Name: 皮层下的多功能小鼠模型白质行程轴索变性和白质神经生物学的研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: 了解如何使用立体定位注射L-Nio在小鼠白质中建立局灶性卒中模型，并通过免疫荧光标记评估轴突损伤、小胶质细胞反应及星形胶质细胞形态变化，以研究卒中后的细胞机制。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

SN 和 MDD 获得了美国国立卫生研究院（NIH）K08 NS083740 基金以及加州大学洛杉矶分校神经病学系的支持。AJG 感谢 Dr. Miriam 和 Sheldon G. Adelson 医学研究基金会以及 Larry L. Hillblom 基金会的支持。KLN 感谢美国心脏协会 14BFSC17760005 ASA-Bugher 卒中中心项目的支持。ILL、EGS 和 STC 获得了美国国立卫生研究院（NIH）R01 NS071481 基金的支持。JDH 感谢美国国立卫生研究院（NIH）K08 NS083740 基金的支持。

本方案中动物的使用已按照加州大学洛杉矶分校动物护理和使用委员会批准的程序进行。
注意：首先确定目标小鼠种群。在以往的研究中，仅使用了雄性野生型 C57/Bl6 小鼠，但也可使用各种转基因或基因敲除小鼠。请注意，立体定位坐标是基于 C57/Bl6 的解剖结构。建议每位使用者最初验证脑卒中定位是否准确到达白质区域。
1. 白质脑卒中诱导——内侧斜角入路
<ol>
	<li>首先使用0.5 mm毛细管制备拉制玻璃移液管，使其远端直径在15–25 µm之间 11.</li>
	<li>在无菌0.9%生理盐水中配制L-Nio（N(5)-(1)-iminoethyl-L-ornithine HCl）溶液，浓度为27.4 mg/ml（130 µM），分装为10 µl无菌 aliquot。</li>
	<li>用连接至真空管线的管路将拉制好的玻璃移液管末端浸入 L-Nio 溶液中，吸取少量 L-Nio（2–5 µl）。将移液管平放在实验台面上完成预填充。
	<ol>
		<li>抽真空，直至移液管0.5 mm部分至少有2 mm被填充。关闭真空，取出移液管，放置一旁待用，直至步骤1.12。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将小鼠放入诱导室，使用异氟烷蒸发器以标准的32%异氟烷（5 L/min异氟烷与5 L/min氧气混合吸入，另加0.5 L/min氮气）诱导小鼠麻醉2）1 分钟，或直至深度麻醉。将小鼠转移至配备立体定位显微镜的立体定位仪。通过蒸发器提供维持麻醉，使用 32% 异氟烷（以 2 L/min 吸入，氧气流量为 5 L/min，氮气流量为 0.5 L/min）2）和一个鼻罩。通过夹捏脚趾检查麻醉深度。&#160;</li>
	<li>将注射臂调整至36°。</li>
	<li>将拉制的玻璃微量移液管固定器连接至低容量压力注射系统的远端，并将其安装到立体定位装置的注射臂上。</li>
