Name: 一种高效的植物多嵌合体荧光融合蛋白的协同表达 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: 了解在植物中高效协同表达多嵌合体荧光融合蛋白的方法。该技术利用单一表达质粒中的多个独立蛋白表达盒，显著提高蛋白共表达效率，适用于植物分子生物学和细胞生物学研究。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

感谢王实验室成员提供的有益讨论和意见。本工作由国家自然科学基金（NSFC，项目编号 31570001）以及广东省和广州市自然科学基金（项目编号 2016A030313401 和 201707010024）资助，资助对象为 H.W.。

1. 引物设计策略与DNA扩增
<ol>
	<li>设计用于DNA片段分子克隆的引物。引物包含20 bp的基因特异性结合序列以及20至25 bp的5'端突出序列，后者为相邻DNA分子的互补重叠序列（示例见表1）。 
	注意：各DNA片段的后续组装、不同蛋白表达盒之间的连接以及与最终表达载体的整合均依赖于相邻重叠序列的识别。</li>
	<li>通过标准PCR反应，使用相应的引物和高保真聚合酶扩增构建半独立蛋白表达盒所需的DNA片段，包括启动子、荧光报告基因、目的基因和终止子。 
	注意：本研究中用于DNA扩增的模板来源于先前的研究15,22,23。PCR反应的退火温度和延伸时间取决于引物和基因序列。</li>
</ol>
2. DNA 片段组装与蛋白表达盒的构建
<ol>
	<li>通过DNA电泳检测第一轮PCR产物的质量，并使用分光光度计进行定量。采用1%琼脂糖凝胶电泳检测是否存在DNA降解和污染。PCR产物的OD260/OD280比值应在1.6至1.8之间。</li>
	<li>将不同的DNA片段（每个片段0.05–0.1 pmol）混合至新的PCR管中，终体积为5 µL。 
	注意：将为同一蛋白表达盒设计的DNA分子混合至同一个PCR管中。避免将不同表达盒的DNA混合在一起，因为这会增加需要连接的DNA分子数量，从而降低DNA组装效率。 
	注意：此处可暂停实验流程。</li>
	<li>配制5倍浓缩液&#160;ISO 储存缓冲液：500 mM Tris-HCl，pH 7.5；50 mM MgCl2；1 mM 脱氧核苷三磷酸（dNTP）；50 mM 二硫苏糖醇；25% 聚乙二醇（PEG）8000；以及 5 mM 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）。</li>
	<li>从400 µL 5x溶液配制1 mL 2x母液混合物&#160;ISO 储存缓冲液，7.5 单位 T5 核酸外切酶，62.5 单位高保真 DNA 聚合酶，5,000 单位 Taq 聚合酶（参见 材料表），以及灭菌的双蒸水 H2O. 
	注意：本方法改编自以往的研究24,25,26；这些体积应进行优化。</li>
	<li>每管分装 100 µL 2x 母液，于 -20 °C 保存。 
	注意：2x 溶液反复冻融&#160;主混合物可能导致DNA组装效率降低。</li>
	<li>向5 µL DNA混合物中加入15 µL 2x主混合液，于50 °C孵育60分钟。</li>
</ol>
3. 在植物中共同表达多个嵌合荧光融合蛋白的载体构建
<ol>
	<li>通过第二轮PCR，以第一轮等温组装反应的产物（0.5 - 1.0 µL）为模板，使用最外侧引物扩增整个半独立的蛋白表达盒例如， 1-FP35S 和 1-RNOS 用于表达盒 1。
	<ol>
		<li>在50 µL反应体系中使用1单位高保真聚合酶，进行30个循环（94 °C变性30秒，55 °C退火30秒，68 °C延伸2分钟），最后在68 °C延伸5分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将用于蛋白质瞬时表达和遗传转化的最终蛋白表达骨架载体pUC18和pCAMBIA1300线性化，方法是加入4单位 Sma 将反应体系调整至终体积10 µL，于25 °C孵育1–2小时。随后在65 °C孵育20分钟以灭活限制性内切酶。</li>
	<li>将等摩尔量的蛋白表达盒DNA分子与线性化终末载体混合，总体积为5 µL。随后加入15 µL 2x主缓冲液，于50 °C孵育60分钟，进行第二轮DNA重组。</li>
	<li>使用第二轮等温重组反应的终产物转化感受态细胞 E. coli 细胞（例如， DH5α）按照标准操作步骤进行27通过菌落PCR和DNA测序对阳性克隆进行双重验证。从阳性克隆中提取质粒。 E. coli 使用小型质粒提取试剂盒提取质粒，并于 -80 °C 保存。 
	注意：对于长期储存，溶解于TE缓冲液或双蒸水中的质粒应妥善保存2O 比将它们保存在 E. coli 菌株</li>
</ol>
4. 利用基因枪轰击介导的瞬时共表达在植物中表达多种嵌合荧光融合蛋白
<ol>
	<li>准备烟草BY-2悬浮细胞 拟南芥 用于轰击的幼苗
	<ol>
		<li>在25 °C、130 rpm振荡条件下，每周继代培养两次，将BY-2细胞培养于Murashige和Skoog（MS）培养基中。用一张70 mm的灭菌滤纸过滤收集30 mL培养3天的BY-2细胞 通过 将真空压力设置为40 mbar，连接真空泵。</li>
		<li>为防止细胞在后续步骤中干燥，在将滤纸放入培养皿前，先向培养皿中加入数滴BY-2细胞液体培养基。</li>
		<li>将带有BY-2细胞的滤纸转移至新的培养皿（85 mm × 15 mm）中。</li>
		<li>表面灭菌 拟南芥 用含有0.05% Tween 20的70%（v/v）乙醇溶液与（Col-0）种子混合，涡旋振荡处理10分钟。</li>
		<li>使用台式离心机以最大速度离心种子2 s，弃去上清液，再用100%乙醇洗涤种子一次，持续30 s。在无菌操作台中，用移液器将种子转移至新的无菌滤纸上。随后将种子晾干，并铺展于½ MS琼脂平板上。</li>
		<li>将培养板在 4 °C 下保存 48 小时，然后转移至植物生长培养箱中，培养条件设置为：16 小时光照 / 8 小时黑暗，光照强度 120 - 150 µmol m⁻² s⁻¹-2 s-1 强度，22 °C.</li>
