小鼠量度本地过敏反应
October 14th, 2014
过敏性反应，其特征在于由肥大细胞和嗜碱性粒细胞的活化，是由交联的IgE和炎症介质的释放驱动。过敏性反应的定量评估可以用伊文思蓝染料监察过敏原刺激后改变血管通透性来实现。
该程序的总体目标是测量血管通透性的变化，以量化局部过敏反应。这是通过首先使动物对过敏原（如 O 白蛋白）敏感来实现的。第二步是通过皮内注射过敏原来挑战耳朵。
然后将 Evan 的蓝色染料注射到尾静脉中。最后一步是通过孵育过夜从受攻击的耳朵中提取染料。在形式上，酰胺最终是一种光谱光度法，用于量化进入耳朵的染料量。
与现有方法相比，该技术的主要优点是染料外渗是通过光谱法测量的。这意味着该测定不容易受到观察者偏差的影响。一般来说，刚接触这种方法的人会很挣扎，因为皮内和尾静脉注射在技术上具有挑战性，需要大量练习才能达到熟练程度。
首先将等分试样的卵原液置于室温下使用。在室温下，将卵原液稀释至每毫升 1 毫克浓度。使用 5 毫升聚苯乙烯圆底管。
以中等速度涡旋试管，并小心加入等体积的完全均质化的样品。将明矾滴加到 ova 溶液中。同时，使用相同的技术以一比一的比例制备混入 PBS 中的明矾的阴性对照溶液。
然后盖上试管并将它们固定在涡旋上。在连接试管的情况下，以最低设置运行涡旋半小时。溶液准备好后，立即进行 BAB 小鼠致敏。
将卵明矾混合物装入 1 毫升注射器中。然后用 27 号针头将 100 微升注射到每只小鼠的腹膜中。在接下来的三周内，对使用不含卵的明矾溶液的阴性对照小鼠重复此作。
重复此过程，在最后一次注射后每只小鼠总共注射 3 次，至少等待两周后再从冷冻卵子原液中进行局部过敏反应测定。首先在 PBS 中制备每毫升 5 毫克的工作溶液。使用 5% ISO 氟短暂涡旋。
麻醉致敏的小鼠，当它变得不动时，将 iso 氟调低至 3%现在将 10 微升卵制剂装入三个 10 胰岛素注射器，并用 31 号针头盖住它，并在第二个注射器中装入 10 微升 1 个 XPBS。接下来，在解剖显微镜下用透明胶带粘性面包裹一根 15 毫升的锥形管，将麻醉小鼠左耳的背侧固定到管子上。将 PBS 注射器的针头斜面朝上插入耳朵的两片叶子之间，然后慢慢注入全部 10 微升。
避免撞击血管。注射成功将导致明显的皮内波动。将整个音量注入耳朵至关重要。
如果任何液体从注射部位泄漏出来，则动物不能用于分析。此外，如果针头完全穿过耳朵或划伤耳朵表面，则检测无效，因为这些创伤会混淆结果进入右耳。在三分钟内使用相同的方法注射卵子。
将鼠标转移到限制器上，并将其放在加热灯下。然后缓慢地将 200 微升 0.5% 埃文思蓝染料注入尾静脉。使用 27 号针头，如果在注射所有染料之前血管被破坏，快速注射可能会造成损害。
继续在尾巴的另一侧注射。现在等待 10 分钟，然后用二氧化碳对小鼠实施安乐死，然后进行宫颈脱位。动物被安乐死后，用镊子和剪刀去除耳朵。
用镊子抓住耳边，不要对注射部位施加压力。然后切近耳朵底部的软骨脊，但不要穿过耳朵底部的软骨脊。收集尽可能多的组织。
现在采取适当的预防措施，将每只耳朵的 700 微升甲酰胺分装到微量离心管中。将耳朵转移到每个管子上，并在 63 摄氏度的干热块中孵育过夜，第二天大部分染料将被提取，但耳朵可能会出现轻微的蓝色。将每个样品 300 微升一式两份添加到 96 孔板中。
避免转移任何毛皮，不要为空白形成任何气泡。用 300 微升甲酰胺加载两个孔。然后测量 620 纳米处的吸光度。
从背景中减去值并分析结果。PBS 致敏动物对卵子攻击或 PBS 攻击没有反应。不出所料，两只耳朵都是白色的。
在 OVA 致敏动物中接受 PBS 攻击的年份是全白色或浅蓝色，定位于注射部位，在那里他的耳朵接受 OVA 攻击在施用染料后 10 分钟内逐渐变暗，PBS 致敏动物的 IDE 处理的耳组织在 PBS 和 OVA 攻击后吸光度读数可以忽略不计。而对于卵致敏动物，PBS 注射通常导致平均吸光度读数为 0.13。相反，50 μg 卵子攻击导致平均吸光度读数为 0.58。
用于挑战的卵子数量可以在限制内进行调整。例如，20 μg 的激发试验导致平均吸光度为 0.30。然而，小于 20 μg 的激发试验并未给出可靠的结果。
虽然一旦一个人精通皮内和静脉注射就具有挑战性，但这项技术可以在大约 15 分钟内对一只动物进行。两个人一起工作，一个人进行耳部注射，另一个进行尾静脉注射。该程序可以在大约一个小时内对 10 只动物进行。该测定法用途广泛，因为它可用于主动和被动皮肤过敏反应。
它也可用于多种过敏原。不要忘记 isof 氟会对人类生殖系统产生负面影响。仅在通风良好的房间内使用，并在诱导室上安装一个清除罐，以中和废气（如果您怀孕）。
使用氟时，请佩戴碳过滤面罩以尽量减少接触。
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概述
这项研究的重点是测量血管通透性的变化，以量化局部过敏反应。该方法包括使动物对过敏原敏感化，并通过皮内注射挑战它们，随后使用Evans Blue染料来评估反应。
关键研究组成部分
科学领域
- 过敏研究
- 免疫学
- 血管生物学
背景
- 过敏反应涉及肥大细胞和嗜碱性粒细胞。
- IgE交联触发促炎介质的释放。
- 定量评估对理解过敏反应至关重要。
- Evans Blue染料是监测血管通透性的常用工具。
研究目的
- 测量血管通透性的变化。
- 在受控环境中量化局部过敏反应。
- 使用可靠的方法评估过敏反应。
使用的方法
- 使动物对过敏原敏感化（例如，O白蛋白）。
- 将过敏原皮内注射到耳朵中。
- 将Evans Blue染料注射到尾静脉。
- 在过夜孵育后从受挑战的耳朵中提取染料。
主要结果
- 使用分光光度法定量染料。
- 评估挑战后血管通透性的变化。
- 证明该方法在测量过敏反应方面的有效性。
- 对过敏反应动态的洞察。
结论
- 该方法提供了一种定量方法来研究过敏反应。
- Evans Blue染料有效监测血管变化。