	<li>用凡士林涂抹麻醉动物的胡须，并在双眼上涂抹人工泪膏。通过在动物头部覆盖无菌手术巾，留出5-10 cm的无菌手术区域，以准备无菌手术场地。&#160;头部上方3厘米切口。&#160;通过剃除颅骨上方的毛发准备无菌手术区域。使用聚维酮碘和70%酒精棉片交替擦拭清洁头皮。</li>
	<li>用无菌精细剪刀在颅顶正中做一条1.5 cm的切口，暴露颅骨表面。用无菌棉签擦干颅骨，并在体视显微镜1–3倍放大下，使用无菌微尖工具清除覆盖的骨膜组织。</li>
	<li>使用细头标记笔标记前囟作为参考点。</li>
	<li>使用无菌精细 stip 外科钻头钻出一个 2 mm 椭圆形颅骨开窗&#160;从人字缝后方开始，沿中线左侧向前延伸。清除骨碎片及覆盖的软组织，以暴露大脑皮层。</li>
	<li>通过间歇性滴加无菌生理盐水，保持手术区域和皮层表面湿润。</li>
	<li>将拉制的玻璃移液管固定在立体定位仪的注射臂上。将移液管末端与前囟对齐，并将立体定位坐标归零。</li>
	<li>将移液管推进至提供的第一组前后（A/P）和内外（M/L）坐标位置 表1.</li>
	<li>将移液管推进至皮层表面，并将背腹（D/V）测量值归零。</li>
	<li>缓慢将移液管插入脑内，直至到达第一个背腹向（D/V）坐标位置 表1.</li>
	<li>使用低体积压力注射系统，设定为20 psi、20毫秒脉冲，向脑内注射100 nl L-Nio，随后等待5分钟，以防止液体沿移液管路径回流。
	<ol>
		<li>使用体视显微镜目镜中已校准的测微尺，并将放大倍数设为3倍。</li>
		<li>相应地，总共位移 0.100 mm3 （从拉制的玻璃移液管中取出每组坐标对应的0.5 mm长度，直径为0.5 mm，相当于100 nl）。使用目镜测微尺进行测量并标准化，因为每套装置会因使用的放大倍数和标尺不同而有所差异。</li>
		<li>为在每次注射过程中准确测量体积，应从侧面通过显微镜观察倾斜的移液管，使气-液弯月面呈矢状面视图。弯月面应与移液管内壁和外壁处于相同的焦平面。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>缓慢抽出移液器，并在提供的第二组和第三组坐标处重复步骤 1.13–1.16.3。 表1.</li>
	<li>末次注射后，移除移液管，并放置足量骨蜡以填满颅骨开孔部位。拉拢头皮切口边缘，并用皮肤黏合剂固定。</li>
	<li>使用无菌30 G针头将0.1 ml 0.5%布比卡因注入伤口边缘，以预防&#160;以预防与头皮切口相关的局部疼痛。</li>
	<li>将动物放回饲养环境，并给予术后抗生素（0.48 mg/ml 甲氧苄啶-磺胺甲噁唑，或&#160;0.5 mg/ml&#160;左氧氟沙星）溶于饮水中连续给予5天。</li>
</ol>
2. 白质脑卒中诱导——后方倾斜入路
<ol>
	<li>按照内侧倾斜入路方案中的步骤1.1-1.12进行操作，但需将立体定位装置的注射臂调整为从前向后倾斜45度。</li>
	<li>将移液管推进至表2中提供的第一个前后（A/P）和内侧/外侧（M/L）坐标位置。</li>
