Name: 测定冷灵敏度和适应小鼠一种简单廉价的方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: 了解冷足底实验法，用于测定小鼠冷敏感性与适应性。该方法通过干冰颗粒刺激后爪并测量缩足潜伏期，可评估冷痛觉过敏、镇痛效果及神经适应机制，为疼痛研究提供可靠工具。

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作者谨此感谢Gereau实验室全体成员在稿件编辑方面的贡献。本研究得到NINDS基金1F31NS078852（资助DSB）和NINDS基金NS42595（资助RWG）的支持。

所有小鼠实验方案均遵循美国国立卫生研究院指南，并已获得华盛顿大学医学院动物研究委员会（美国密苏里州圣路易斯）的批准。
1. 准备测试板和围栏
<ol>
	<li>清洁玻璃表面。</li>
	<li>使用实验室胶带将T型丝状热电偶探头固定在玻璃板中央的表面上。</li>
	<li>将动物饲养盒沿玻璃板中央呈单列放置在玻璃板上。</li>
	<li>将热电偶探头穿过中间的动物饲养盒，并插入数据记录仪。开启数据记录仪，同时关闭自动关机功能，并使用提供的数据线将数据记录仪连接至计算机。
	<ol>
		<li>若需在实验过程中记录玻璃板温度，请打开数据记录仪软件以开始记录板温。</li>
		<li>如有需要，调整软件设置，使板温每秒记录一次。</li>
		<li>使用随热数据记录仪提供的配套软件开始温度记录。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用黑色隔板将各饲养盒分隔开，以防止小鼠之间发生视觉接触。</li>
	<li>将镜子置于玻璃板下方，调整位置，以便从舒适的坐姿可清晰观察到饲养盒的底面。</li>
</ol>
2. 加热/冷却玻璃板
<ol>
	<li>将铝盒中装入温水、湿冰或干冰，并将其适当地放置在玻璃板上（也可使用装有干冰的铝箔包裹小包来冷却玻璃）； 图1)2.
	<ol>
		<li>30时进行测试 &#176;C，将铝盒放置在距离约0.25&#8217;&#8217; 远离动物饲养区（图2B)2.
		<ol>
			<li>在玻璃板两侧各放置一台加热循环水浴。将循环水浴温度设置为 45 - 60 &#176;C，并用它向铝盒中持续注入热水（图1C)2.</li>
			<li>将循环水浴装置放置在铝制盒子的两侧，使铝盒中的热水直接回流到每侧循环水浴的储水槽中（图1C)2.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在室温下测试时，保持盒子为空（图2)2.</li>
		<li>17时进行测试 &#176;C，将盒子放置在大约 0.25 的位置&#8217;&#8217; 远离动物饲养区的两侧，并用湿冰填满（图2)2.</li>
		<li>用于12的测试 &#176;C，将盒子放置在大约1.25的位置&#8217;&#8217; 远离两侧的围栏，并用干冰填充（图2)2.</li>
		<li>5 测试 &#176;C，将盒子放置在大约 0.25 的位置&#8217;&#8217; 远离两侧的围栏，并用干冰填充（图2)2.
		<ol>
			<li>使用干冰冷却玻璃时，务必确保有充足的通风，以防止二氧化碳积聚2 房间内积聚</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>等待玻璃达到所需的温度范围。</li>
	<li>将小鼠放入板上的围栏中。 
	注意：可使用白噪声发生器以减少噪声干扰。</li>
	<li>等待小鼠适应环境。 
	注意：在我们的实验室内，此过程大约需要2.5小时，但具体时间可能因动物饲养和操作条件的不同而有显著差异。</li>
	<li>通过确保盒子内装满温水、湿冰或干冰，将玻璃保持在所需的温度范围内。 
	注意：使用本设备时，盒子大约每90分钟需要重新加满冰一次。 
	注意：对于17 &#176;在C条件下，重新加冰之前，通过铝盒的排水孔排掉大部分水会更有利。这有助于更好地稳定温度，并防止溢出 
	注意：干冰的具体用量会随季节变化而有所不同，但通常应使盒子中的干冰量保持充足 &#188; 在整个盒子的长度上完全填充可保持温度恒定。</li>
</ol>
3. 在固定温度下对小鼠进行测试
<ol>
	<li>在行为学实验室外，将一个冰桶装入约一半体积的干冰。</li>
	<li>使用锤子或橡胶锤将干冰敲碎成细粉。 
	注意：冰桶装得过满会导致干冰难以完全粉碎成粉末。</li>
	<li>使用直剃刀片或剪刀，将一支3 ml注射器的顶部剪去。</li>
	<li>使用21 G针头，在注射器两侧相对位置各打3个孔（共6个孔）。 
