最大等长收缩力的测量通过透骨骼肌纤维生成
2015年6月16日
化学剥皮，或透化，骨骼肌纤维的收缩特性的分析提供了强有力的手段，其中在单个肌细胞的水平来评估肌肉功能。在这篇文章中，我们勾勒出一个有效和可靠的技术准备和测试透骨骼肌纤维体外 。
该程序的总体目标是测量化学渗透骨骼肌样本中单个纤维的最大等距力产生能力。这是通过首先将肌纤维膜暴露于化学洗涤剂中来实现的，从而消除细胞外和细胞内内容物之间的屏障。第二步是从一小束纤维中提取一根纤维并将其连接到实验装置上。
接下来，使用激光干涉图案来设置单根光纤的最佳肌节长度。最后，施用钙以产生最大的等长收缩力。最终，渗透单纤维技术提供了对骨骼肌收缩特性的评估，而没有与整个肌肉结构相关的复杂性。
这种方法的视觉演示非常有用，因为成功执行协议的关键步骤可能难以学习。首先，按照随附的文本协议中的说明准备解剖、储存和测试解决方案。接下来，使用镊子从 USP 10 零单丝尼龙缝合线中制备缝合环。
使用双反手结技术，为每根要测试的纤维准备四个线圈。形成后，将结放在显微镜下，将其尺寸减小到大约 750 微米的直径。使用 IPS GTI 标记作为指南。
然后修剪任何多余的缝合线，只留下两侧的环和 500 微米的小尾部。将通过开活检或穿刺活检获得的一小块肌肉组织转移到装有冷冻解剖液的培养皿中，并添加更多解剖液以确保组织保持浸没状态。在显微镜下检查样品并纵纤维的纵轴对准研究者的右肩。
然后用左手的镊子和右手的显微解剖剪刀将样品固定在培养皿的角落，将样品固定在培养皿上。开始沿着纤维之间的纵向边缘轻轻解剖一束。取出并丢弃任何被镊子或针钉损坏的组织。
作为解剖过程的结果，将成束从解剖溶液转移到一个 3 毫升的小瓶中，该小瓶中装有 2.5 毫升新鲜冷藏解剖溶液，并添加了非离子去污剂。将样品在冰上孵育 30 分钟，偶尔轻轻搅拌，并确保样品束在整个孵育过程中保持浸没状态。然后将样品束转移到装有新鲜解剖溶液的小瓶中，轻轻短暂地搅拌以去除任何残留的去污剂。
冲洗后，将样品束转移到装有冷藏储存溶液的小瓶中，并在 4 摄氏度下孵育过夜。第二天，将小瓶从 4 摄氏度的储存中取出，并将所有药束转移到药杯或解剖皿中。在准备储存时，将束装转移到单独贴标的冻存管中，装满 200 至 400 μL 的新鲜储存溶液，并确保束装液不会粘在试管侧面或漂浮在表面上。
然后盖上试管并将样品储存在零下 80 摄氏度。设置一个实验装置，如此处所示，并在随附的文本协议中注明。然后用松弛溶液填充第一个实验室，用预再激活溶液填充第二个腔室，用激活溶液填充第三个实验室。
调整腔室中的温度，直到它稳定在 15 摄氏度，并将设备置于松弛溶液中。将两个准备好的缝合环拧到从力传感器和长度控制器伸出的不锈钢连接表面上。接下来，将感兴趣的纤维束在冰上解冻约 15 分钟，然后将其转移到装有新鲜冰镇松弛溶液的硅胶弹性体镀培养皿中。
用两端的销钉将捆扎固定到位，并确保使用镊子将其浸没。抓住纤维的一端，然后开始沿其纵轴平滑地提取它。从纤维束中提取纤维时应小心，因为纤维与细胞外基质之间的粘附可能导致过度张力，最终导致拉伸诱导损伤。
提取后，将纤维与少量松弛溶液一起引入改良的移液器吸头中，然后将其转移到装有松弛溶液的实验室中，用镊子轻轻引导。从移液器吸头中取出纤维头并将其固定到长度控制器上。使用第一个缝合环，将纤维的另一端朝向力传感器，并使用相同的程序固定纤维。
使用显微解剖剪刀去除任何多余的缝合线。接下来，将第二个环穿在第一个环上，并将纤维锚定在距离长度控制器连接表面末端 0.2 毫米以内的点。在纤维的力传感器端重复第二个环。
调整长度控制器在 Y 轴方向上的位置，以使纤维平行于实验室的侧壁对齐。然后使用棱镜侧视图测量光纤，并沿 Z 轴方向调整长度控制器的位置，直到光纤平行于腔室的底部。如果纤维以任何方式损坏，则应丢弃纤维并连接新的纤维。
打开激光器并调整载物台的位置，使激光穿过光纤中心。然后，使用长度控制器 X 轴千分尺驱动器增加或减少纤维上的张力来设置肌节长度，直到在目标屏幕上观察到所需的衍射光间距。设定最佳肌节长度后，测量两条最内侧缝合线之间的距离。
放置腔室，使目镜的垂直十字准线对准一个内部缝合线和 0 的最内侧边界。千分尺驱动器上的数字读数沿 x 轴相对于显微镜平移载物台，直到目镜的垂直十字准线与最内层的缝合线对齐。数字显示屏将指示光纤的长度，将光纤保持在测量的长度，并使用安装在显微镜上的摄像头从俯视图和侧视图捕获光纤中心部分的高放大倍率图像。
使用这些图像计算纤维的横截面积。使用腔室控制软件将纤维移动到包含预活化溶液的腔室中，并在那里孵育 3 分钟。当纤维失活溶液时，测量其被动张力，然后将纤维移动到包含活化溶液的腔室中，并允许最大等长力发展，如在快速上升之前的力平台所示。
接下来，使用长度控制器对纤维连接点之间的距离进行大幅、快速和短暂的减少，然后快速返回到原始长度，以确定对应于零的力传感器输出。此处显示的力是椭圆形纤维的俯视图和侧视图。横截面积是通过测量沿纤维长度的五个点的直径，然后计算五个结果面积的平均值来确定的。
来自人类、慢速和快速肌肉纤维的力轨迹表明，使用本视频中所示的技术，快纤维比慢速纤维产生力的速度更高。测量了人类小鼠和大鼠肌肉纤维的典型特征，并在此处介绍。显示的范围表示第 25 到第 75 个四分位数，N 是测试的纤维数量。
请注意不同物种之间比力的巨大差异。此处概述的程序通过添加额外的干预措施、骨骼肌生理学的重要方面（包括长度力、力速度和力等）来评估单个骨骼肌纤维的最大内在力产生能力。钙的关系可以揭示。
概述
本文介绍了一种可靠的技术，用于评估体外通透化骨骼肌纤维的收缩特性。该方法允许在单纤维水平上测量最大等长力的产生，从而提供有关肌肉功能的见解。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 肌肉生理学
- 细胞生物学
背景
- 在细胞水平上了解肌肉功能对各种生物学研究至关重要。
- 化学处理后的肌纤维允许直接测量收缩特性。
- 该技术简化了与整个肌肉结构相关的复杂性。
- 视觉演示增强了对该协议的学习。
研究目的
- 测量单个肌纤维的最大等长力产生能力。
- 提供准备和测试通透化骨骼肌纤维的详细协议。
- 展示通透化纤维技术的有效性。
使用的方法
- 使用化学洗涤剂准备肌纤维样品。
- 从肌肉束中提取单个纤维。
- 使用激光干涉图案设置最佳肌节长度。
- 施用钙以引发最大收缩力。
主要结果
- 该技术成功测量了单个纤维的收缩特性。
- 在评估肌肉功能方面表现出可靠性和有效性。
- 视觉辅助显著提高了对该协议的理解。
结论
- 通透化纤维技术对于研究肌肉收缩性有效。
- 该方法提供了宝贵的见解，而无需处理整个肌肉研究的复杂性。