	<li>按照外侧倾斜入路方案完成剩余的步骤1.14-1.20。</li>
</ol>
3. 逆行性神经元标记
<ol>
	<li>在0.9%生理盐水中制备浓度为54.8 mg/ml的L-Nio无菌10 µl分装液。</li>
	<li>在0.9%生理盐水中制备20% Fluororuby（或20%生物素化葡聚糖胺，或2% Fluorogold）的无菌分装液。</li>
	<li>将上述两种溶液等体积混合，得到终浓度为27.4 mg/ml的L-Nio和10% Fluororuby的混合液。</li>
	<li>按照前述步骤1.3–1.23执行脑卒中实验方案。</li>
	<li>通过灌注固定、冷冻切片及显微镜观察，对组织切片中天然荧光示踪剂进行可视化检测，方法如先前所述8。</li>
</ol>
4. 免疫荧光组织处理
<ol>
	<li>在卒中后适当的时间间隔（从卒中后3小时至14天），通过异氟烷过量或当地IACUC批准的程序处死小鼠。</li>
	<li>使用斜角剪刀打开胸腔，并将23 G蝶形针插入左心室。</li>
	<li>使用精细剪刀在右心房做一小切口，以提供灌注液的流出通道。</li>
	<li>以10 ml/min的流速在室温下经心脏灌注30–40 ml冷磷酸盐缓冲盐水，随后灌注30–40 ml冷的4%多聚甲醛。</li>
	<li>将小鼠断头，使用无菌剪刀从后方剪开颅骨，再用解剖刀轻轻移除覆盖的颅骨，取出脑组织并置于冷的4%多聚甲醛中固定24小时，然后转移至含30%蔗糖的PBS溶液中48小时。</li>
	<li>使用冷冻切片机制备40微米厚的游离切片，并按照先前描述的方法进行抗体处理6-8。本研究中使用以下抗体：兔抗神经丝蛋白200（1:500稀释）；兔抗波形蛋白（1:500）；山羊抗GFAP（1:500）；兔抗Iba-1（1:1,000）。</li>
</ol>
5. 蛋白质或RNA分析的组织处理
<ol>
	<li>在卒中后3小时至14天之间的适当时间点，通过异氟烷过量或当地IACUC批准的程序实施安乐死。</li>
	<li>断头取鼠脑，使用无菌剪刀从颅骨后部剪开颅腔，然后用解剖刀片轻轻移除覆盖的颅骨。</li>
	<li>将无菌的4 mm解剖刀片插入脑前部，切断嗅球和视神经。轻柔地将脑组织从颅腔中取出，并置于冰冻的解剖缓冲液中（1×Hank's平衡盐溶液，25 mM HEPES-KOH，pH 7.4，35 mM葡萄糖，4 mM碳酸氢钠，以及0.01 mg/ml环己酰亚胺）。</li>
	<li>使用脑组织切块模具和新的无菌剃须刀片，制备包含卒中区域的2–3 mm厚脑片，并将其放入冷的解剖缓冲液中。</li>
	<li>在解剖显微镜下，识别注射侧半球运动皮层下方的白质区域。在较晚的卒中后时间点，该区域可通过局灶性坏死和髓鞘苍白进行肉眼识别。 
	注意：在较早的卒中后时间点，可通过注射与1 µl 10%快绿混合的L-Nio来实现卒中区域的可视化识别（图4A）。</li>
	<li>在解剖显微镜引导下，使用新的手术刀片仔细分离含有卒中病变的白质区域，该区域可通过快绿标记或组织缺失来识别。根据需要去除上方的皮层和下方的纹状体。</li>
</ol>