	注意：这些孔可降低干冰升华时压缩过程中产生的压力。剪去顶部的注射器可在多次实验中重复使用。</li>
	<li>将注射器、干冰粉末和手持秒表带入行为学实验室内。</li>
	<li>将注射器筒腔装入约一半体积的干冰粉末。将注射器剪断的一端紧贴于平整物体表面，用推杆用力压实粉末。操作时需小心；塑料推杆可能因压力而弯曲或断裂。若发生此情况，应从新的注射器上更换推杆。</li>
	<li>将压实后的干冰颗粒尖端伸出注射器边缘。</li>
	<li>测试处于完全静息状态的小鼠。
	<ol>
		<li>在30 °C、23 °C和17 °C条件下，测试四只脚均位于玻璃表面且无移动、但未完全入睡的小鼠19。</li>
		<li>在12 °C和5 °C条件下，测试以两只脚或四只脚站立、无移动或跳跃行为的小鼠。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>利用镜子进行定位，轻轻但牢固地将平整的干冰颗粒紧贴于小鼠后爪下方的玻璃表面（图1A）2，同时启动手持计时器。</li>
	<li>当小鼠离开冷却的玻璃表面时，停止计时并移除干冰颗粒。 
	注意：回缩动作可以是垂直或水平方向。
	<ol>
		<li>若小鼠短暂移动脚爪后又将其放回冷却表面，则继续计时和刺激，直至小鼠永久性离开。 
		注意：本实验室在大多数情况下对小鼠设定的最大刺激时间为20秒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>重复此测试程序，直至每只动物每只脚至少获得3个有效数值。测试同一只小鼠左右对侧脚爪的试验之间应至少间隔7分钟，同一脚爪的连续测试之间应至少间隔15分钟。</li>
	<li>如有需要，可使用不同厚度的玻璃以产生不同的冷却速率（图3）1。 
	注意：冷却速率与玻璃厚度呈负相关。</li>
</ol>
4. 冷适应期间小鼠的检测
注意：这是一种替代方案，允许在玻璃板冷却过程中进行测试，而不是在玻璃板温度稳定且小鼠已完全适应寒冷环境后进行。
<ol>
	<li>按照第1节列出的说明设置仪器。</li>
	<li>按照第3节列出的说明在室温下（RT）进行基线测量（图7A）2。</li>
	<li>使用干冰预冷铝盒。</li>
	<li>在完成基线撤回潜伏期测量后，将预冷的铝盒放置在玻璃板上，位于两侧围栏外约1.25英寸处（图7A，标有“加入干冰”的箭头）2。</li>
	<li>按照第3节列出的说明，在玻璃板冷却过程中进行测量，尽可能频繁地记录数据。</li>
</ol>

<ol><li>Brenner, D. S., Golden, J. P., Gereau, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Behavioral+Assay+for+Measuring+Cold+Sensation+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+ONE%22%5BJournal%5D)">A Novel Behavioral Assay for Measuring Cold Sensation in Mice.</a> Plos ONE. 7 (6), 8(2012).</li>
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<li>Fujita, F., Uchida, K., Takaishi, M., Sokabe, T., Tominaga, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ambient+Temperature+Affects+the+Temperature+Threshold+for+TRPM8+Activation+through+Interaction+of+Phosphatidylinositol+4%2C5-Bisphosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Ambient Temperature Affects the Temperature Threshold for TRPM8 Activation through Interaction of Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphate.</a> Journal of Neuroscience. 33 (14), 6154-6159 (2013).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露