		<li>将7天大的样本植株转移至新制的½ MS培养基平板中央直径为30 mm的区域，以提高轰击效率。 
		注意：转移并放置植株到新的½ MS培养基平板时，应避免植株相互重叠。</li>
		<li>在植物或组织表面加入数滴½ MS液体培养基，以保持湿度，防止后续步骤中植物干燥。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用质粒DNA包被金颗粒。
	<ol>
		<li>涡旋震荡金微载体溶液，持续3分钟。准备一个新的1.5 mL离心管。</li>
		<li>依次将以下溶液加入离心管中，并涡旋混匀：25 µL（1.5 mg）金颗粒，涡旋10 s；10 µL 25.46 mg/L 亚精胺，涡旋10 s；5 µL 1 µg/µL 质粒DNA，涡旋3 min；25 µL 277.5 mg/L CaCl₂2 溶液，涡旋振荡1分钟。 
		注意：此步骤中需持续涡旋振荡。</li>
		<li>使用台式离心机以最大速度离心5秒，使金微载体沉淀，然后小心吸走上清液，避免扰动沉淀。用200 µL无水乙醇洗涤沉淀，并通过涡旋振荡5–10秒重新悬浮。再次以最大速度离心5秒，移除乙醇。</li>
		<li>将金颗粒重悬于18 µL无水乙醇中，并将6 µL颗粒悬液分装至三个宏载体的中央。静置使其自然干燥。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过粒子轰击将DNA转入植物中。
	<ol>
		<li>设置粒子递送系统参数如下：1100 psi、28 mm Hg 真空度、1 cm 间隙距离和 9 cm 粒子飞行距离。</li>
		<li>在琼脂培养基平板上，于三个不同位置对细胞/植株进行三次轰击，轰击后立即将细胞/植株置于黑暗条件下培养。 
		注意：操作粒子递送系统时需佩戴安全护目镜，因为该系统涉及高压气体和高速粒子。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将轰击后的细胞/植株置于植物培养室中，在观察荧光信号前于黑暗条件下培养6至72小时。设置植物培养室条件为24小时黑暗、22 °C。 
	注意：表达效率和荧光信号强度取决于启动子、基因以及植物/组织类型。</li>
</ol>
5. 通过共表达多种嵌合荧光蛋白生成稳定转基因拟南芥 农杆菌介导的转化
<ol>
	<li>将根癌农杆菌（Agrobacterium）感受态细胞（PMP90）置于冰上解冻，静置30分钟，然后向感受态细胞中加入2 µL双元载体（100 - 200 ng）（如上制备）。将混合物置于冰上孵育10分钟。</li>
	<li>将混合物转移至预冷的0.1 cm电穿孔比色皿中。将比色皿插入电穿孔系统，并按以下参数进行电穿孔：1.6 kV、600 ohms、25 µF。</li>
	<li>电穿孔后立即向比色皿中加入1 mL SOC液体培养基，用移液器将细胞转移至新的1.5 mL离心管中，并在28 °C、200 rpm的水平摇床上孵育120分钟。</li>
	<li>在室温下以2,348 × g离心5分钟，弃去大部分上清液，用移液器枪头轻轻重悬沉淀的细胞，将其涂布于含有50 mg/L潮霉素B的LB平板上，于28 °C培养2 - 3天。</li>
	<li>采用花浸法28将含有双元载体pCAMBIA1300（整合了多个蛋白表达盒）的根癌农杆菌（Agrobacterium）转化拟南芥（Arabidopsis thaliana）Col-0植株，以获得稳定遗传的转基因植株。</li>
	<li>通过将转基因拟南芥种子与含0.05% Tween 20的70%（v/v）乙醇混合进行表面灭菌。涡旋振荡10分钟。使用台式离心机以最大转速离心2秒，沉淀种子，弃去上清液，并用100%乙醇洗涤一次，持续30秒。</li>
	<li>在无菌操作台中将种子移至无菌滤纸上。随后，使其在空气中干燥，并转移至含潮霉素B的½ MS琼脂平板上，用于筛选阳性后代。</li>
	<li>将平板在4 °C下孵育2天，然后转移至植物培养室中继续培养7天。</li>
	<li>通过荧光显微镜检测荧光信号，筛选7天龄的存活幼苗，随后将阳性植株转移至土壤中，进一步筛选纯合植株。</li>
</ol>
6. 药物治疗
<ol>
	<li>进行药物处理时，将每种药物在液体MS培养基中稀释至其适当的工作浓度，再与细胞或植株共同孵育。
	<ol>
		<li>渥曼青霉素处理：将渥曼青霉素粉末溶于DMSO中，配制1 mM的储存液，并将储存液于-20 °C保存。将植物细胞或幼嫩植株转移至含有16.5 µM渥曼青霉素的液体MS培养基中，成像前孵育30 - 45分钟。</li>
		<li>布雷菲德菌素A（BFA）处理：将BFA粉末溶于DMSO中，配制1 mM的储存液，并将储存液于-20 °C保存。将植物细胞或幼嫩植株转移至含有10 µg/mL BFA的液体MS培养基中，成像前孵育30 - 45分钟。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 共聚焦显微镜成像与蛋白质亚细胞共定位分析
<ol>
	<li>将幼嫩植株或悬浮细胞转移至常规载玻片上，轻轻加盖盖玻片，用于标准共聚焦激光扫描显微镜成像。使用以下设置：63X&#160;水镜（数值孔径 1.4），背景值为 0，增益为 700，像素大小为 0.168 mm，检测器为光电倍增管。GFP 标记蛋白在 485 nm 处激发，于 525 nm 处检测荧光信号；RFP 标记蛋白在 514 nm 处激发，于 575 nm 处检测荧光信号。</li>
	<li>使用 Image J 软件（https://imagej.nih.gov/ij/）及此前所述的 Pearson-Spearman 相关性（PSC）共定位插件计算荧光信号的共定位比率8。结果中显示 Pearson 相关系数或 Spearman 等级相关系数（图 4）。所得 r 值范围为 -1 至 1。0 表示两种信号之间无明显相关性，+1 和 -1 分别表示两种信号完全正相关和完全负相关。</li>
</ol>