<ol><li>Go, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+disease+and+stroke+statistics--2014+update%3A+a+report+from+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the American Heart Association.</a> Circulation. 129, 28-292 (2014).</li>
<li>Saini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silent+stroke%3A+not+listened+to+rather+than+silent%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Silent stroke: not listened to rather than silent.</a> Stroke. 43, 3102-3104 (2012).</li>
<li>Koton, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burden+and+outcome+of+prevalent+ischemic+brain+disease+in+a+national+acute+stroke+registry%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Burden and outcome of prevalent ischemic brain disease in a national acute stroke registry.</a> Stroke. 44, 3293-3297 (2013).</li>
<li>Jiwa, N. S., Garrard, P., Hainsworth, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+models+of+vascular+dementia+and+vascular+cognitive+impairment%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Experimental models of vascular dementia and vascular cognitive impairment: a systematic review.</a> J Neurochem. 115, 814-828 (2010).</li>
<li>Sozmen, E. G., Hinman, J. D., Carmichael, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+that+matter%3A+white+matter+stroke+models%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Models that matter: white matter stroke models.</a> Neurotherapeutics. 9, 349-358 (2012).</li>
<li>Sozmen, E. G., Kolekar, A., Havton, L. A., Carmichael, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+white+matter+stroke+model+in+the+mouse%3A+axonal+damage%2C+progenitor+responses+and+MRI+correlates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A white matter stroke model in the mouse: axonal damage, progenitor responses and MRI correlates.</a> J Neurosci Methods. 180, 261-272 (2009).</li>
<li>Rosenzweig, S., Carmichael, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+exacerbation+of+white+matter+stroke+outcomes%3A+a+role+for+oxidative+damage+and+inflammatory+mediators%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Age-dependent exacerbation of white matter stroke outcomes: a role for oxidative damage and inflammatory mediators.</a> Stroke. 44, 2579-2586 (2013).</li>
<li>Hinman, J. D., Rasband, M. N., Carmichael, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+of+the+axon+initial+segment+after+focal+cortical+and+white+matter+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Remodeling of the axon initial segment after focal cortical and white matter stroke.</a> Stroke. 44, 182-189 (2013).</li>
<li>McCall, T. B., Feelisch, M., Palmer, R. M., Moncada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+N-iminoethyl-L-ornithine+as+an+irreversible+inhibitor+of+nitric+oxide+synthase+in+phagocytic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brit+j+pharmacol%22%5BJournal%5D)">Identification of N-iminoethyl-L-ornithine as an irreversible inhibitor of nitric oxide synthase in phagocytic cells.</a> Brit j pharmacol. 102, 234-238 (1991).</li>
<li>Gadea, A., Aguirre, A., Haydar, T. F., Gallo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelin-1+regulates+oligodendrocyte+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Endothelin-1 regulates oligodendrocyte development.</a> J Neurosci. 29, 10047-10062 (2009).</li>
<li>Dean, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+%28pulling%29+of+needles+for+gene+delivery+by+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+prot%22%5BJournal%5D)">Preparation (pulling) of needles for gene delivery by microinjection.</a> CSH prot. , (2006).</li>
<li>Hughes, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+lesions+in+the+rat+central+nervous+system+induced+by+endothelin-1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuropathol.+Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Focal lesions in the rat central nervous system induced by endothelin-1.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 62, 1276-1286 (2003).</li>
<li>Whitehead, S. N., Hachinski, V. C., Cechetto, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+a+rat+model+of+cerebral+ischemia+and+beta-amyloid+toxicity%3A+inflammatory+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Interaction between a rat model of cerebral ischemia and beta-amyloid toxicity: inflammatory responses.</a> Stroke. 36, 107-112 (2005).</li>
<li>Frost, S. B., Barbay, S., Mumert, M. L., Stowe, A. M., Nudo, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+animal+model+of+capsular+infarct%3A+endothelin-1+injections+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">An animal model of capsular infarct: endothelin-1 injections in the rat.</a> Behav Brain Res. 169, 206-211 (2006).</li>
<li>Horie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+of+focal+cerebral+ischemia+using+endothelin-1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Mouse model of focal cerebral ischemia using endothelin-1.</a> J Neurosci Methods. 173, 286-290 (2008).</li>
<li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cognitive+deficits+and+delayed+neuronal+loss+in+a+mouse+model+of+multiple+microinfarcts%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cognitive deficits and delayed neuronal loss in a mouse model of multiple microinfarcts.</a> Neuroscience. 32, 17948-17960 (2012).</li>
<li>Shih, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+smallest+stroke%3A+occlusion+of+one+penetrating+vessel+leads+to+infarction+and+a+cognitive+deficit%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The smallest stroke: occlusion of one penetrating vessel leads to infarction and a cognitive deficit.</a> Nat Neurosci. 16, 55-63 (2013).</li>
<li>Jung, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+endothelin+receptor+A+during+myelination+of+developing+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Korean+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">The role of endothelin receptor A during myelination of developing oligodendrocytes.</a> J Korean Med Sci. 26, 92-99 (2011).</li>
</ol>

