测定冷灵敏度和适应小鼠一种简单廉价的方法
2015年3月17日
冷足底测定 （CPA） 可测量 30 °C 至 5 °C 之间的冷反应性，也可以测量冷适应。该协议描述了如何使用 CPA 测量小鼠的冷超敏反应、镇痛和适应。
该程序的总体目标是测量小鼠的冷反应性。这是通过首先将玻璃冷却或加热到所需温度来实现的。第二步是让老鼠适应，直到它们休息。
第三步是将干冰粉在注射器中压缩成颗粒。最后一步是使用干冰颗粒和秒表测试小鼠，以测量戒断潜伏期。最终，冷种植试验用于测量自由行为小鼠的冷反应性和适应性。
与目前现有的检测方法（如丙酮测试和冷板测试）相比，我们的检测方法的主要优势在于，我们可以在各种环境条件下在基线时测试超敏反应和镇痛效果。虽然这种方法可以深入了解小鼠的冷反应性。它也可以用于其他系统，例如猴子、大鼠和人类 演示该程序的是我实验室的研究生 Daniel Brenner。
清洁玻璃表面后，用实验室胶带将 T 型细丝热电偶探头固定在玻璃板中间的表面上。将动物围栏沿中间排成一条线放在玻璃板上。然后将热电偶探头穿过中央动物围栏，并将其插入数据记录器。
打开数据记录器并关闭自动关机功能。使用提供的电缆将数据记录器连接到计算机。用黑色插件将动物围栏分开，以防止老鼠之间的视觉互动，并将镜子放在玻璃下方，以便观察围栏的底部。
要开始测试，请将铝盒放在动物两侧的玻璃板上，以固定距离围起来。如果在 30 摄氏度下进行测试，请将加热的水循环器连接到距离动物围栏 0.25 英寸的铝盒上。在堵塞排水孔的同时，将盒子装满半满的水。
放置循环器，使铝盒中的热水直接排回每一侧的循环器水箱中。您需要向每个循环器中加水。装满金属盒后，将循环器设置为 45 至 60 摄氏度，并用源源不断的热水填充铝盒。
当眼镜达到所需的温度范围时，将鼠标放在板上的外壳中。让小鼠适应设备和温度。这些小鼠将适应 2.5 小时。
当适应期接近尾声时，将冰桶装满大约一半的干冰，然后用锤子或木槌将干冰粉碎成粉末。在行为室之外执行此作，以避免打扰老鼠。接下来，使用剃须刀片或剪刀剪下 3 毫升注射器的顶部。
然后用 21 号针头在注射器的相对两侧戳两组三个孔，以减少升华产生的压力，同时将干冰压缩回行为室，将注射器腔装满一半的干冰粉。将注射器的切割端靠在扁平物体上，并使用柱塞用力压缩粉末。将压缩干冰调色板的尖端伸出注射器的边缘。
现在，测试那些四只爪子都插在玻璃里并且没有移动但未完全睡眠的小鼠。使用镜子轻柔而牢固地瞄准，将扁平颗粒压在鼠标后爪下方的玻璃表面。同时，按计时器上的 start。
当鼠标垂直或水平离开冷却的玻璃时，停止计时器并取出干冰颗粒。但是，如果鼠标非常短暂地移动爪子，然后将其返回到冷却表面，请继续计时和刺激，直到鼠标永久离开。如果鼠标没有离开冷却的玻璃，请在 20 秒后停止刺激。
重复此测试程序，直到收集动物每个爪子上的至少三个值以在 17 摄氏度下测试小鼠。重复刚才所示的实验，但不要在铝盒中装满热水，而是使用湿冰并将盒子放置在距离外壳约 0.25 英寸的地方以测试小鼠。在 12 摄氏度时，使用干冰，但盒子放置在距离外壳 1.25 英寸的地方。
这种替代方案在板的温度降低时而不是在稳定后测试小鼠。这使我们能够在设置设备后测试小鼠的适应情况。和以前一样，按照前面概述的方式进行实验，在室温下进行测量。
在室温下测量基线潜伏期后。使用前面显示的程序，用干冰填充空铝盒，并将它们放置在距离外壳两侧 1.25 英寸的地方。最后，重复实验，在玻璃板冷却时进行延迟测量。
尽可能多地进行测量。此图显示了小鼠的平均撤药潜伏期，从 12 摄氏度、17 摄氏度、23 摄氏度或 30 摄氏度开始。撤离延迟在所有温度下都是一致的。
镇痛效果可以使用冷种植测定法测量，如图所示。皮下注射每公斤吗啡 1.5 毫克会增加注射后 30 分钟小鼠的戒断潜伏期，通过注射后 60 分钟的 Bonferroni 事后测试进行双向 innova 测量。注射吗啡和注射生理盐水之间没有显着差异。
小鼠超敏反应也可以在这里测量。通过带有 bonferroni 的双向 Innova 事后测试测量，种植室内注射 10 微升完全 fros 佐剂显着降低了注射后 2 小时和 3 小时的小鼠撤药潜伏期。同一只小鼠在 4 小时皮下注射吗啡，与 3 小时相比，4.5 小时的所有撤药潜伏期都显着升高，这是通过单向 Innova 完成的事后测试测量的。
注射后 5.5 小时代谢吗啡后，注射 CFA 的小鼠的戒断潜伏期仍低于盐水注射小鼠，通过双向 inova 和 Bonferroni 事后测试测量。通过该测定可以实时测量对冷却环境变化的适应。野生型小鼠与玻璃板冷却具有相同的撤退潜伏期，这表明它们适应冷却温度的速度比使用 CPA 测量的要快，这在任何组之间都没有显着差异。
然而，当小鼠注射 U 7 3 1 2 2 以阻断 PIP 二水解时，它们的潜伏期会随着温度板的降低而减少，表明适应受损一旦掌握，这项技术可以在包括驯化时间在内的五个小时内完成。看完这个视频，你应该对如何测量清醒自由行为小鼠的冷感和适应有一个很好的了解。不要忘记，使用干冰可能非常危险，在这种方法中，您需要确保适当的通风和空气流通。
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概述
冷足底试验（CPA）是一种用于测量小鼠冷响应的方法，评估它们对温度从30°C到5°C范围内的反应。该协议还可以评估冷适应、超敏反应和镇痛作用。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 行为分析
- 动物模型
背景
- CPA旨在评估对冷刺激的疼痛反应。
- 它对理解冷超敏反应和镇痛机制至关重要。
- 该试验涉及适应小鼠以确保测量准确。
- 冷适应也可以通过这种方法进行评估。
研究目的
- 测量自由行为的小鼠的冷响应。
- 评估冷超敏反应和镇痛作用。
- 评估随时间推移的冷适应。
使用的方法
- 将玻璃冷却或加热至所需温度。
- 适应小鼠直到它们静止不动。
- 将干冰粉压成颗粒以进行测试。
- 在试验中使用秒表测量撤退潜伏期。
主要结果
- CPA有效测量小鼠的冷响应。
- 结果表明不同程度的冷超敏反应和镇痛作用。
- 冷适应可以通过重复测量进行量化。
- 该方法可靠地评估对冷刺激的疼痛反应。
结论
- 冷足底试验是神经科学研究的有价值工具。
- 它提供了对冷敏感性和疼痛机制的洞察。
- 未来的研究可以利用这种方法来探索镇痛治疗。
常见问题
Executive Industry Relevance
The Cold Plantar Assay (CPA) provides a cost-effective, quantitative method for assessing cold sensitivity and adaptation in murine models, supporting early-stage target validation in analgesic discovery. By enabling measurement of both hypersensitivity and analgesia under controlled thermal conditions, the assay enhances predictive confidence in preclinical pain research and informs go/no-go decisions for therapeutic candidates targeting neuropathic or inflammatory pain pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of thermal nociception pathways and functional validation of targets involved in cold hypersensitivity and analgesia.
- Operational Value: Supports biological de-risking by quantifying withdrawal latency changes in response to pharmacological or genetic manipulations.
