体中并转化为细菌。通过标记物表达和 PCR 片段大小来识别成功的转化。
最后，双硫化物测序用于评估甲基化状态。该工作流程的主要优点是，它可以方便地分析响应环境刺激的表观遗传编程。这种方法可以提供对早期生活逆境的表观遗传编程的见解。
它也可以应用于其他系统。在高度组织特异性的环境中分析甲基化和基因表达以及组织可用性受限的任何地方 诱导早期生活应激。对定时怀孕 C 57 黑色 6 N 母鸡的幼仔进行母体分离，以影响母体分离。
从出生后第 1 天到第 10 天，每天将每窝转移到加热干净的笼子中三个小时，让无压力的对照幼崽不受干扰。除了三个小时的分离外，所有窝产仔猪都留在母亲身边，直到产后第 21 天断奶。然后将幼崽安置在性别匹配的组中，在标准饲养条件下，每个笼子三到五只老鼠开始收集脑组织，从头骨中取出老鼠大脑，并立即将 sna 冷冻在 isop 干冰中并储存在零下 80 摄氏度。
当准备好收集组织打孔器时，从零下 80 度的冰箱中取出大脑并将它们放在干冰上。首先将大脑冷冻切片成从喙部到腱部的 10 微米冠状切片。将切片安装在超级霜载玻片上并干燥以进行波峰紫罗兰染色。
可以采集额外的玻片并在零下 20 度下储存以用于进一步分析，例如原位 2 杂交。当准备打孔时，用牙槽槽嵴紫对载玻片进行染色，以识别感兴趣的大脑结构。然后使用打孔针，使用 loco 显微解剖对感兴趣区域进行 0.8 毫米的打孔。
冲头应存放在零下 80 摄氏度的环境中。以标准化方式进行微穿孔至关重要，因为基因表达和甲基化具有高度的组织特异性。使用移液管在 400 微升硫氰酸铵缓冲液中均质化冲头，然后在室温下涡旋。
接下来，将所得裂解物通过 29 号注射器。有几次，冲头应该不再可见。将裂解物分成相等的部分。
一个用于处理 RNA，应首先进行，另一个用于处理 DNA，其可以在室温下储存，直到 RNA 在十分之一体积的乙酸钠、一个体积的水酚和一半体积的 24 个体积中处理以进行 RNA 纯化到异戊酰 AML 涡旋。每次添加后用力混合，并将最终混合物在冰上孵育 10 分钟。然后离心混合物。
收集水相并向其中加入等体积的 70% 乙醇。使用 RNA 离心柱试剂盒。进行柱上 DNA 消化，并在 25 μL 水中洗涤洗脱 RNA。
现在使用经过修改的试剂盒方案纯化 DNA，包括添加 RN a 的消化，并在使用前将 elucian 缓冲液和 elucian 柱加热至 70 摄氏度。在 70 摄氏度下 10 分钟就足够了。最后，使用分光光度计测定 DNA 和 RNA 浓度。
典型的 PVN 穿刺可产生约 600 ng DNA 和约 400 ng RA，留出约 100 ng RNA 用于基因表达分析，然后通过亚硫酸盐扩增。用市售试剂盒处理 200 ng 分离的 DNA，以扩增甲基化区域的 DNA。订购专为亚硫酸氢盐转化的 DNA 设计的引物 bi PCR 中的最佳引物设计至关重要，因为 PCR 扩增子的质量和特异性决定了以下步骤的成功与否。
当引物到达时，通过试点实验确定它们的最佳温度和跪下温度。每 25 μL 使用 2 μL 经亚硫酸盐双处理的 DNA 作为模板。PCR 混合物。
从 95 摄氏度变性 6 分钟开始扩增混合物，然后是 45 到 50 个扩增循环，最后在 72 摄氏度下伸长 5 分钟。通过 Agros 凝胶电泳分析 7 μL PCR 产物，以验证扩增子的大小。使用市售的 PCR 纯化试剂盒纯化剩余的 PCR 产物，用于后续连接。
如果获得不需要的 PCR 产物，请使用凝胶纯化来分离本实验步骤的目标产物。采用商业克隆试剂盒。克隆效率在很大程度上取决于插入片段。
因此，如果重复获得少量重组克隆，请尝试不同的克隆载体。用 1 μL 载体和 3 μL 纯化的 PCR 产物构建 10 μL 连接反应体系。通过移液混合反应物，并于第二天在 4 摄氏度下孵育过夜。
通过经典乙醇沉淀净化连接反应，并用产物转化细菌。脉冲传递后立即加入 1 毫升预热 SOB 培养基，并将转化的细菌转移到反应管中。在 37 摄氏度下回收细菌 1 小时后，将每种悬浮液的 100 微升涂布在涂有 IPTG 的 LB 氨苄青霉素板上。
一旦可以挑选菌落，Xal 将板孵育过夜。在 96 孔板中构建 25 μL 菌落 PCR 反应，每个反应中使用 3 μL 2.5 毫摩尔氯化镁。用移液器吸头挑选阳性白色克隆，并通过简单浸渍将其转移到 PCR 混合物中。
以 4 分钟的熔解循环开始 PCR。随后进行 10 个扩增循环，温度为 56 摄氏度。这些循环的每个步骤为 30 秒。
然后将温度降低到 48 摄氏度，再进行 30 次扩增循环。最后进行 5 分钟的伸长循环。现在将每种产物加载 5 μL 到 aros 凝胶上，并识别包含正确大小插入片段的反应。
使用市售试剂盒纯化目标 PCR 产物，以便使用大染料终止子循环测序对其进行测序。在 96 孔板中，加载 3 μL 大 DI 反应预混液的孔，然后加入 2 μL 纯化的菌落 PCR 产物。在热循环仪上运行反应，从 96 摄氏度下 1 分钟开始，然后是 35 个循环，分别在 96 摄氏度下 10 秒、50 摄氏度下 5 秒和 60 摄氏度下 4 分钟。
大模具反应完成后，使用大模具净化板清理反应。获得序列后，使用在线大型分析仪或 B-I-S-M-A 工具对其进行分析，以得出所研究的 DNA 区域的甲基化模式，以深入了解早期生活压力或 ELS 对 VP 表达和甲基化状态的影响。根据所述方案处理 C 57 黑棒和小鼠，打孔室旁核和视上核以分离 DNA，并对 R-N-A-D-N-A 进行亚硫酸氢盐处理，用 A VP 增强子特异性引物扩增，克隆 PCR 产物并从每只小鼠中对至少 20 个重组克隆进行测序。
分析 PCR 以确定 P-V-N-E-L-S 组织中 PCR 扩增子中包含的 CPGs 的甲基化频率，在 A VP 增强子的 4 个位置诱导显着的低甲基化，表明通过早期生活经历对该调节区域进行表观遗传标记。与 A VP 增强子的 PVN 甲基化不受 SON 中 ELS 的影响相反，这说明了对照动物表观遗传效应的组织特异性，CPG 10 的 DNA 甲基化状态与 VP 基因表达呈负相关，表明 DNA 甲基化在 VP 基因表达的微调中的作用。按照此程序，可以很容易地对分离的 RNA 进行 UPCR 等其他方法，以回答其他问题，例如分析组织中的基因表达变化。
观看本视频后，您应该对如何研究响应环境或经历的依赖性刺激的 DNA 甲基化变化有很好的了解。
概述
本文介绍了一种简化的工作流程，用于研究早期生活压力导致的DNA甲基化和基因表达变化。该协议涉及新生小鼠的母体分离，以及从特定脑组织冲击中同时分离DNA和RNA，以便后续分析。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 表观遗传学
- 发育生物学
背景
- 早期生活压力可以影响表观遗传编程。
- DNA甲基化和基因表达对于理解这些变化至关重要。
- 母体分离是在动物模型中诱导早期生活压力的常用方法。
- 从脑组织中同时分离DNA和RNA对于全面分析至关重要。
研究目的
- 研究早期生活压力对DNA甲基化和基因表达的影响。
- 开发一种协议，允许分析响应环境刺激的表观遗传变化。
- 提供有关早期逆境如何影响大脑发育的见解。
使用的方法
- 新生小鼠的母体分离以诱导压力。
- 对脑区域进行微解剖以获得组织样本。
- 从组织冲击中同时分离DNA和RNA。
- 使用亚硫酸氢盐测序和RT-PCR分析甲基化和基因表达。
主要结果
- 该协议成功从脑组织中分离DNA和RNA。
- 分析显示早期生活压力导致甲基化和基因表达的显著变化。
- 该方法可以应用于其他组织供应有限的系统。
- 研究结果有助于理解对逆境的表观遗传编程。
结论
- 开发的工作流程对于研究脑组织中的表观遗传变化是有效的。
- 结果突出了早期生活压力对基因调控的影响。
- 这项研究可以为未来关于环境对发育影响的研究提供信息。
常见问题
Executive Industry Relevance