已有多种既往的皮层下卒中模型被报道，包括在大鼠12-14和小鼠6,15的内囊、皮层下白质和纹状体中进行内皮素-1的局部注射。近期的一些小范围局灶性卒中模型则采用颈动脉内注射胆固醇微栓塞16，或单根穿支小动脉的光化学血栓闭塞17。这些模型各自具有优缺点5。本文所描述的模型所产生的病灶具备多种类似人类腔隙性梗死的特征，包括轴突异常与丢失、髓鞘降解、局灶性坏死核心，以及轻微的临床功能缺损，且其恢复速度相对较快，与年龄相关7。针对小鼠白质建立卒中模型，可支持多种遗传学操作，有助于开展机制性研究。
该实验方案的关键步骤包括使用精确的立体定位坐标。由于小鼠的白质体积较小，且不同品系之间存在差异，因此可能需要根据所使用小鼠的年龄和品系对立体定位坐标进行调整。控制注射体积也至关重要，因为这与梗死灶的大小直接相关。较大的注射体积将导致更大的脑卒中病灶，可能累及上方的皮层和下方的纹状体。
已有文献报道采用本文所述方法...

影响皮层下白质的卒中是一种常见的临床病症，每年在美国占临床卒中病例的近25%1。白质的缺血性损伤也以更高的频率无症状发生，并促进血管性痴呆的发展2,3。目前，此类脑缺血患者几乎没有任何有效的治疗选择。尽管该疾病具有重要的临床意义，但目前仍缺乏与临床情况相关的动物模型4,5。
本实验方案的目标是在小鼠的白质中制造一个局灶性缺血性损伤。这种模拟人类疾病的小鼠模型可用于专门研究轴突在中风后的损伤反应，以及白质中的细胞成分（即少突胶质细胞、星形胶质细胞和轴突）对中风的响应及修复过程。
既往研究已描述了一种使用内皮素-1（ET-1）6建立皮层下白质脑卒中模型的方法，该方法与本文所述模型相似。通过对实验方案进行若干关键性改进，此模型的潜在应用范围得以拓展7,8。本方案提供了一种可靠且可调节的策略，用于在小鼠脑白质中诱导局灶性脑卒中。
该模型的主要优势在于使用了一种化学性内皮型一氧化氮合酶（eNOS）抑制剂——N(5)-(1)-亚氨基乙基-L-鸟氨酸盐酸盐（L-Nio）9，其对白质中细胞成分无已知的旁分泌作用，而使用内皮素-1的模型曾存在此类并发症10。此外，通过立体定位技术靶向小鼠白质，可利用各种转基因或基因敲除品系，极大地扩展了研究中风对脑白质影响的可用工具。本文描述了该技术的两种变体，并展示了可用于增强对中风后轴突及白质损伤与修复机制理解的其他可选方法。

<table><tbody><tr><td>L-N5-(1-亚氨基乙基)鸟氨酸二盐酸盐</td><td>Calbiochem</td><td>400600-20MG</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Phoenix Pharmaceutical, Inc.</td><td>NDC 57319-559-06</td><td></td></tr><tr><td>毛细管</td><td>World Precision Instruments</td><td>50-821-807</td><td></td></tr><tr><td>微量喷射仪</td><td>Parker Instrumentation</td><td>Picospritzer II</td><td></td></tr><tr><td>立体定位装置</td><td>Kent Scientific</td><td>KSC51725</td><td></td></tr><tr><td>拉针仪</td><td>KOPF</td><td>Model 720</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜 SZ51</td><td>Olympus</td><td>88-124</td><td></td></tr><tr><td>精细剪刀</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PY2 72-8547</td><td></td></tr><tr><td>弯头镊子</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PY2 72-8598</td><td></td></tr><tr><td>钝性解剖工具</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>10066-15</td><td></td></tr><tr><td>钻孔机</td><td>Dremel</td><td>8220-1/28</td><td></td></tr><tr><td>钻头</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>19007-05</td><td></td></tr><tr><td>Vetbond</td><td>3M</td><td>1469SB&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>甲哌卡因</td><td>HOSPIRA</td><td>NDC 0409-1610-50</td><td></td></tr><tr><td>复方新诺明</td><td>STI Pharmacy</td><td>NDC 54879-007-16</td><td></td></tr><tr><td>氟金红</td><td>Fluorochrome Inc</td><td>30 mg</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Fisher</td><td>O4042-500</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Fisher</td><td>BP220-10</td><td></td></tr><tr><td>冷冻切片机</td><td>Leica CM3050 S</td><td>14047033518</td><td></td></tr><tr><td>载玻片</td><td>Fisher</td><td>12-544-7</td><td></td></tr><tr><td>快绿&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F7252-5G</td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>Nikon</td><td>SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td>23 G 蝶形针</td><td>Fisher</td><td>14-840-35</td><td></td></tr><tr><td>10x Hank's 平衡盐溶液</td><td>Life Technologies</td><td>14065056</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES-KOH，pH 7.4</td><td>Affymetrix</td><td>16924</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>放线菌酮</td><td>Sigma</td><td>01810</td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于研究轴突变性及白质神经生物学的多功能小鼠皮层下白质卒中模型