<ol><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">The green fluorescent protein.</a> Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).</li>
<li>Tsien, R. Y., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+the+machinery+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Seeing the machinery of live cells.</a> Science. 280 (5371), 1954-1955 (1998).</li>
<li>Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+Plant+Cells+in+a+Brand+New+Way%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant%22%5BJournal%5D)">Visualizing Plant Cells in a Brand New Way.</a> Mol Plant. 9 (5), 633-635 (2016).</li>
<li>Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+new+fluorescent+probes+for+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Creating new fluorescent probes for cell biology.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (12), 906-918 (2002).</li>
<li>Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+protein+dynamics+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Studying protein dynamics in living cells.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (6), 444-456 (2001).</li>
<li>Tse, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+multivesicular+bodies+as+prevacuolar+compartments+in+Nicotiana+tabacum+BY-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of multivesicular bodies as prevacuolar compartments in Nicotiana tabacum BY-2 cells.</a> Plant Cell. 16 (3), 672-693 (2004).</li>
<li>Wang, H., Zhuang, X., Cai, Y., Cheung, A. Y., Jiang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apical+F-actin-regulated+exocytic+targeting+of+NtPPME1+is+essential+for+construction+and+rigidity+of+the+pollen+tube+cell+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Apical F-actin-regulated exocytic targeting of NtPPME1 is essential for construction and rigidity of the pollen tube cell wall.</a> Plant J. 76 (3), 367-379 (2013).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Distinct+Pathway+for+Polar+Exocytosis+in+Plant+Cell+Wall+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">A Distinct Pathway for Polar Exocytosis in Plant Cell Wall Formation.</a> Plant Physiol. 172 (2), 1003-1018 (2016).</li>
<li>Canto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+Expression+Systems+in+Plants%3A+Potentialities+and+Constraints%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Transient Expression Systems in Plants: Potentialities and Constraints.</a> Adv Exp Med Biol. 896, 287-301 (2016).</li>
<li>Ishida, Y., Hiei, Y., Komari, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-mediated+transformation+of+maize%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-mediated transformation of maize.</a> Nat Protoc. 2 (7), 1614-1621 (2007).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+agrobacterium-mediated+transformation+in+soybean%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Optimization of agrobacterium-mediated transformation in soybean.</a> Front Plant Sci. 8, 246(2017).</li>
<li>Manavella, P. A., Chan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+transformation+of+sunflower+leaf+discs+via+an+Agrobacterium-mediated+method%3A+applications+for+gene+expression+and+silencing+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Transient transformation of sunflower leaf discs via an Agrobacterium-mediated method: applications for gene expression and silencing studies.</a> Nat Protoc. 4 (11), 1699-1707 (2009).</li>
<li>Martin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+expression+in+Nicotiana+benthamiana+fluorescent+marker+lines+provides+enhanced+definition+of+protein+localization%2C+movement+and+interactions+in+planta%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Transient expression in Nicotiana benthamiana fluorescent marker lines provides enhanced definition of protein localization, movement and interactions in planta.</a> Plant J. 59 (1), 150-162 (2009).</li>
<li>Miao, Y., Jiang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+expression+of+fluorescent+fusion+proteins+in+protoplasts+of+suspension+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Transient expression of fluorescent fusion proteins in protoplasts of suspension cultured cells.</a> Nat Protoc. 2 (10), 2348-2353 (2007).</li>
<li>Wang, H., Jiang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+expression+and+analysis+of+fluorescent+reporter+proteins+in+plant+pollen+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Transient expression and analysis of fluorescent reporter proteins in plant pollen tubes.</a> Nat Protoc. 6 (4), 419-426 (2011).</li>
<li>Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+mesophyll+protoplasts%3A+A+versatile+cell+system+for+transient+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis mesophyll protoplasts: A versatile cell system for transient gene expression analysis.</a> Nat Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).</li>
<li>Candat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+determination+of+organelle+targeting-peptide+cleavage+sites+using+transient+expression+of+green+fluorescent+protein+translational+fusions%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Experimental determination of organelle targeting-peptide cleavage sites using transient expression of green fluorescent protein translational fusions.</a> Anal Biochem. 434 (1), 44-51 (2013).</li>
<li>Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fluorescent+toolbox+for+assessing+protein+location+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The fluorescent toolbox for assessing protein location and function.</a> Science. 312 (5771), 217-224 (2006).</li>
<li>Binder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modular+plasmid+assembly+kit+for+multigene+expression%2C+gene+silencing+and+silencing+rescue+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A modular plasmid assembly kit for multigene expression, gene silencing and silencing rescue in plants.</a> PLoS One. 9 (2), e88218(2014).</li>
<li>Engler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+golden+gate+modular+cloning+toolbox+for+plants%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">A golden gate modular cloning toolbox for plants.</a> ACS Synth Biol. 3 (11), 839-843 (2014).</li>
<li>Forner, J., Binder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+red+fluorescent+protein+eqFP611%3A+Application+in+subcellular+localization+studies+in+higher+plants%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">The red fluorescent protein eqFP611: Application in subcellular localization studies in higher plants.</a> BMC Plant Biol. 7, 28(2007).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vacuolar+sorting+receptors+%28VSRs%29+and+secretory+carrier+membrane+proteins+%28SCAMPs%29+are+essential+for+pollen+tube+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Vacuolar sorting receptors (VSRs) and secretory carrier membrane proteins (SCAMPs) are essential for pollen tube growth.</a> Plant J. 61 (5), 826-838 (2010).</li>
