皮层下的多功能小鼠模型白质行程轴索变性和白质神经生物学的研究
2016年3月17日
在这里，我们提出了通过局部注射不可逆的内皮一氧化氮合酶 （eNOS） 抑制剂 （L-Nio） 在小鼠白质中产生局灶性卒中的方法。介绍了两种立体定向变体，逆行神经元示踪以及新鲜组织标记和解剖，它们扩展了该技术的潜在应用。
该程序的总体目标是准确定位小鼠白质内的小中风，以模拟这种常见形式的皮质下白质中风。这种方法可以帮助回答中风领域的关键问题，例如轴突损伤的机制、神经元对皮质下中风的反应，以及白质细胞成分在中风的急性期和修复期如何反应。该技术的主要优点是它可以用来精确地定位到白质的笔触，并且可以与各种小鼠小鼠模型一起使用。
一般来说，刚接触这种方法的人会很挣扎，因为少量的白质会导致中风的错位。可能需要对每种小鼠的注射角度或立体定向坐标进行细微调整，或进行立体定向设置。首先将拉出的玻璃移液器固定到连接到真空管路的管道上。
将拉出的一端插入 L-Nio 溶液或 L-Nio 加荧光示踪剂中。启动真空，然后进行抽吸，直到填充移液器直径为 0.5 毫米的部分至少两毫米。将装满的移液器放在一侧。
然后将鼠标放入配备立体定向显微镜的立体定向装置中。根据批准的程序麻醉和准备小鼠进行手术后，用脚趾捏检查麻醉深度。应该没有回应。
接下来，将注射臂调整到 36 度。将拉动的玻璃移液器支架固定在低容量压力注射系统的远端，并将其连接到注射臂上。在头皮中线切开 1.5 厘米以露出颅骨后，用棉签擦干表面颅骨。
然后，通过立体定向显微镜观察时，以 1 到 3 倍的放大倍率，使用微点工具去除任何覆盖的骨膜组织。用细尖记号笔标记前囟。然后使用配备有细尖手术钻头的手术钻头钻一个 2 毫米的椭圆形开颅手术，从前囟向后开始，并在中线左侧向前延伸。
去除骨碎片和覆盖的软组织，以便可以看到大脑皮层。通过间歇性滴入无菌盐水来保持皮质表面湿润。接下来，将装满的移液器贴在注射器臂上。
将移液器的远端与前囟对齐，并将立体定向坐标归零。使用表 1 中列出的前、后和内侧坐标将移液器推进到第一个注射点。然后，将移液器推进到皮质表面，并将背腹测量归零。
慢慢将移液器降低到背腹坐标。确保立体定向显微镜放大倍率设置为 3 倍，并且可以清楚地看到校准后的标线。从侧面观察倾斜的移液器，使空气流体弯液面具有矢状视图。
弯月面应出现在移液器内壁和外壁的同一焦平面上。现在，使用设置为 20 PSI 的局部压力注射系统进行 20 毫秒脉冲，将 100 纳升 L-Nio 注射到大脑中。注射总体积后，等待 5 分钟以防止移液器轨道反流。
然后，取出移液器，并在表 1 中提供的第二组和第三组坐标处重复注射程序。最后一次注射后，取出移液管并放置足够的骨蜡以填充开颅手术部位。最后，接近头皮伤口的边缘，并用真皮粘合剂粘合。
进行术后镇痛后，将动物放在干净的笼子里。在饮用水中提供术后抗生素 5 天，如果少于 5 天，则直到处死。按照批准的程序将小鼠处死并斩首后，用无菌剪刀向后打开头骨，然后用刮刀轻轻去除覆盖的头骨。
接下来，在大脑前部插入一把无菌的 4 毫米刮刀，以切断嗅球和视神经。然后，轻轻地将大脑从颅骨中取出并放入冰冷的解剖缓冲液中。使用脑阻滞和无菌剃须刀片，切下包含受影响区域的 2 到 3 毫米切片，并放入冷解剖缓冲液中。
在解剖显微镜下，识别注射半球运动皮层下方的白质。在卒中后较早的间隔期，注射 L-Nio 与常见的实验室染料（如固绿）混合，可以目视识别卒中。在较长的卒中后间隔期，该区域可通过局灶性坏死和髓鞘苍白进行视觉识别。
识别出来后，用手术刀仔细解剖包含中风的白质区域。根据需要去除上覆的皮层和下面的纹状体。如图所示，神经丝的免疫荧光标记（以红色显示）显示了中风后 7 天的轴突丢失程度，使用内侧方法。
使用后斜入路，白质卒中病变靶向侧脑室正上方，并显示出强烈的小胶质细胞反应性，如 IBA-1 免疫标记所检测到的那样。两个星形胶质细胞中间丝标志物，波形蛋白（红色所示）和神经胶质纤维酸性蛋白（绿色所示）揭示了中风后白质星形胶质细胞的形态变化。在中风诱导时共同注射荧光葡聚糖胺可以识别具有中风损伤轴突的单个神经元。
大多数标记发生在中风上方的初级感觉运动皮层的第 5 层和第 6 层神经元内的轴突中。此图像表示中风后 7 天。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在 45 分钟内完成。
看完这个视频，你应该对如何在小鼠中产生局灶性白质中风有很好的了解，并为大脑的各种下游处理做好准备，有助于回答中风和神经修复中的重要问题。
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概述
本文介绍了一种通过局部注射不可逆的eNOS抑制剂（L-Nio）在小鼠白质中产生焦点中风的方法。该技术包括立体定位变体和新鲜组织标记，以增强其在中风研究中的应用。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 中风研究
- 小鼠模型
背景
- 白质中的焦点中风在亚皮质中风模型中很常见。
- 了解轴突损伤和神经元反应在中风研究中至关重要。
- 中风的精确定位可以改善实验结果。
- 不同小鼠品系可能需要调整技术。
研究目的
- 准确模拟小鼠亚皮质白质中风。
- 调查轴突损伤和神经元反应的机制。
- 探索中风急性期和修复期的细胞反应。
所用方法
- 使用立体定位仪器注射L-Nio。
- 小鼠的准备和中风诱导的手术程序。
- 进行脑组织解剖和标记以便分析。
- 使用免疫荧光标记评估轴突丢失和小胶质细胞反应。
主要结果
- 成功定位了小鼠白质中的中风病变。
- 识别了中风后的轴突损伤和小胶质细胞活化。
- 使用荧光示踪剂可视化中风。
- 显示了星形胶质细胞对中风的反应变化。
结论
- 该技术允许精确模拟白质中风。
- 它提供了对中风损伤细胞机制的洞察。
- 未来的应用可能增强对中风恢复过程的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Modeling focal white matter stroke in mice addresses a critical gap in preclinical stroke research, enabling mechanistic de-risking of axonal degeneration pathways. This model supports target validation by providing a disease-relevant system to study neuroinflammatory and repair responses relevant to vascular dementia and silent infarct burden. Precise lesion localization enhances predictive confidence in early discovery by reducing biological variability in downstream assay readouts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to axonal injury mechanisms in white matter pathology.