CPA 可用于评估小鼠的冷敏感性和冷适应性。它提供了一种经济高效的方法，可在多种温度范围内对未受束缚且已适应环境的动物进行冷反应测量。此外，该方法可产生明确的行为反应，并提供易于量化和分析的输出变量。该方法已用于评估由炎症1、神经病理性损伤1、镇痛药物1、基因敲除20以及基因特异性神经元消融研究26所诱导的冷敏感性变化。通过使用不同厚度的玻璃，可对该方法进行修改以测量对不同冷却速率的反应；同时，也可通过使用不同尺寸的注射器来改变施加的冷刺激面积。
正确实施该检测最关键的步骤是在测试过程中均匀地冷却或加热玻璃板。仔细安放铝盒，使其在动物饲养区域两侧均匀分布，有助于产生更均匀的温度。在玻璃板上做标记以标准化不同实验间铝盒的放置位置，也可提高检测的可重复性，但这些标记可能需要根据建筑物内季节性温度变化定期重新校准。
在实验过程中，保持玻璃板温度的恒定也可能具有挑战性。确保铝盒始终均匀地装满干冰/湿冰或温水，可使实验中的板温保...

在啮齿类动物中测量对寒冷的反应性，对于增进理解人类在正常和病理条件下寒冷敏感性的潜在机制具有重要意义。冷板行为检测法（Cold Plantar Assay，CPA）最初于数年前开发1，旨在在室温下施加冷刺激时，产生可重复且明确的小鼠行为反应。该检测方法的近期改进使其能够在较宽的温度范围内可重复地测量寒冷敏感性2。这两种版本均设计为通量相对较高，且使用成本低廉。
利用其他行为学方法研究冷敏感机制已取得很大进展。其中一种方法是丙酮蒸发试验，该方法涉及将丙酮滴加或喷洒在小鼠足掌上，并测量小鼠 flicking（快速抽动）足掌所持续的时间3,4。然而，丙酮蒸发引起的反应会受到丙酮湿润感和气味的干扰。此外，丙酮蒸发试验中施加的冷刺激强度会因丙酮用量不同而变化，难以量化。最后，未受伤的小鼠在基线状态下对丙酮的反应极微弱，因此该方法无法在无痛觉过敏的情况下测量镇痛效果。
另一种经典的冷反应检测方法是尾 flick 实验，即将动物尾巴浸入冷水中，测量其回缩的潜伏期5,6。尽管该实验中的行为反应明确，且能够测量动物对特定温度的反应，但实验过程中必须固定动物，而固定可能通过已知的应激诱导镇痛机制改变其对冷刺激的敏感性7。
另一种常用的工具是冷板实验，通过将小鼠放置在帕尔帖冷却板上，测量其行为反应8-10。尽管该工具可提供动物在特定温度下反应的相关信息，但其应用也存在不一致的情况；不同研究团队测量的反应类型各不相同，包括跳跃次数8,11、首次反应的潜伏期8,11-13以及抬足次数11,13,14，所得结果差异显著。此外，冷板实验的通量相对较低，每次只能测试一只动物，且需要使用昂贵且易损的帕尔帖装置。
双板温度偏好实验是冷板实验的一种常用衍生方法，用于测量动物在两个相连但温度不同的板上所花费时间的相对比例9,15-17。另一种类似的常用检测方法是热梯度实验，该方法通过测量小鼠在一块长金属板上不同温度区域（温度范围为5 °C至45 °C）停留的时间来评估其温度选择行为16。尽管这些实验可用于温度间的比较，但尚不明确动物的行为反映的是对温度的厌恶还是对温度的偏好。
最后，动态冷板实验已被用于测量小鼠对变化环境温度的反应18。该方法涉及将小鼠放置在室温帕尔帖装置上，并将温度逐渐降至1 °C，同时测量在不同板温下小鼠跳跃或舔舐足爪的次数。虽然该方法可用于测试小鼠对降温环境的适应能力，但它无法检测小鼠在较低环境温度背景下对冷刺激的反应。此外，该方法需要昂贵的设备，且在测量小鼠冷敏感性之前，无法使小鼠对测试设备进行适应性驯化。
为了补充这些检测方法，冷板试验（CPA）可用于检测在多种温度范围内或适应寒冷环境温度过程中，对明确定义的冷刺激所产生的适应性反应。使用现有的设备，该试验可同时检测多达14只小鼠，并且具备低成本扩展的潜力，适用于高通量检测。