<li>Wang, H., Zhuang, X. H., Hillmer, S., Robinson, D. G., Jiang, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vacuolar+sorting+receptor+%28VSR%29+proteins+reach+the+plasma+membrane+in+germinating+pollen+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant%22%5BJournal%5D)">Vacuolar sorting receptor (VSR) proteins reach the plasma membrane in germinating pollen tubes.</a> Mol Plant. 4 (5), 845-853 (2011).</li>
<li>Chen, W. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+in+vitro+splicing+of+coding+sequences+from+genomic+DNA+by+isothermal+recombination+reaction-based+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+%26+Biotechnological+Equipment%22%5BJournal%5D)">Rapid in vitro splicing of coding sequences from genomic DNA by isothermal recombination reaction-based PCR.</a> Biotechnology & Biotechnological Equipment. 30 (5), 864-868 (2016).</li>
<li>Zhu, Q. L., Yang, Z. F., Zhang, Q. Y., Chen, L. T., Liu, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+multi-type+plasmid+modifications+based+on+isothermal+in+vitro+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Robust multi-type plasmid modifications based on isothermal in vitro recombination.</a> Gene. 548 (1), 39-42 (2014).</li>
<li>Torella, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+construction+of+insulated+genetic+circuits+via+synthetic+sequence-guided+isothermal+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Rapid construction of insulated genetic circuits via synthetic sequence-guided isothermal assembly.</a> Nucleic Acids Res. 42 (1), 681-689 (2014).</li>
<li>Siguret, V., Ribba, A. S., Cherel, G., Meyer, D., Pietu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+plasmid+size+on+transformation+efficiency+by+electroporation+of+Escherichia+coli+DH5+alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Effect of plasmid size on transformation efficiency by electroporation of Escherichia coli DH5 alpha.</a> Biotechniques. 16 (3), 422-426 (1994).</li>
<li>Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. S., Niu, Q. W., Chua, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana+using+the+floral+dip+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method.</a> Nat Protoc. 1 (2), 641-646 (2006).</li>
<li>Lam, S. K., Cai, Y., Hillmer, S., Robinson, D. G., Jiang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCAMPs+highlight+the+developing+cell+plate+during+cytokinesis+in+tobacco+BY-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">SCAMPs highlight the developing cell plate during cytokinesis in tobacco BY-2 cells.</a> Plant Physiol. 147 (4), 1637-1645 (2008).</li>
<li>Lam, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rice+SCAMP1+defines+clathrin-coated%2C+trans-golgi-located+tubular-vesicular+structures+as+an+early+endosome+in+tobacco+BY-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Rice SCAMP1 defines clathrin-coated, trans-golgi-located tubular-vesicular structures as an early endosome in tobacco BY-2 cells.</a> Plant Cell. 19 (1), 296-319 (2007).</li>
<li>Jiang, L., Rogers, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integral+membrane+protein+sorting+to+vacuoles+in+plant+cells%3A+evidence+for+two+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Integral membrane protein sorting to vacuoles in plant cells: evidence for two pathways.</a> J Cell Biol. 143 (5), 1183-1199 (1998).</li>
<li>Fernandez-Abalos, J. M., Fox, H., Pitt, C., Wells, B., Doonan, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant-adapted+green+fluorescent+protein+is+a+versatile+vital+reporter+for+gene+expression%2C+protein+localization+and+mitosis+in+the+filamentous+fungus%2C+Aspergillus+nidulans%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Plant-adapted green fluorescent protein is a versatile vital reporter for gene expression, protein localization and mitosis in the filamentous fungus, Aspergillus nidulans.</a> Mol Microbiol. 27 (1), 121-130 (1998).</li>
<li>Bruening, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+gene+silencing+regularized%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Plant gene silencing regularized.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (23), 13349-13351 (1998).</li>
<li>Wassenegger, M., Pelissier, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+for+RNA-mediated+gene+silencing+in+higher+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A model for RNA-mediated gene silencing in higher plants.</a> Plant Mol Biol. 37 (2), 349-362 (1998).</li>
<li>Dehio, C., Schell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+plant+genetic+loci+involved+in+a+posttranscriptional+mechanism+for+meiotically+reversible+transgene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Identification of plant genetic loci involved in a posttranscriptional mechanism for meiotically reversible transgene silencing.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (12), 5538-5542 (1994).</li>
<li>Zhong, G., Zhu, Q., Li, Y., Liu, Y., Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Once+for+all%3A+A+novel+robust+system+for+co-expression+of+multiple+chimeric+fluorescent+fusion+proteins+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Once for all: A novel robust system for co-expression of multiple chimeric fluorescent fusion proteins in plants.</a> Front Plant Sci. 8, 1071(2017).</li>
<li>Li, X. T., Xie, Y. Y., Zhu, Q. L., Liu, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+genome+editing+in+genes+and+cis-regulatory+regions+improves+qualitative+and+quantitative+traits+in+crops%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Targeted genome editing in genes and cis-regulatory regions improves qualitative and quantitative traits in crops.</a> Molecular Plant. 10 (11), 1368-1370 (2017).</li>
<li>Zhu, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+%26%2334%3Bpurple+endosperm+rice%27%27+by+engineering+anthocyanin+biosynthesis+in+the+endosperm+with+a+high-efficiency+transgene+stacking+system%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Development of &#34;purple endosperm rice'' by engineering anthocyanin biosynthesis in the endosperm with a high-efficiency transgene stacking system.</a> Molecular Plant. 10 (7), 918-929 (2017).</li>
<li>Tang, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-step+formation%2C+evolution%2C+and+functionalization+of+new+cytoplasmic+male+sterility+genes+in+the+plant+mitochondrial+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Multi-step formation, evolution, and functionalization of new cytoplasmic male sterility genes in the plant mitochondrial genomes.</a> Cell Research. 27 (1), 130-146 (2017).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文展示了一种在植物中稳定共表达嵌合型荧光融合蛋白的新方法。该方法适用于瞬时表达和遗传转化，并且与当前基于荧光蛋白的生物成像、分子及生化应用和技术兼容9,10,13。此外，该方法克服了传统方法使用多个独立表达质粒进行蛋白共表达时所面临的困难。相比之下，本方法采用单一表达载体，其中包含多个蛋白表达盒，每个表达盒均具有独立的启动子、荧光标签、目标蛋白和终止子。而且，各个蛋白表达盒可独立调控，以满足不同的表达需求，例如使用特定启动子，或实现荧光蛋白与目标蛋白的N端或C端嵌合融合。因此，蛋白表达盒在质粒中发挥着类似于基本&#34;Lego&#34;元件的作用，可半独立地工作。此外，该系统还具有高度的灵活性，通过一步式等温重组反应即可轻松实现基因编辑、替换和组装，无需额外的酶切和连接步骤。我们通过测试不同浓度的T5核酸外切酶、Phusion DNA聚合酶和Taq聚合酶，优化了等温重组反应的效率，具体如步骤2.4所述。此外，建议用于一步式等温重组反应的每种DNA片...