A Versatile Murine Model of Subcortical White Matter Stroke for the Study of Axonal Degeneration and White Matter Neurobiology

影响白质的卒中占临床卒中表现的25%，其无症状发生率可能高出5至10倍，并对血管性痴呆的发展具有显著贡献。目前存在的局灶性白质卒中模型较少，缺乏合适的模型严重阻碍了对这类卒中后损伤反应及修复过程中涉及的神经生物学机制的理解。其他皮层下卒中模型的主要局限在于无法将梗死灶严格限制在白质区域内，或主要在非小鼠物种中得到验证。这限制了利用丰富的小鼠研究工具来探索白质卒中神经生物学的能力。本文介绍了一种通过局部注射不可逆eNOS抑制剂，可靠地在小鼠白质中诱导局灶性卒中的方法。我们还提供了该通用方案的多种变体，包括两种独特的立体定位变异方法、逆行神经元示踪，以及新鲜组织标记与分离技术，这些显著拓展了该技术的潜在应用范围。这些变体使得研究人员能够从多个角度分析这种常见但研究不足的卒中形式所引起的神经生物学效应。

利用所展示的模型，可可靠地靶向前肢感觉运动皮层下方的白质。该化学诱导性卒中模型可产生局灶性轴突和髓鞘丢失、星形胶质细胞增生以及小胶质细胞活化（图1），这些特征与人类腔隙性脑梗死中典型表现一致。通过三次注射，可建立具有临床实用价值的模型，表现为前肢运动任务的早期功能障碍7，且仅有小部分脑组织发生缺血，但该模型适用于免疫组织化学、免疫荧光及生物化学技术，并可在定量水平上实现可行性和可重复性。在卒中诱导后的早期时间点（小时级），即可检测到轴突分子结构的改变（图2）。至第7天，卒中病灶完全成熟，形成一个界限明确的轴突丢失区域（图1a）。在我们的操作中，该方法产生的局灶性白质损伤水平直径约为800 µm，沿胼胝体前后轴延伸约1 mm。至第7天，平均总梗死体积约为0.200 mm3，呈椭圆形。我们观察到，由于切片位置在椭圆内的不同，动物间及切片间的梗死体积变异率约为10%。超过7天后，梗死范围进一步扩大的情况很少见。
<p clas...

本文介绍了一种通过局部注射不可逆的内皮型一氧化氮合酶（eNOS）抑制剂（L-Nio）在小鼠白质中诱导局灶性脑卒中的方法。文中展示了两种立体定位手术变体、逆行神经元示踪、新鲜组织标记与分离技术，拓展了该技术的潜在应用范围。