- 研究结果有助于理解过敏机制。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantitative measurement of local anaphylaxis in mice provides a robust platform for evaluating vascular permeability changes in response to allergen exposure. This assay enables objective, reproducible assessment of allergic responses, supporting early-stage target validation and mechanistic de-risking in immunology-focused discovery pipelines. Reliable quantification of localized allergic reactions informs portfolio decisions and prioritization of immunomodulatory candidates.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of allergen-induced vascular permeability as a functional readout for immune activation.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing specific allergen responses from background reactivity.
- Provides quantitative data to inform target validation and early triage of immunological pathways.
Screening & Assay Development
- Establishes a validated, observer-independent assay for reproducible measurement of allergic responses.
- Facilitates standardization of challenge and readout conditions for downstream compound screening.
- Delivers quantitative outputs suitable for comparative evaluation of candidate interventions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant mechanisms by modeling localized anaphylactic responses in vivo.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation of anti-allergic or immunomodulatory agents.
- Supports risk-adjusted advancement by providing predictive data on vascular response to allergen challenge.
Pipeline & Workflow Integration
This local anaphylaxis assay fits within the early discovery to preclinical continuum, bridging mechanistic studies and translational evaluation of immune responses.
- Discovery Biology: Quantifies allergen-induced vascular permeability to clarify immune pathway activation.
- Screening: Provides a reproducible, quantitative assay for evaluating candidate compounds or interventions.
- Analytics: Utilizes spectrophotometric absorbance measurements for objective comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Models disease-relevant allergic responses to inform preclinical candidate selection.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized platform adaptable to various allergens and experimental designs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in allergic response studies.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through standardized, observer-independent quantification.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by providing robust early-stage data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of immunology and allergy-focused assets.
Implementation Considerations
- Requires technical proficiency in intradermal and intravenous injections for reliable results.
- Needs access to spectrophotometric instrumentation for quantitative dye measurement.
- Demands cross-team standardization of allergen preparation and challenge protocols.
- Adaptable to a range of allergens and mouse strains with appropriate optimization.
- Potential limitations include technical variability and the need for careful control of injection accuracy.