嵌合型荧光融合蛋白被认为是研究细胞内动态过程和亚细胞定位的有用工具，有助于进一步理解其生理功能和作用机制1,2,3,4。共表达已知的细胞器标记蛋白与目标蛋白，对于更清晰地阐明目标蛋白在细胞内膜系统中的时空分布规律、定位特征及功能尤为有益4,5,6,7,8。
一种嵌合型荧光融合蛋白可在植物中表达 通过 瞬时表达与稳定遗传转化，二者各有其优势与局限性9,10,11瞬时表达蛋白是一种便捷的方法，包括通过基因枪轰击、聚乙二醇（PEG）介导或电穿孔介导的原生质体DNA瞬时表达 农杆菌介导的完整植物细胞叶片浸润，如图所示 图1A，B12,13,14,15,16然而，在单个植物细胞中共同表达多种嵌合荧光融合蛋白需要使用多种独立表达质粒的混合物。因此，采用多个质粒在植物中进行蛋白共表达存在以下缺点：与单个质粒相比，多个质粒同时进入同一细胞的概率显著降低，导致共表达水平下降；此外，由于转入细胞的各类质粒数量具有不可控的随机性，会引起蛋白表达水平的差异。17,18此外，在技术上很难将多个独立的表达质粒导入单个细胞中 农杆菌 用于蛋白共表达9,10,11因此， 农杆菌介导的蛋白质瞬时表达通过浸润烟草叶片实现，每次仅能表达一个质粒，如图所示 图1B相比之下，表达荧光融合蛋白的转基因植物通常通过以下方式获得 农杆菌 携带一个双元转化载体。然而，介导基因转移并插入植物基因组的双元载体仅能表达一种荧光融合蛋白（图1B)9,10,12同时表达多种嵌合荧光蛋白的转基因植物的创制需要多轮遗传杂交与筛选，所需时间从数月到数年不等，具体取决于共表达基因的数量。
已有多个先前的研究报道了在植物中利用单个表达载体共表达多种蛋白质的方法19,20,21。然而，通常需要多轮的DNA分子与骨架载体的酶切消化和DNA连接反应，才能构建出用于蛋白质共表达或过表达的最终质粒。本文中，我们开发了一种新型且稳健的方法，用于在植物中共表达多种嵌合荧光蛋白。该方法高效便捷，可实现植物中多种蛋白质的共表达，适用于瞬时表达和稳定转化，且操作方式经典可靠。该方法采用一个包含多个功能上相互独立的蛋白表达盒的单载体进行蛋白共表达，从而克服了传统方法的诸多缺点。此外，该系统具有高度通用性，其DNA操作与组装通过一步优化反应即可完成，无需额外的DNA消化和连接步骤。其工作原理如图2所示。更重要的是，该系统完全兼容当前基于嵌合荧光融合蛋白的细胞、分子及生物化学研究方法。

