一种用于研究轴突变性及白质神经生物学的多功能小鼠皮层下白质卒中模型

本实验的总体目标是准确定位小鼠白质内的小梗死灶，以模拟这种常见的皮质下白质梗死类型。该方法有助于解答脑卒中研究领域中的一些关键问题，例如轴突损伤机制、神经元对皮质下脑卒中的反应，以及白质中各类细胞成分在脑卒中急性期和修复期的反应。该技术的主要优势在于能够精确地将脑卒中定位至白质区域，并且可与多种小鼠模型联合使用。

通常，初次使用该方法的研究人员会遇到困难，因为白质体积较小，容易导致脑卒中定位错误。可能需要针对每种小鼠品系或立体定位装置对注射角度或立体定位坐标进行微调。首先，将拉制的玻璃移液管固定到连接真空管线的管路上。

将拉制好的一端插入 L-Nio 溶液中，或含有荧光示踪剂的 L-Nio 溶液中。启动真空装置，施加负压，直至移液管直径为 0.5 毫米的部分至少有 2 毫米长度被液体填充。将已填充的移液管暂置一旁。

然后将小鼠放入配备立体定位显微镜的立体定位仪中。根据批准的实验操作规程对小鼠进行麻醉和术前准备后，通过夹捏脚趾检查麻醉深度，小鼠应无反应。

接下来，将注射臂调整至36度。将拉制的玻璃微量移液管固定器连接到低容量压力注射系统的远端，并将其安装至注射臂上。作1.5厘米长的正中头皮切口以暴露颅骨，然后用棉签将颅骨表面擦干。

随后，在立体定位显微镜下以1至3倍放大倍数观察，使用微点工具去除覆盖在骨表面的任何骨膜组织。用细头标记笔标记前囟点。然后使用配备精细钻头的外科钻，在前囟点后方开始，沿中线左侧向前延伸，钻出一个直径约2毫米的椭圆形颅骨开窗。

去除骨碎片和覆盖的软组织，以便观察大脑皮层。通过间歇性滴加无菌生理盐水保持皮层表面湿润。接着，将装有液体的移液管固定到注射器臂上。

将移液管的远端与前囟对齐，并将立体定位坐标归零。根据表一中列出的前部、后部以及内侧-外侧坐标，将移液管推进至第一个注射位点。然后，将移液管推进至皮层表面，并将背侧-腹侧测量值归零。

缓慢将移液管降至背腹向坐标。确保体视显微镜的放大倍数设置为3倍，并能清晰观察到校准的目镜刻度。从侧面观察倾斜的移液管，使气液弯月面呈矢状面视角。

液面应同时出现在移液管内壁和外壁的同一焦平面上。现在，使用局部压力注射系统，以20 PSI进行20毫秒的脉冲注射，向脑内注入100纳升的L-Nio。注射完总体积后，等待五分钟，以防止液体沿移液管轨迹反流。

然后，撤出移液管，并根据表一提供的第二和第三组坐标重复注射操作。最后一次注射完成后，移除移液管，并用足量骨蜡填充颅骨开孔部位。最后，对合头皮切口边缘，使用皮肤粘合剂固定。

给予术后镇痛处理后，将动物放入清洁的笼子中。在饮水中提供术后抗生素，持续五天，或直至实施安乐死（若时间少于五天，则以安乐死时间为准）。按照批准的操作程序对小鼠实施安乐死后，使用无菌剪刀从颅骨后部切开，然后用解剖铲轻轻移除上方的颅骨。

接着，将一个无菌的4毫米刮铲插入脑组织前部，以切断嗅球和视神经。然后，轻柔地将脑组织从颅骨中取出，并置于冰上预冷的分离缓冲液中。使用脑组织切块装置和无菌刀片，切取包含病变区域的2至3毫米厚的脑片，并将其放入冷的分离缓冲液中。

在解剖显微镜下，辨认注射侧半球运动皮层下方的白质。在卒中后较早期的时间点，注射含有常见实验室染料（如亮绿）的 L-Nio 可有助于肉眼识别卒中区域。在卒中后较晚期的时间点，该区域可通过局灶性坏死和髓鞘苍白进行肉眼辨认。

确定后，使用手术刀小心地解剖包含脑卒中病灶的白质区域。根据需要去除上方的皮层和下方的纹状体。如图所示，采用内侧入路方法，在脑卒中发生七天后，通过红色显示的神经丝免疫荧光标记，可显示轴突丢失的程度。

采用后方斜向入路，可靶向侧脑室上方的白质脑卒中病灶，通过IBA-1免疫标记检测到小胶质细胞显著活化。两种星形胶质细胞中间丝标记物——红色显示的波形蛋白（vimentin）和绿色显示的胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein）揭示了脑卒中后白质星形胶质细胞的形态学改变。在诱导脑卒中的同时共注射荧光标记的葡聚糖胺，可识别出轴突因脑卒中而受损的单个神经元。

大部分标记出现在覆盖卒中区域的初级感觉运动皮层第五层和第六层神经元的轴突中。该图像代表卒中后第七天的情况。一旦掌握，若操作得当，该技术可在45分钟内完成。

观看本视频后，您应能充分掌握如何在小鼠中建立局灶性白质脑卒中模型，并为多种后续脑组织处理步骤做好准备，从而有助于回答脑卒中及神经修复领域的重要科学问题。