<table><tbody><tr><td> T型热电偶探头 </td><td> Physitemp </td><td> IT-24p </td><td> 用于测量玻璃表面温度（http://www.physitemp.com/products/probesandwire/） </td></tr><tr><td> 玻璃板 </td><td> 当地玻璃公司（位于圣路易斯，Stemmerich Inc） </td><td></td><td> 我们使用派热克斯玻璃（浮法硼硅酸盐玻璃）。本实验室通常使用1/4英寸厚的玻璃，但3/16英寸和1/8英寸厚度的也有用处 </td></tr><tr><td> 温度数据记录仪 </td><td> Extech </td><td> EA15 </td><td> 用于持续监测玻璃温度的温控记录仪（http://www.extech.com/instruments/product.asp?catid=64&amp;amp;prodid=408） </td></tr><tr><td> 3 ml 注射器 </td><td> BD </td><td> 309657 </td><td> 将注射器顶部切除，并在其中压缩干冰以制成冷探针 </td></tr><tr><td> 计算机 </td><td> 若使用Extech记录仪，则任何PC均可使用 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 铝制盒子 </td><td> 圣路易斯华盛顿大学机械加工车间 </td><td></td><td> 盒子尺寸为长3英尺、宽4.5英寸、高3英寸，带密封盖。&amp;nbsp; 每个盒子的短边靠近底部处钻有一个1/2英寸的孔。当盒子中装入湿冰或热水时，这些孔用橡胶塞密封。 </td></tr><tr><td> 加热水循环器 </td><td> VWR </td><td></td><td> 任何带泵的水循环器型号均可使用 </td></tr><tr><td> 21 G 针头 </td><td> BD </td><td> 305165 </td><td> 针头的确切尺寸并不重要 </td></tr><tr><td> 手持计时器 </td><td></td><td></td><td> 任何手持计时器均可使用 </td></tr><tr><td> 镜子 </td><td></td><td></td><td> 任何平面镜均可使用 </td></tr></tbody></table>

一种测定小鼠冷敏感性与冷适应的简单且经济的方法

A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice

冷过敏是一种严重的临床问题，影响着广泛的患者群体，并导致生活质量显著下降。冷板实验能够对小鼠的冷敏感性进行客观且经济的评估，可定量检测镇痛和过敏反应。将小鼠适应于玻璃板上，然后将压缩的干冰颗粒紧贴于后爪下方的玻璃表面。小鼠对冷却玻璃产生回缩反应的潜伏期被用作衡量冷敏感性的指标。
在具有季节性温度变化的地区，冷觉对于生存也至关重要，为了保持敏感性，动物必须能够调节其热反应阈值以适应环境温度。冷足底试验（Cold Plantar Assay, CPA）还可通过在30 °C至5 °C的不同环境温度下测试小鼠的冷敏感性，来研究动物对环境温度变化的适应能力。小鼠的适应过程如上所述，但需使用装有热水、湿冰或干冰的铝盒（或铝箔包裹物）将玻璃板冷却至所需的起始温度。通过T型热电偶探针在玻璃板中心位置测量板面温度。当玻璃板达到所需起始温度后，按上述方法对动物进行测试。
该实验可对小鼠在从无害到有害的温度范围内进行测试。条件性位置回避（CPA）在未受伤小鼠中可产生明确且一致的行为反应，可用于量化冷痛觉过敏和镇痛效应。本方案描述了如何利用CPA测量小鼠的冷痛觉过敏、镇痛作用及适应性。