<table><tbody><tr><td>KOD-FX 聚合酶</td><td>TOYOBO</td><td>KFX-101</td><td></td></tr><tr><td>Sma I</td><td>NEB</td><td>R0141L/S/V</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>BBI</td><td>A600194-0500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>BBI</td><td>A601336-0500</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>NEB</td><td>#N0447V</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>BBI</td><td>C4H10O2S2</td><td></td></tr><tr><td>PEG 8000</td><td>BBI</td><td>A100159-0500</td><td></td></tr><tr><td>NAD</td><td>BBI</td><td>A600641-0001</td><td></td></tr><tr><td>T5 核酸外切酶</td><td>Epicentre</td><td>T5E4111K</td><td></td></tr><tr><td>Phusion 高保真 DNA 聚合酶</td><td>NEB</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA 聚合酶</td><td>NEB</td><td>B9022S</td><td></td></tr><tr><td>Murashige 和 Skoog 基本盐混合物（MS）</td><td>Sigma</td><td>M5524</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>BBI</td><td>A500737-0500</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>BBI</td><td>A600560-0500</td><td></td></tr><tr><td>琼脂</td><td>BBI</td><td>A505255-0250</td><td></td></tr><tr><td>亚精胺</td><td>BBI</td><td>A614270-0001</td><td></td></tr><tr><td>金微载体颗粒</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2263</td><td>1.0 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>BBI</td><td>CD0050-500</td><td></td></tr><tr><td>宏载体</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2335</td><td></td></tr><tr><td>破裂盘</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2329</td><td></td></tr><tr><td>阻挡网</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2336</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>OXOID</td><td>LP0042</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>OXOID</td><td>LP0021</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>BBI</td><td>A610476-0001</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>BBI</td><td>A610440-0500</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>BBI</td><td>A600219-0001</td><td></td></tr><tr><td>潮霉素 B</td><td>Genview</td><td>AH169-1G</td><td></td></tr><tr><td>渥曼青霉素</td><td>Sigma</td><td>F9128</td><td></td></tr><tr><td>布雷菲德菌素 A</td><td>Sigma</td><td>SML0975-5MG</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>BBI</td><td>A600163-0500</td><td></td></tr><tr><td>T100 梯度PCR仪</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>培养箱</td><td>松下</td><td>MLR-352H-PC</td><td></td></tr><tr><td>PSD-1000/He 基因枪系统</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2257</td><td></td></tr><tr><td>基因脉冲仪</td><td>Bio-Rad</td><td>1652660</td><td></td></tr><tr><td>电穿孔杯</td><td>Bio-Rad</td><td>1652083</td><td></td></tr><tr><td>台式离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5427000097</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>蔡司</td><td></td><td>LSM 7 DUO (780&amp;amp;7Live)</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000/2000c 分光光度计</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>EPS-300 电泳电源</td><td>天能</td><td>EPS 300</td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>麦克奥迪</td><td>MF30</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>BBI</td><td>A600234</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>BBI</td><td>A100339</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸</td><td>BBI</td><td>B300599</td><td></td></tr></tbody></table>