- Predictive Value: Generates reproducible behavioral readouts that aid in portfolio triage of analgesic candidates based on mechanism-specific effects on cold sensitivity.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, unambiguous withdrawal latency measurements suitable for high-fidelity compound screening across temperature gradients.
- Operational Value: Facilitates assay reproducibility and scalability through defined acclimation, stimulation, and timing protocols using accessible materials like dry ice and glass plates.
- Platform Utility: Enables evaluation of test compounds for analgesic efficacy and adverse sensory effects, supporting lead optimization in pain therapeutics.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models temperature-dependent sensory adaptation, allowing study of thermosensory plasticity relevant to clinical conditions like neuropathic pain and cold allodynia.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical phases by providing quantifiable, translatable endpoints for assessing drug-induced changes in thermal perception.
- Risk Mitigation: Supports mechanistic de-risking by distinguishing true analgesic effects from nonspecific motor or sedative confounds through temperature-specific behavioral profiling.
Pipeline & Workflow Integration
The CPA fits within the discovery-to-preclinical continuum, serving as a phenotypic screening tool for target engagement and functional validation in pain research programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of ion channels (e.g., TRPM8) and GPCRs involved in cold transduction, enabling mechanistic insight into thermal pain pathways.
- Screening: Delivers quantitative, temperature-dependent withdrawal latency outputs that allow comparison of compound effects across multiple thermal challenge points.
- Analytics: Generates latency metrics amenable to statistical analysis (e.g., two-way ANOVA with post-hoc testing), enabling robust comparison of treatment groups.
- Translational Research: Connects to preclinical validation by modeling adaptive thermosensory responses, informing dose selection and therapeutic window estimation.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform across analgesic discovery projects due to low cost, minimal equipment needs, and compatibility with freely behaving murine models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in thermal pain phenotyping.
- Operational Value: Delivers high reproducibility and low technical variability through standardized acclimation and stimulation procedures.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of mechanism-specific analgesic profiles, reducing late-stage failure due to lack of target engagement.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on their ability to modulate cold hypersensitivity or analgesia without affecting baseline thermoregulation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in behavioral neuroscience and rodent handling to ensure consistent acclimation and accurate latency measurement.
- Depends on basic laboratory equipment including glass plates, dry ice, syringes, thermocouple probes, and data loggers for temperature monitoring.
- Necessitates standardization across teams for acclimation duration, stimulus application force, and withdrawal criteria to ensure cross-site reproducibility.
- Involves adaptation considerations when translating to other species (e.g., rats) or environmental conditions, as thermal sensitivity thresholds vary by model.
- Limited by the need for careful dry ice handling and ventilation controls due to sublimation hazards and potential confounding effects from CO2 exposure.