从小鼠在 30 °C、23 °C、17 °C 和 12 °C 起始时引发的行为反应具有高度可重复性（图 4A）20。为了测量在后爪下方产生的冷刺激，使用氯胺酮/赛拉嗪/乙酰丙嗪混合物对小鼠进行麻醉，并将其足爪固定在玻璃表面，玻璃上方放置T型细丝热电偶（图 4B）20。玻璃被冷却或加热至所需的测试温度范围。尽管平板沿其长度方向的冷却较为均匀（图 5A）2， 但应注意，在行为实验箱内会形成一个冷梯度（图 5B）2。实验箱中靠近两侧干冰的部分温度较低，而中央区域则略高（图 5B）2。在所使用的最低温度下，小鼠大部分时间停留在实验箱的中央区域。当玻璃板温度稳定后，将局部干冰刺激施加于足爪/热探头下方的玻璃上。根据该装置记录的温度曲线可知，使用 CPA 产生的冷刺激在各个温度范围内均具有高度可重复性（图 4C</stron...

冷板试验（CPA）用于测量30 °C至5 °C之间的冷反应性，也可用于测量冷适应。本方案描述了如何使用CPA在小鼠中测量冷超敏反应、镇痛作用及冷适应。

冷过敏是一种严重的临床问题，影响着广泛的患者群体，并导致生活质量显著下降。冷……

本实验的总体目标是测量小鼠对寒冷的反应性。首先将玻璃表面冷却或加热至所需温度，以实现这一目标。第二步是使小鼠适应环境，直至其处于静息状态。第三步是将干冰粉末在注射器中压制成颗粒。最后一步是使用干冰颗粒和秒表测试小鼠，测量其缩足潜伏期。最终，冷板实验用于测量自由活动小鼠对冷刺激的反应性及适应性。与现有的丙酮试验和冷板试验相比，我们的检测方法的主要优势在于，可以在多种环境条件下，于基线水平同时检测痛觉过敏和镇痛作用。尽管该方法能够揭示小鼠对冷刺激的反应性，但它也可应用于其他系统，例如猴、大鼠以及人类。本实验操作将由我实验室的研究生 Daniel Brenner 演示。清洁玻璃表面后，使用实验室胶带将T型热电偶探头固定在玻璃板中央的表面上。将动物饲养盒沿中线单排放置在玻璃板上。然后将热电偶探头穿过中央的动物饲养盒，并插入数据记录仪中。打开数据记录仪并关闭自动关机功能。使用提供的数据线将数据记录仪连接到计算机。使用黑色隔板将动物饲养盒分隔开，以防止小鼠之间发生视觉接触，并在玻璃下方放置镜子，以便观察饲养盒的底部。开始测试时，将铝制盒子放置在动物两侧的玻璃板上，盒子与动物围栏保持固定距离。若在30摄氏度下进行测试，将加热循环水装置连接到距离动物围栏0.25英寸的铝制盒子上。在堵住排水孔的同时，向盒子中注入半满的水。将循环水浴的位置调整至铝盒中的热水能够直接回流到两侧循环水浴的储水槽中。需要向每个循环水浴中加水。待金属盒注满水后，将循环水浴温度设定为 45 至 60 摄氏度，并用持续的热水流填充铝盒。当载物台温度达到所需范围后，将小鼠放入载物台上的围栏中。让小鼠适应仪器和温度环境。这些小鼠将适应2.5小时。接近适应期结束时，在行为学实验室外取一个冰桶，装入约半桶干冰，并使用锤子或橡胶锤将干冰敲碎成粉末，以避免干扰小鼠。随后，使用刀片或剪刀将一个3毫升注射器的顶部剪去。然后使用21号针头在注射器相对的两侧各打三组孔，以减少在行为学实验室内压缩干冰时因升华产生的压力。