影响白质的脑卒中占临床脑卒中表现的高达25%，其无症状发生率可能高出5至10倍，且……

本实验的总体目标是准确定位小鼠白质内的小梗死灶，以模拟这种常见的皮质下白质梗死类型。该方法有助于解答脑卒中研究领域中的一些关键问题，例如轴突损伤机制、神经元对皮质下脑卒中的反应，以及白质中各类细胞成分在脑卒中急性期和修复期的反应。该技术的主要优势在于能够精确地将脑卒中定位至白质区域，并且可与多种小鼠模型联合使用。通常，初次使用该方法的研究人员会遇到困难，因为白质体积较小，容易导致脑卒中定位错误。可能需要针对每种小鼠品系或立体定位装置对注射角度或立体定位坐标进行微调。首先，将拉制的玻璃移液管固定到连接真空管线的管路上。将拉制好的一端插入 L-Nio 溶液中，或含有荧光示踪剂的 L-Nio 溶液中。启动真空装置，施加负压，直至移液管直径为 0.5 毫米的部分至少有 2 毫米长度被液体填充。将已填充的移液管暂置一旁。然后将小鼠放入配备立体定位显微镜的立体定位仪中。根据批准的实验操作规程对小鼠进行麻醉和术前准备后，通过夹捏脚趾检查麻醉深度，小鼠应无反应。接下来，将注射臂调整至36度。将拉制的玻璃微量移液管固定器连接到低容量压力注射系统的远端，并将其安装至注射臂上。作1.5厘米长的正中头皮切口以暴露颅骨，然后用棉签将颅骨表面擦干。随后，在立体定位显微镜下以1至3倍放大倍数观察，使用微点工具去除覆盖在骨表面的任何骨膜组织。用细头标记笔标记前囟点。然后使用配备精细钻头的外科钻，在前囟点后方开始，沿中线左侧向前延伸，钻出一个直径约2毫米的椭圆形颅骨开窗。去除骨碎片和覆盖的软组织，以便观察大脑皮层。通过间歇性滴加无菌生理盐水保持皮层表面湿润。接着，将装有液体的移液管固定到注射器臂上。将移液管的远端与前囟对齐，并将立体定位坐标归零。根据表一中列出的前部、后部以及内侧-外侧坐标，将移液管推进至第一个注射位点。然后，将移液管推进至皮层表面，并将背侧-腹侧测量值归零。缓慢将移液管降至背腹向坐标。确保体视显微镜的放大倍数设置为3倍，并能清晰观察到校准的目镜刻度。从侧面观察倾斜的移液管，使气液弯月面呈矢状面视角。液面应同时出现在移液管内壁和外壁的同一焦平面上。现在，使用局部压力注射系统，以20 PSI进行20毫秒的脉冲注射，向脑内注入100纳升的L-Nio。注射完总体积后，等待五分钟，以防止液体沿移液管轨迹反流。然后，撤出移液管，并根据表一提供的第二和第三组坐标重复注射操作。最后一次注射完成后，移除移液管，并用足量骨蜡填充颅骨开孔部位。最后，对合头皮切口边缘，使用皮肤粘合剂固定。给予术后镇痛处理后，将动物放入清洁的笼子中。在饮水中提供术后抗生素，持续五天，或直至实施安乐死（若时间少于五天，则以安乐死时间为准）。按照批准的操作程序对小鼠实施安乐死后，使用无菌剪刀从颅骨后部切开，然后用解剖铲轻轻移除上方的颅骨。接着，将一个无菌的4毫米刮铲插入脑组织前部，以切断嗅球和视神经。然后，轻柔地将脑组织从颅骨中取出，并置于冰上预冷的分离缓冲液中。使用脑组织切块装置和无菌刀片，切取包含病变区域的2至3毫米厚的脑片，并将其放入冷的分离缓冲液中。在解剖显微镜下，辨认注射侧半球运动皮层下方的白质。在卒中后较早期的时间点，注射含有常见实验室染料（如亮绿）的 L-Nio 可有助于肉眼识别卒中区域。在卒中后较晚期的时间点，该区域可通过局灶性坏死和髓鞘苍白进行肉眼辨认。确定后，使用手术刀小心地解剖包含脑卒中病灶的白质区域。根据需要去除上方的皮层和下方的纹状体。如图所示，采用内侧入路方法，在脑卒中发生七天后，通过红色显示的神经丝免疫荧光标记，可显示轴突丢失的程度。采用后方斜向入路，可靶向侧脑室上方的白质脑卒中病灶，通过IBA-1免疫标记检测到小胶质细胞显著活化。两种星形胶质细胞中间丝标记物——红色显示的波形蛋白（vimentin）和绿色显示的胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein）揭示了脑卒中后白质星形胶质细胞的形态学改变。在诱导脑卒中的同时共注射荧光标记的葡聚糖胺，可识别出轴突因脑卒中而受损的单个神经元。大部分标记出现在覆盖卒中区域的初级感觉运动皮层第五层和第六层神经元的轴突中。该图像代表卒中后第七天的情况。一旦掌握，若操作得当，该技术可在45分钟内完成。观看本视频后，您应能充分掌握如何在小鼠中建立局灶性白质脑卒中模型，并为多种后续脑组织处理步骤做好准备，从而有助于回答脑卒中及神经修复领域的重要科学问题。