高效共表达多种嵌合荧光融合蛋白的植物方法

Co-expression of Multiple Chimeric Fluorescent Fusion Proteins in an Efficient Way in Plants

了解蛋白质在细胞内的时空亚细胞定位对其生理功能的研究至关重要。荧光蛋白及其融合蛋白的构建已被广泛用作直接观察细胞内蛋白质定位与动态变化的有效工具。在共表达目标蛋白后，将其与已知的细胞器标记蛋白进行比较尤为有用。然而，植物中传统的蛋白共表达方法通常需要多个独立的表达质粒，因而存在共表达效率低、表达水平差异大以及遗传杂交和筛选过程耗时较长等缺点。本研究中，我们描述了一种在植物中同时表达多个嵌合荧光蛋白的高效且新颖的方法。该方法通过使用包含多个半独立表达盒的单一表达载体，克服了传统方法的局限性。每个蛋白表达盒均含有独立的功能性蛋白表达元件，因此可根据不同的表达需求灵活调整。此外，利用优化的一步法反应即可完成表达质粒中DNA片段的组装与操作，无需额外的酶切与连接步骤，简便快捷。同时，该系统完全兼容当前基于荧光蛋白的生物成像技术与应用，如FRET和BiFC。为验证该方法的有效性，我们利用这一新系统共表达了荧光标记的液泡分选受体与分泌载体膜蛋白。结果表明，无论是通过瞬时表达还是遗传转化，这些蛋白的亚细胞定位均与以往研究结果一致。

我们开发了一种在植物中协同表达多种嵌合荧光融合蛋白的稳健且高效的方法。该方法突破了传统方法需使用多个独立质粒进行蛋白共表达的局限，如图所示 图1A，B， 通过 瞬时表达或稳定遗传转化。在这一新方法中，我们构建一个包含多个蛋白表达盒的单一表达载体，以实现多种蛋白的同时共表达。图1C，D）。蛋白表达盒可凭借其自身用于蛋白表达所必需的DNA元件实现半独立功能。因此，每个蛋白表达盒均可根据不同的蛋白表达需求进行独立定制。对于最终的蛋白共表达载体而言，其中的蛋白表达盒发挥着基础作用 &#34;乐高&#34; 可便捷地进行修饰、重建和替换的元件。此外，该方法还可简便地实现DNA分子的组装、多个蛋白表达盒的连接，以及DNA片段与最终目的载体的整合，从而共表达嵌合型荧光融合蛋白。 通过 一种优化的等温扩增方法 体外 无需额外的DNA消化和连接步骤即可...

我们开发了一种在植物中共同表达多种嵌合型荧光融合蛋白的新方法，以克服传统方法的困难。该方法利用含有多个功能上相互独立的蛋白表达盒的单个表达质粒，实现蛋白的共表达。

