透化骨骼肌纤维产生的最大等长收缩力的测定

本实验的总体目标是测量经化学透化处理的骨骼肌样本中单根肌纤维的最大等长收缩力。该目标通过以下步骤实现：首先，用化学去垢剂处理肌纤维膜，从而消除细胞外与细胞内成分之间的屏障；第二步，从一小束肌纤维中分离出单根纤维，并将其连接至实验装置上。

接下来，利用激光干涉图样确定单根肌纤维的最佳肌节长度。最后，加入钙离子以诱发最大等长收缩力。最终，透化单纤维技术可在排除完整肌肉结构复杂性的前提下，对骨骼肌收缩特性进行评估。

该方法的可视化演示非常有用，因为成功实施该方案的关键步骤较难掌握。首先，按照配套文字方案中的描述，准备解剖、储存和测试用溶液。接着，使用镊子从美国药典（USP）10-0单丝尼龙缝合线中制备缝合环。

使用双半结技术，为每根待测纤维制备四个环。结打好后，将其置于显微镜下，并将结的尺寸缩小至直径约 750 微米。以 IPS GTI 标记作为参考指引。

然后修剪掉多余的缝线，仅保留线环以及两侧各约500微米的短尾。将通过开放性活检或针刺活检获取的小块肌肉组织转移至含有冰冷解剖液的培养皿中，并加入更多解剖液，确保组织始终完全浸没。在显微镜下检查样本，并操作使其肌纤维的长轴对准操作者右肩方向。

然后用左手持镊子、右手持显微解剖剪，从样品的四个角将其固定在培养皿上。沿着纤维间的纵向边缘，轻柔地解剖分离出一束组织。将被镊子或图钉损伤的任何组织去除并丢弃。

解剖过程完成后，将组织束从解剖液转移至含有2.5毫升新鲜预冷且添加了非离子型去污剂的解剖液的3毫升小瓶中。将样品置于冰上孵育30分钟，期间偶尔轻柔振荡，并确保组织束在整个孵育过程中始终浸没于液体中。随后将组织束转移至另一含有新鲜解剖液的小瓶中，轻轻且短暂振荡以去除残留的去污剂。

冲洗后，将组织束转移至含有预冷保存液的离心管中，在4°C条件下孵育过夜。次日，从4°C保存环境中取出离心管，将所有组织束转移至药杯或解剖皿中。为保存做准备，将组织束分别转移至预先标记的冻存管中，每管加入200至400 µL新鲜保存液，并确保组织束未贴附在管壁上或漂浮于液面。

然后盖上管盖，将样品储存在负80摄氏度条件下。设置一个实验装置，如本文所示及随附文本方案中所述。随后，向第一个实验腔室中加入松弛液，第二个腔室中加入预激活液，第三个腔室中加入激活液。

将腔室温度调节至稳定在15摄氏度，此时装置应置于松弛液中。将两根已准备好的缝合线环分别穿到力传感器和长度控制器伸出的不锈钢连接面上。接下来，将感兴趣的肌纤维束置于冰上解冻约15分钟，然后将其转移至盛有新鲜、预冷松弛液的硅胶弹性体包被的培养皿中。

用针在束的两端固定，并使用镊子确保其完全浸没。抓住一端的一根纤维，沿其纵轴平稳地将其抽出。从束中提取纤维时需格外小心，因为纤维与细胞外基质之间可能存在粘连，导致过大的张力，最终引起拉伸诱导的损伤。

提取后，将纤维连同少量松弛液一起引入经改造的移液枪头中，并用镊子轻轻引导，转移至含有松弛液的实验腔室。将纤维从移液枪头中取出，并固定到长度控制器上。利用第一个缝合环，将纤维的另一端移向力传感器，并采用相同方法固定纤维。

使用显微解剖剪去除多余的缝合线。接着，将第二个环穿过第一个环，并将纤维固定在长度控制器附着面末端0.2毫米范围内的位置。然后在纤维连接力传感器的一端重复此步骤。

调整长度控制器在 Y 轴方向上的位置，使纤维与实验腔体的侧壁平行。然后通过棱镜侧视观察纤维，并调整长度控制器在 Z 轴方向上的位置，直至纤维与腔体底部平行。如果纤维有任何损坏，应丢弃该纤维并安装一根新的纤维。

打开激光器，并调整载物台的位置，使激光穿过纤维的中心。然后通过使用长度控制器的X轴微米驱动器增加或减少纤维上的张力，调节肌节长度，直至在目标屏幕上观察到期望的衍射光间距。在设定最佳肌节长度后，测量两个最内侧缝合线之间的距离。

将腔室放置到位，使目镜的垂直十字线对准内侧缝合线最内侧边缘并归零。通过微米驱动器上的数字读数移动载物台沿x轴相对于显微镜的位置，直至目镜的垂直十字线与最内侧的缝合线对齐。数字显示屏将显示纤维的长度，保持纤维处于已测得的长度，并使用显微镜上安装的相机从顶部和侧面视角拍摄纤维中心部位的高倍放大图像。

利用这些图像计算纤维的横截面积。使用腔室控制软件将纤维移至含有预激活溶液的腔室中，并孵育三分钟。当纤维处于失活溶液中时，测量其被动张力，然后将纤维移至含有激活溶液的腔室，使其产生最大等长收缩力，表现为力迅速上升后达到平台期。

接下来，使用长度控制器对纤维固定点之间的距离施加一次大幅度、快速且短暂的缩短，随后迅速恢复至原始长度，以确定与零力相对应的力传感器输出。此处显示的力来自该椭圆形纤维的顶部和侧面视图。通过沿纤维长度方向上五个位置测量直径，计算出五个相应截面面积的平均值，从而确定其横截面积。

来自人类、慢肌和快肌纤维的力迹表明，利用本视频所示技术，快肌纤维产生力量的速率高于慢肌纤维。本文展示并测量了人类、小鼠和大鼠肌肉纤维的典型特征。图中所示范围表示第25至第75百分位数，N为测试的纤维数量。

注意不同物种之间比力的显著差异。通过增加其他干预措施，本文所述方案可用于评估单个骨骼肌纤维的最大内在产力能力，这些干预措施涉及骨骼肌生理学的重要方面，包括但不限于长度-张力、张力-速度以及钙-张力关系。