诱导星形胶质细胞受体的可塑性由神经元的放电频率操作

该程序的总体目标是诱导星形胶质细胞 GQG 蛋白偶联受体信号传导的长期增加或减少，以响应神经元突触传递的变化。这是通过首先从野生型小鼠制备急性海马切片来实现的。第二步是将 sulur Rumine 1 0 1 应用于切片以标记星形胶质细胞。

接下来，将急性海马切片在河豚毒素中孵育 4 到 6 小时以阻断神经元动作电位或在常规人工脑脊髓液中孵育。最后一步是使用背压加载方案用钙指示剂将星形胶质细胞加载到切片的放射层原子中。最终，共聚焦显微镜用于通过记录自发性和诱发的星形胶质细胞钙瞬变的变化来显示星形胶质细胞 GQ GPCR 信号活性的变化。

该方法提供了对星形胶质细胞受体可塑性和 TQG PCR 信号传导相关变化的见解。它还可用于测量神经元中代谢受体的稳态可塑性。要开始此过程，请打开颤音并确保排水管已关闭。

然后将切割室固定在颤音中，并在切割室周围放冰。接下来，将双刃剃须刀片浸泡在 70% 乙醇中 5 分钟，然后用双蒸水冲洗，去除双刃剃须刀片上的工厂油脂。小心地将其切成两半，然后将一半安装在砧板上以准备脑切片。

在培养皿中用冷冻的剃须刀片将小鼠大脑一分为二后，以允许更多的表面积用于冷却和氧合。让一分为二的半球在冰冷的切片缓冲液中静置 2 到 3 分钟，然后完全冷却并变得更坚实。之后，在颤音胶的平台上涂上一层薄薄的疯狂胶水，两个半球都贴在平台上。

将切割面朝下，侧面朝上，嗅球朝前，然后将平台固定在切割室中。用冰冷的含氧切片缓冲液填充切割室。继续给切割室充氧，同时使用颤音准备 300 微米厚的矢状旁切片后，在冰冷的含氧切片缓冲液中从每个矢状旁切片中解剖海马体和相邻的异端蛋白皮层。

要制作移液管，请折断玻璃牧场移液器的长尖端，并在破损的部分上放置移液器灯泡。将海马切片一次转移到 35 摄氏度水浴中的培养室中。请注意，为了能看到，这些步骤是在 35 摄氏度水浴外的培养室中显示的。

将海马切片在 35 度水浴中用低钙 A CSF 稀释的一微摩尔 SR 1 0 1 中孵育 20 分钟。然后将它们转移到不含 SR 1 0 1 的低钙 A CSF 中再转移 10 分钟。热恢复。

随后将切片转移到对照或实验 A CSF 中，进行剩余的 15 分钟温孵育。恢复 45 分钟后，小心地将孵育室从 35 摄氏度的水浴移至工作台，并让切片在室温下继续孵育总共 3 小时，然后再开始推注加载方案。在此过程中，当充满染料溶液时，从硼硅质玻璃毛细管中制备移液管，该毛细管的电阻约为 1.3 兆欧姆。

接下来，将海马切片放入记录室中，以每分钟 1.5 毫升的速度持续灌注含氧 A CSF，仅使用具有高百分比的健康 CA 1 封口金属细胞和光滑表面的海马切片，如果看起来不健康，请丢弃。使用微分干涉对比光学器件，在切片表面下方 40 至 70 微米的镭层中定位合适的星形胶质细胞区域。然后将预装有 D 溶液的玻璃移液器放入标准膜片钳微量电极支架中。

将其降低到场地上方的切片表面，移液管位于切片表面。对移液管施加正压以开始喷射染料。使用微型纵器将移液器缓慢降低至切片表面以下约 40 微米处，并让染料喷出约 45 至 60 秒。

然后将移液管再降低 35 微米并喷射染料约 45 至 60 秒。然后，慢慢地将移液器吸头从切片中缩回，以确保大量星形胶质细胞吸收染料。在不远处注射第二次染料推注通常会有所帮助。

为此，请将移液器抬回切片表面，并确保移液器没有堵塞。然后将移液管沿镭层从第一个注射部位移开约 80 至 100 微米，在该部位重复推注，并在星形胶质细胞成像前等待 30 至 45 分钟，以设置共聚焦显微镜进行成像。限制切片 暴露在激光下至关重要，因为高暴露会导致染料漂白和/或光毒性。

将每个激光器的默认值设置为较高的光电倍增设置、1 x 增益和 0.5% 激光输出功率小时。接下来，应用 1.5 倍缩放以更好地可视化星形胶质细胞过程。然后将场分辨率设置为 512 x 512 像素。

之后，将扫描速度设置为尽可能快，每次扫描约 1.2 秒。使用单向扫描模式，使用 503 至 548 纳米激光器的带通滤光片（488 纳米激光器）和 624 至 724 纳米（559 纳米激光器）收集发射光谱。然后通过可视化 SR 1 0 1 共标记来确认载有钙染料的细胞作为星形胶质细胞的身份。

使用 559 纳米激光器记录星形胶质细胞钙活性。首先，使用图像采集软件在细胞内感兴趣的区域上绘制方框，在这种情况下，在星形胶质细胞体上。然后在背景上画一个框作为参考。

从 ROI 获得自发钙活性的 10 分钟基线记录。之后，以顺序增加的浓度应用感兴趣的激动剂，并在两次应用之间至少留出 5 分钟，以减少可能的受体脱敏。在记录结束时，对其他星形胶质细胞 GQ 应用激动剂混合物，GPCR 作为 Inpact 星形胶质细胞 GQ GPCR 信号通路的阳性对照。

记录完成后，使用 488 纳米和 559 纳米激光拍摄静止图像，以便稍后确认星形胶质细胞身份和 ROI 放置。以下是记录区域中在对照条件或 TTX 中孵育的细胞的代表性图像，这些细胞吸收了俄勒冈绿 BAFTA 1：00 AM 钙指示剂染料和 SR 1 0 1。两个信号的叠加表明，载有钙指示框的星形胶质细胞被绘制在单个星形胶质细胞胞体上，以记录绿色通道中随时间变化的荧光强度，以监测星形胶质细胞中的钙活性。

以下是星形胶质细胞中钙活性记录盒的样本痕迹：在 TTX 中孵育的星形胶质细胞显示出自发活性增加和更强烈的诱发第一组 MGL R 钙反应，反应模式的变化证明了这一点。显示了单峰、多峰和高原钙瞬变的例子，以下是与 2.5 毫摩尔钾 A CSF 一起孵育的切片相比，星形胶质细胞钙记录的代表性痕迹，以使神经元去极化并增加其基础放电率与 5.0 毫摩尔钾 A CSF 一起孵育的星形胶质细胞 A CSF 星形胶质细胞表现出， 与对照孵育的星形胶质细胞相比，较少的自发性体钙瞬变和较弱的 DHPG 诱发反应。CSF 星形胶质细胞钙成像提供了 G 蛋白偶联受体信号传导变化的良好功能读数。

然而，它无法确定这些变化发生在信号通路的哪个位置。因此，一种互补的方法是对表达绿色荧光蛋白的星形胶质细胞使用荧光激活细胞分选或流式细胞术，然后将抗体应用于感兴趣的 G 蛋白偶联受体，然后运行蛋白质印迹以寻找受体表达水平的变化。观看此视频后，您应该对如何通过记录自发性和 Agnes 诱发星形胶质细胞中的钙事件来测量神经元突触传递变化后星形胶质细胞 tqt PCR 活性的缩放。