a-versatile-murine-model-subcortical-white-matter-stroke-for-study

Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

皮层下的多功能小鼠模型白质行程轴索变性和白质神经生物学的研究

本视频展示了通过向麻醉小鼠脑白质内特定脑区坐标注射一氧化氮抑制剂，以精确诱导白质脑卒中的技术。该方法可导致血管收缩并阻断血液供应，从而引起神经元损伤和脑卒中。...

使用一氧化氮抑制剂在小鼠模型中诱导白质脑卒中

多种小鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）模型广泛应用于实验性脑科学研究。本文展示了经颅永久性远端MCAO模型，该模型可产生稳定的皮质梗死，其大小与大多数人类缺血性卒中所造成的损伤相当。...

小鼠卒中模型：远端大脑中动脉永久性凝闭

本文描述了一种囊状梗死的建模技术。我们在此采用了一种改良的光化学血栓法，在术前靶向定位后使用低强度光照。利用该技术，我们建立了具有持续性运动功能障碍的局限性囊状梗死模型。...

使用光化学血栓技术建立局限性囊膜梗死模型

本文介绍了一种在新生小鼠中建立可重复性脊髓压迫损伤（SCI）的方法。该模型为研究自发性功能恢复背后的适应性可塑性机制提供了一个有利的平台。...

一种新生小鼠脊髓压迫性损伤模型

远端大脑中动脉分支的手术阻塞（MCAo）是实验性卒中研究中常用的一种模型。本文描述了永久性MCAo的基本技术，并结合了侧颅窗的植入，从而为小鼠的长期活体显微成像提供了可能。...

侧向慢性颅窗制备可实现小鼠远端大脑中动脉闭塞后体内观察

本文介绍光化学血栓性脑卒中模型，该模型通过在给予光敏染料后利用激光照射，经完整颅骨诱导永久性微血管闭塞，从而产生脑卒中。...

小鼠卒中模型构建：光栓法诱导局灶性皮层损伤

本方案展示了一种具有中等大小梗死灶且存活率极佳的独特小鼠卒中模型。该模型可使临床前卒中研究者延长缺血时间、使用老龄小鼠，并评估长期功能学结果。...

一种改良的经颅大脑中动脉阻塞模型用于研究老年小鼠的中风结局

本方案描述了在皮层缺血性脑卒中后通过病毒介导的方式异位表达 Neurod1 的方法。Neurod1 的递送分为两种情况：（1）在脑卒中后亚急性期（7 天）利用 Cre-Flex AAV 系统在野生型小鼠中进行；（2）在脑卒中后慢性期（21 天）利用单个 AAV...

用于研究缺血性脑卒中亚急性期和慢性期转导细胞中 Neurod1 异位表达的 AAV 系统与小鼠模型

提出采用针法建立小鼠双侧颈总动脉不对称性狭窄模型，用于构建血管性认知障碍与痴呆的动物模型。该模型相较于既往已建立的模型可产生更长期的病理结果，且适用于活体磁共振成像。通过可视化操作演示为手术技术的掌握提供指导。...

基于针导不对称双侧颈总动脉狭窄的小鼠血管性认知障碍与痴呆模型

已提出移植分离的胰岛可能成为治疗1型糖尿病的一种潜在方法。本文介绍一种从小鼠胰腺中分离胰岛并将其移植至肾包膜下空间的方法。...

小鼠胰岛分离与肾包膜下移植方法

了解如何使用立体定位注射L-Nio在小鼠白质中建立局灶性卒中模型，并通过免疫荧光标记评估轴突损伤、小胶质细胞反应及星形胶质细胞形态变化，以研究卒中后的细胞机制。

一种用于研究轴突变性及白质神经生物学的多功能小鼠皮层下白质卒中模型

探索更多视频