快速风干滴染色体制备方法适用于FISH在植物

该方法的总体目标是使用单拷贝和高拷贝 DNA 探针制备适合于 C 2 杂交技术中荧光的植物染色体。这种方法可以帮助回答细胞遗传学和基因组研究中的关键问题，例如染色体重排的检测、染色体上遗传标记的排序以及不同物种之间的比较分析。该程序的主要优点是染色体传播的制备变得快速、简单和高效。

细胞悬液可在零下 20 度下储存长达两个月，并在需要时用于染色体制备。当我们观察到合适染色体的质量和数量急剧增加时，我们第一次有了这种方法的想法 10 到 20 个大麦种子在培养皿中的两层潮湿滤纸上发芽 两天后，在黑暗条件下在 22 至 24 摄氏度下放置两天。用剃须刀片从种子上剪掉一到两厘米长的旺盛根。

接下来，将装有冷自来水的 500 毫升玻璃瓶放入碎冰水中，准备冰水。将冰冷水充气并浸泡根尖 20 小时，以增加中期细胞的频率。将根部从水中转移到 50 毫升乙醇乙酸固定剂中，固定后在室温下固定两天。

在 50 毫升玻璃扬声器中，用 30 毫升冰冷的自来水清洗 10 到 20 根，每次 5 分钟。使用镊子将根部一一转移到 30 毫升柠檬酸盐缓冲液中。摇晃玻璃扬声器 5 分钟两次，清洗发根。

然后将根放在滤纸上，在显微镜下完全去除液体。使用剃须刀片切掉不需要的非分生组织。该程序最关键的步骤是确定不同物种之间可能不同的适当消化时间。

在这里，将多达 20 个根尖在 37 摄氏度的一毫升酶混合物中孵育约 50 分钟。为了在显微镜下软化手表镜中的植物组织，通过移液去除酶，并在冰上用 5 毫升 0.01 摩尔柠檬酸盐缓冲液洗涤根尖以替换残留的酶。继续用 1 毫升 96% 乙醇在同一手表玻璃杯中小心地清洗根尖两次。

然后每个根尖用 10 至 15 微升新鲜制备的固定剂替换乙醇。将根尖与固定剂一起转移到 2 毫升管中，然后用解剖针或镊子分解根茎。敲击试管 20 次以重悬细胞并获得细胞悬液。

接下来，将两到三层浸水的薄纸放在 50 摄氏度的热板上。将显微镜载玻片浸入冰箱中的冰、冷自来水中 30 分钟。然后将载玻片放在湿纸巾上，吸取 7 到 10 微升细胞悬液，并将其从 20 厘米的距离放到放置在热板上的冷却载玻片上。

随后在载玻片上与细胞悬液相同的位置加入 10 微升乙酸乙醇混合物，并将载玻片放在热板上。两分钟后，将玻片放在热板上，不要沾湿纸巾，再晾干一分钟。使用面部对比显微镜检查载玻片以控制染色体扩散的质量。

使用载玻片，或将 96% 乙醇浸入零下 20 摄氏度的 coplin 罐中储存，以便在捕鱼前预处理载玻片。使用镊子将玻片放入装有 50 毫升 2 个 XSSC 的 copin 罐中 5 分钟。将玻片转移到含有 50 mL 45% 乙酸的 coplan 染色缸中，放置 3 到 10 分钟。

接下来，将玻片转移到装有 50 mL 两种 XSSC 的 coplan 染色缸中，放置 10 分钟。然后将载玻片转移到装有 50 毫升 4% 甲醛的 Coplin 罐中，将载玻片浸入 10 分钟以固定染色体。将玻片在装有 50 毫升 2 个 XSSC 的 Coplin 染色缸中冲洗 3 次，每次 4 分钟，以去除甲醛。

然后在一系列 70%90% 和 100% 乙醇中将玻片脱水 2 分钟，并在垂直位置干燥玻片。对于每张玻片，使用 10 微升去离子形式酰胺、5 微升 4 X 杂交缓冲液、3 微升探针和 2 微升 D ns 游离水制备 20 微升杂交溶液。每张玻片添加 20 μL 杂交溶液，并用 24 x 32 毫米的盖玻片覆盖。

用橡胶水泥密封盖玻片后，用探针在热板上同时在 80 摄氏度下变性载玻片两分钟，将载玻片转移到潮湿的室中，并在 37 摄氏度下孵育过夜。避免光线充足，在带有两个 XSSC 的耦合罐中冲洗载玻片，以去除盖玻片。然后将玻片放入装有 55 至 60 摄氏度、两个 XSSC 的 coplan 罐中，孵育 20 分钟。

接下来，将玻片放入 coplan 染色缸中的两个 XSSC 中，在室温下放置 2 分钟。确定。将玻片在 coplan 染色缸中加入一系列 70%、90% 和 100% 乙醇脱水 2 分钟。空气。干燥载玻片并在 Antifa 封固剂中用 dappy 复染，避免强光。

使用落射荧光显微镜分析载玻片。如有必要，滤光片的选择取决于用于探针标记的荧光染料。将玻片在 4 摄氏度的黑暗条件下储存长达一年。

此处显示了通过快速风干滴式染色体制备方法制备的有丝分裂中期扩散。使用重复和单拷贝序列进行鱼类分析。图像是通过落射荧光显微镜获得的，该显微镜带有一组滤光片，能够激发相应的荧光四色，并由高灵敏度 CCD 单色相机捕获。

使用单拷贝探针和 5 个 S-R-D-N-A 对 hoard 和 vulgari 的有丝分裂中期染色体进行鱼类实验，揭示了独特且高质量的信号。CT CTT 10 微卫星在 HORDY 和 BULBUS 染色体上的杂交导致特异性和独特的模式。使用 PSC 119 两个探针对 sala 系列的有丝分裂中期染色体进行 fish 实验，产生了特异性和高质量的信号。

这种方法的明显优点是分布良好、未受损且大量中期染色体是成功进行鱼类分析的完美先决条件。一旦掌握，如果执行得当，此过程可以在两个小时内完成。看完这个视频，你应该对如何为鱼准备高质量的有丝分裂元面部染色体空间拍摄有一个很好的了解，对于鱼 IDE 和以前的人来说，身高可能是极其危险的，在执行这些程序时总是使用图表和胶片罩。