- Operational Value: Provides a murine-compatible platform for functional target validation using established neurobiological tools.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by modeling silent infarct contributions to vascular dementia progression.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable histological endpoints such as axonal loss and microglial reactivity for assay standardization.
- Operational Value: Facilitates preparation of validated tissue sections for reproducible immunofluorescence and tracer-based analyses.
- Scientific Value: Enables screening readiness through focal lesion induction compatible with retrograde neuronal tracing and fresh tissue labeling.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with disease-relevant systems by modeling subcortical white matter stroke contributing to vascular dementia.
- Operational Value: Ensures continuity from discovery through preclinical validation via standardized stereotactic delivery and tissue processing.
- Scientific Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by linking lesion location to cellular response profiles in acute and repair phases.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis testing of white matter-specific stroke mechanisms prior to lead identification efforts.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification through targeted lesion induction in murine white matter tracts.
- Screening: Delivers assay-ready tissue with quantifiable outputs such as IBA-1+ microglial activation and axonal filament loss.
- Analytics: Provides measurable dependent variables including fluorescence intensity of neural filament and astrocytic markers for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through modeling of stroke phases relevant to vascular cognitive impairment.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable stereotactic framework adaptable across mouse strains and tracer combinations for longitudinal studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in white matter injury models.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized coordinates, injection parameters, and tissue dissection protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early assessment of target engagement in axonal degeneration pathways.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by modeling a highly prevalent yet understudied stroke subtype linked to dementia risk.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stereotactic surgery and murine neuroanatomy for accurate white matter targeting.
- Dependent on calibrated pressure injection systems and sterile microsurgical tools for consistent lesion induction.
- Necessitates cross-team standardization of histological staining and imaging protocols for multi-site reproducibility.
- Involves adaptation considerations when applying the model across different murine genetic backgrounds or comorbid conditions.
- Practical limitations include small target size requiring strain-specific coordinate adjustments and meticulous postoperative care to ensure survival.