- 未来的应用可能增强我们对肌肉生理学的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Assessing single-fiber contractility enables mechanistic de-risking of therapeutic targets in neuromuscular and metabolic disease programs. By isolating force generation from whole-tissue confounders, this approach improves target validation confidence and supports early go/no-go decisions in preclinical portfolios. The method provides quantitative, reproducible outputs that bridge basic muscle biology with translational screening efforts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by measuring intrinsic force capacity at the single-cell level.
- Operational Value: Reduces mechanistic ambiguity in target pathways affecting muscle contractility.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying targets with dose-responsive effects on fiber-specific force.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates normalized, quantitative force readouts suitable for compound library screening.
- Operational Value: Standardizes assay conditions via sarcomere length control and calcium activation protocols.
- Scalability: Supports reuse across species and fiber types for cross-model target assessment.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links genetic or pharmacological interventions to functional outcomes in disease-relevant muscle models.
- Operational Value: Provides continuity from discovery through preclinical validation using consistent force metrics.
- Risk Mitigation: Informs advancement decisions by revealing contractile liabilities early in the pipeline.
Pipeline & Workflow Integration
The technique fits within the discovery-to-preclinical continuum, supporting hypothesis testing in early discovery, assay readiness in screening, and mechanistic follow-up in translational research.
- Discovery Biology: Tests target effects on fundamental contractile mechanisms independent of tissue architecture.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative force measurements for hit validation and lead optimization.
- Analytics: Outputs normalized force and cross-sectional area data enabling inter-condition comparisons.
- Translational Research: Connects molecular changes to functional phenotypes in preclinical muscle models.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized platform for cross-project assessment of muscle-targeting modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by isolating muscle-specific contractility.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized fiber preparation and activation protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by reducing late-stage failures due to unidentified contractile effects.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on dose-response in single-fiber force assays.
Implementation Considerations
- Requires expertise in muscle dissection, fiber isolation, and force transducer operation.
- Dependent on calibrated instrumentation including length controllers, force transducers, and laser interference systems.
- Necessitates cross-team standardization of solution preparation, storage, and activation protocols.
- Adaptation across model systems (e.g., human, rodent) requires validation of species-specific contractile norms.
- Practical limitations include fiber fragility during extraction and variability in permeabilization efficiency.