将注射器筒腔填充至一半容量的干冰粉末。将注射器的切割端紧贴一个平面物体，用活塞用力压缩粉末。使压缩后的干冰柱体尖端伸出注射器边缘。 现在，测试那些四只脚掌均在玻璃表面且未移动但尚未完全入睡的小鼠。使用镜子辅助定位，将扁平的药丸轻轻但牢固地压在小鼠后肢脚掌下方的玻璃表面上，同时启动计时器。当小鼠的爪子从冷却的玻璃表面移开（无论是垂直还是水平方向）时，停止计时并移除干冰颗粒。然而，如果小鼠的爪子只是短暂移动后又立即回到冷却表面，则应继续计时和刺激，直到小鼠彻底离开冷却表面为止。如果小鼠在20秒内未主动移开，则在20秒后停止刺激。重复此测试步骤，直至收集到每只动物每只爪子至少三个数值，以在17摄氏度条件下测试小鼠。重复上述实验操作，但不再向铝制盒子中注入加热的水，而是使用湿冰，并将盒子放置在距离饲养箱约0.25英寸的位置以测试小鼠。在12摄氏度条件下使用干冰，但盒子应放置在距离饲养箱约1.25英寸的位置。该替代方案在平板温度下降过程中而非温度稳定后对小鼠进行测试。这使我们能够在小鼠适应过程中实时检测其适应能力。在设置好仪器后，与之前相同，按照先前所述的实验步骤在室温下进行测量。在室温下测量完基线潜伏期后，使用先前展示的步骤，将空的铝盒中装入干冰，并将其放置在两侧距培养盒1.25英寸的位置。最后，重复实验，以获取玻璃板冷却过程中的潜伏期测量值。尽可能频繁地进行测量。该图表显示了小鼠在起始温度分别为 12 摄氏度、17 摄氏度、23 摄氏度或 30 摄氏度时的平均缩足潜伏期。在所有温度条件下，缩足潜伏期均保持一致。镇痛效果可通过冷板实验进行测定，如图所示。皮下注射1.5毫克/千克的吗啡后30分钟，小鼠的缩足潜伏期显著延长，该结果通过双因素方差分析结合注射后60分钟的Bonferroni事后检验测定。吗啡注射组与生理盐水注射组之间无显著差异。此处也可测量小鼠的过敏反应。通过足底注射 10 微升完全弗氏佐剂，可在注射后 2 小时和 3 小时时显著降低小鼠的缩足潜伏期，该结果经双因素方差分析结合 Bonferroni 事后检验测定。同一批小鼠在注射后 4 小时接受皮下注射吗啡，于 4.5 小时测得的所有缩足潜伏期均较 3 小时显著升高，该结果经单因素方差分析结合 Dunnett 事后检验测定。在注射后5.5小时，吗啡代谢完成后，经CFA注射的小鼠的缩足潜伏期仍短于生理盐水注射小鼠，该差异通过双因素方差分析结合Bonferroni事后检验测定。该检测方法可实时测量动物对降温环境变化的适应能力。随着玻璃板温度降低，野生型小鼠的缩足潜伏期保持不变，表明它们对降温的适应速度超过了CPA所能检测的范围，各组之间无显著差异。然而，当小鼠被注射 U 7 3 1 2 2 以阻断 PIP 二水解后，随着温度平台的降低，其潜伏期缩短，表明其适应能力受损。一旦掌握，包括适应时间在内，该技术可在五小时内完成。观看本视频后，您应能够充分理解如何在清醒且自由活动的小鼠中测量冷觉感知与适应能力。请务必注意，操作干冰具有极高的危险性，需确保实验过程中有适当的通风和空气流通。

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