This protocol enables simultaneous DNA methylation and gene expression analysis from anatomically defined brain regions, addressing the challenge of studying epigenetic programming in heterogeneous tissues with limited sample availability. By linking early-life stress exposure to measurable epigenetic and transcriptional changes, it supports target validation and mechanistic de-risking in neuroscience-focused drug discovery. The workflow provides a reproducible foundation for assessing environmental influences on gene regulation, informing preclinical model selection and biomarker strategy.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by correlating DNA methylation changes with gene expression in specific brain nuclei.
- Operational Value: Enables functional target validation through simultaneous isolation of nucleic acids from microdissected tissue.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying epigenetically regulated targets responsive to early-life adversity.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream epigenetic and transcriptional screening assays.
- Operational Value: Standardizes tissue processing to ensure reproducibility across anatomically defined samples.
- Scalability: Facilitates platform reuse for studying other environmental stimuli in limited tissue contexts.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase epigenetic findings to preclinical validation through disease-relevant brain regions.
- Biomarker Alignment: Enables correlation of methylation status with gene expression to support translational biomarker development.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by revealing tissue-specific epigenetic programming.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from hypothesis testing in early biology to lead identification, providing molecular readouts that bridge environmental exposure and gene regulation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking maternal separation to methylation and expression changes in defined brain areas.
- Screening: Enables assay readiness through standardized punch collection and nucleic acid isolation from microdissected regions.
- Analytics: Generates quantitative methylation and expression readouts that allow comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Connects epigenetic findings to preclinical continuity via analysis of functionally relevant nuclei like the PVN.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for studying epigenetic programming in anatomically constrained systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in epigenetic gene regulation.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through synchronized DNA/RNA isolation from single tissue punches.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling multi-omic analysis from limited samples, reducing need for separate cohorts.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying epigenetically dysregulated pathways with translational relevance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuroanatomy, microdissection, and epigenetic analysis techniques.
- Dependent on cryostat, micropunching tools, and bisulfite conversion infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization for punch localization and nucleic acid handling.
- Adaptation across brain regions requires validation of punch specificity and tissue integrity.
- Practical limitations include low yield from small punches and need for optimized input amounts for downstream assays.
