一种适用于植物FISH的快速空气干燥滴片染色体制备方法

本方法的总体目标是制备适用于荧光原位杂交技术的植物染色体，可使用单拷贝和高拷贝DNA探针进行检测。该方法有助于回答细胞遗传学和基因组研究中的关键问题，例如染色体重排的检测、染色体上遗传标记的排序，以及不同物种之间的比较分析。该实验流程的主要优势在于染色体铺展的制备过程快速、简便且高效。

细胞悬液可在负20摄氏度保存长达两个月，需要时可用于染色体制备。我们最初产生该方法的想法，是由于观察到合适染色体的质量和数量显著增加。在22至24摄氏度黑暗条件下，将10至20粒大麦种子置于培养皿中两层湿润滤纸上萌发两天后，用剃刀片从种子上切下长度为1至2厘米的健壮根尖。

接下来，将装有冷水的500毫升玻璃瓶放入碎冰水中，制备冰冻冷水。对冰冻冷水进行通气，并将根尖浸入其中20小时，以增加中期细胞的频率。固定后，将根从水中转移至50毫升乙醇-乙酸固定液中，在室温下固定两天。

用50毫升玻璃烧杯，加入30毫升冰冻自来水，将10至20根根系清洗两次，每次5分钟。用镊子将根系逐个转移至30毫升柠檬酸盐缓冲液中。通过振荡玻璃烧杯，清洗根系，每次5分钟，重复两次。

然后将根置于滤纸上，在显微镜下彻底去除液体。使用剃刀刀片切除不需要的非分生组织。该操作最关键的步骤是确定适当的消化时间，不同物种之间的消化时间可能有所不同。

此处将最多20个根尖置于1毫升酶混合液中，在37摄氏度下孵育约50分钟。在显微镜下的表面皿中软化植物组织时，用移液器吸除酶液，并在冰上用5毫升0.01摩尔柠檬酸缓冲液洗涤根尖，以置换残留的酶。随后在同一表面皿中，用1毫升96%乙醇小心洗涤根尖两次。

然后将乙醇替换为每份根尖加入10至15微升新配制的固定液。将根尖连同固定液一起转移至一个2毫升离心管中，用解剖针或镊子捣碎根尖分生组织。轻敲离心管20次，使细胞重悬，获得细胞悬液。

接下来，在50摄氏度的加热板上放置两到三层浸透水的纸巾。将显微镜载玻片浸入冰箱中的冰水或冷水30分钟。然后将载玻片置于湿润的纸巾上，用移液器吸取7至10微升细胞悬液，从20厘米高处滴加到放置在加热板上的冷却载玻片上。

随后在载玻片上与细胞悬液相同的位置滴加10微升乙酸乙醇混合液，并将载玻片置于加热板上。两分钟后，将载玻片继续放在加热板上，但不再覆盖湿纸巾，使其再干燥一分钟。使用相差显微镜检查载玻片，以控制染色体铺展的质量。

当日使用载玻片，或将其浸入盛有96%乙醇的考普林瓶中，于-20摄氏度保存，用于FISH前的预处理。用镊子将载玻片转移至含有50毫升2×SSC的考普林瓶中，孵育5分钟。再将载玻片转移至含有50毫升45%乙酸的考普林瓶中，处理3至10分钟。

接下来，将载玻片转移至含有50毫升2×SSC的染色缸中，孵育10分钟。然后将载玻片转移至含有50毫升4%甲醛的染色缸中，浸泡10分钟以固定染色体。用含有50毫升2×SSC的染色缸清洗载玻片，每次4分钟，重复三次，以去除甲醛。

然后将载玻片依次在70%、90%和100%乙醇中各脱水2分钟，并将载玻片垂直放置晾干。每张载玻片准备20微升杂交溶液，其中包含10微升去离子甲酰胺、5微升4×杂交缓冲液、3微升探针和2微升无DNase水。每张载玻片加入20微升杂交溶液，并加盖24×32毫米的盖玻片。

用橡胶胶水密封盖玻片后，将载玻片和探针同时置于热板上，在 80 摄氏度下变性 2 分钟，随后将载玻片转移至湿盒中，在 37 摄氏度下过夜孵育。避光条件下，用含有 2×SSC 的耦合罐冲洗载玻片以去除盖玻片，然后将载玻片放入盛有 55 至 60 摄氏度、2×SSC 溶液的共平面罐中，孵育 20 分钟。

接下来，将切片置于共平面染色缸中的2倍XSSC溶液内，室温下孵育2分钟。然后在共平面染色缸中依次使用70%、90%和100%乙醇进行脱水，每步2分钟。切片自然晾干后，使用含DAPI的抗荧光淬灭封片剂复染，避免强光照射。

使用落射荧光显微镜分析载玻片。滤光片的选择取决于探针标记所用的荧光染料（如有必要）。将载玻片置于四摄氏度避光条件下保存，可长达一年。

此处展示的是通过快速空气干燥滴片染色体制备法获得的有丝分裂中期染色体铺展图像。荧光原位杂交分析使用了重复序列和单拷贝序列进行。图像由落射荧光显微镜配备相应的荧光染料激发滤光片组获取，并通过高灵敏度CCD黑白相机采集。

利用单拷贝探针和五种S-R-D-N-A对硬粒小麦和普通小麦的有丝分裂中期染色体进行的FISH实验显示出清晰且高质量的信号。CT CTT 10微卫星在大麦和BULBUS染色体上的杂交产生了特异且清晰的模式。利用PSC 119两种探针对斯佩耳特小麦的有丝分裂中期染色体进行的FISH实验产生了特异且高质量的信号。

这种方法的显著优点在于能够获得分布均匀、无损伤且数量丰富的中期染色体，为成功的FISH分析提供了理想的先决条件。一旦掌握，若操作得当，整个流程可在两小时内完成。观看本视频后，您应能够充分理解如何制备高质量的有丝分裂中期染色体铺片，用于FISH、核型分析及其他相关研究。需要注意的是，某些操作可能具有较高危险性，因此在进行这些实验步骤时，务必始终佩戴手套并在通风橱中操作。