了解蛋白质在细胞内的时空亚细胞定位信息，对于阐明其生理功能至关重要。荧光……

该方法有助于解答植物分子与细胞生物学领域的关键问题，例如，我们如何研究细胞内的蛋白质。此技术的主要优势在于，能够在单一表达载体中高效共表达细胞融合蛋白。本实验操作将由本实验室的研究生Guitao Zhong进行演示。首先，按照文本方案中所述设计用于DNA片段分子克隆的引物。使用相应的引物和高保真聚合酶，通过标准PCR反应扩增构建半独立蛋白表达盒所需的DNA片段，包括启动子、荧光报告基因、目的基因和终止子。通过使用1%琼脂糖凝胶进行DNA电泳，检测第一轮PCR产物的质量，观察是否存在DNA降解及污染。使用分光光度计对PCR产物进行定量。PCR产物在260和280纳米处的吸光度比值应在1.6至1.8之间。将为同一蛋白表达盒设计的DNA片段混合至一个PCR管中，总体积为五微升。关于混合来自不同表达盒数据的DNA。由于需要连接的DNA分子数量增加，等量混合会降低DNA组装的效率。现在，向5微升DNA混合物中加入15微升2x主混合液，在50摄氏度下孵育60分钟。通过第二轮PCR扩增整个半独立的蛋白质表达盒。以第一轮等温组装反应产物的0.5至1微升作为模板，使用最外侧的引物进行扩增。在50微升反应体系中使用一个单位的高保真聚合酶进行30个循环，随后在68摄氏度下延伸5分钟。接下来，在终体积为10微升的反应体系中加入4个单位的小一酶，线性化最终的蛋白表达骨架载体POC 18和载体CAMBIA 1300。这些载体设计用于蛋白瞬时表达和遗传转化。在25摄氏度下孵育限制性酶切反应一至两小时。酶切完成后，于65摄氏度孵育20分钟以灭活限制性内切酶。接着，将等摩尔量的蛋白表达盒DNA分子与线性化的终末载体混合，总体积为五微升。最后，通过将反应物与15微升2x主缓冲液混合，并在50摄氏度孵育60分钟，进行第二轮DNA重组。为准备用于轰击的烟草BY-2悬浮细胞，将30毫升培养3天的BY-2细胞用真空泵过滤收集到一张70毫升已灭菌的滤纸上，真空压力设置为40毫巴。同时，在培养皿中加入数滴BY-2细胞液体培养基。将带有BY-2细胞的滤纸转移至培养皿中。为准备拟南芥幼苗进行微粒轰击，按照文本方案中的详细步骤准备七日龄的样品植株。然后将其转移至新的半倍浓度MS培养基平板中央的矩形区域，以提高轰击效率。转移和放置植株到培养板上时，注意避免植株相互重叠。在植株或组织表面加入数滴半浓度的MS液体培养基，以保持湿度，防止后续操作过程中植株失水干燥。为使金微粒包被质粒DNA，首先将金微载体溶液充分涡旋振荡3分钟。现在，将25 µL金颗粒加入一个新的1.5 mL离心管中，涡旋振荡10秒。加入10 µL浓度为25.46 mg/L的亚精胺，涡旋振荡10秒。接着，加入5 µL浓度为1 µg/µL的质粒DNA，涡旋振荡3分钟。最后，加入25微升浓度为277.5毫克/升的氯化钙溶液，涡旋混匀1分钟。使用台式离心机以最大速度离心5秒，使金微载体沉淀。离心后，小心移除上清液，注意不要扰动沉淀物。接着，用200微升无水乙醇洗涤沉淀，通过涡旋振荡5至10秒重新悬浮沉淀。再次以最大速度离心金微载体5秒，弃去乙醇。将金颗粒重新悬浮于18微升无水乙醇中。然后，取六微升颗粒悬浮液，分别滴加到三个微载体的中央，使其自然风干。为通过粒子轰击将DNA转入细胞和植株，首先按照文本方案中所述设置粒子递送系统。随后，在农杆菌共培养平板上，于三个不同位置对细胞或植株进行三次轰击。在观察荧光信号前，将轰击后的细胞和植株置于植物培养箱中避光培养6至72小时。将植物培养箱设置为持续黑暗条件，温度为22摄氏度。将幼嫩植株或悬浮细胞转移至普通玻璃载玻片上，轻轻盖上盖玻片，用于标准共聚焦激光扫描显微镜成像。根据文本方案中列出的设置，在 485 纳米处激发 GFP 标记的蛋白质，并在 525 纳米处检测荧光信号。对于 RFP 标记的蛋白质，在 585 纳米处激发，并在 608 纳米处检测荧光信号。最后，按照文本方案中所述方法计算荧光信号的共定位比率。通过微粒轰击法在烟草BY-2细胞中实现了拟南芥VSR-2与拟南芥SCAMP4的共表达，并显示出正确的定位。RFP标记的拟南芥VSR-2呈现点状分布模式，与定位于质膜的拟南芥SCAMP4-GFP不同，后者在细胞质中可见一些点状结构。此外，通过农杆菌介导的转化方法获得了共表达拟南芥SCAMP4-GFP和RFP标记的拟南芥VSR-2的拟南芥转基因植株。展示了两种嵌合蛋白在根细胞和根毛细胞中共表达时的亚细胞定位。与先前的研究一致，转基因拟南芥经处理后，RFP标记的拟南芥VSR-2定位于前液泡区室，形成小的环状结构；而经prefoldin A处理则诱导了GFP标记的拟南芥SCAMP定位于反式高尔基体网络并发生聚集。作为阴性对照，在相同成像条件下，烟草 BY-2 细胞以及拟南芥根和根毛细胞中几乎观察不到自发荧光信号。该方法可帮助了解蛋白质的亚细胞定位，也可用于研究蛋白质的作用方向。该技术问世后，为植物细胞生物学领域的研究人员开辟了新的途径，可方便地研究活体植物细胞中蛋白质的亚细胞定位及其空间相互作用。在此基础上，还可进一步采用PET介导的转化和遗传杂交等方法，以回答其他科学问题，例如如何在植物中共同表达多种融合蛋白。请注意，进行轰击操作可能具有极高危险性，执行该步骤时应始终采取防护措施，例如佩戴护目镜。

co-expression-multiple-chimeric-fluorescent-fusion-proteins-an

Research

科研

JoVE Journal

Chemistry

化学

一种高效的植物多嵌合体荧光融合蛋白的协同表达

我们开发了一种在植物中检测蛋白质-蛋白质相互作用的技术。将黄色荧光蛋白（YFP）分割成两个不重叠的片段，每个片段通过Gateway系统与目标基因进行同框克隆，从而表达融合蛋白。只有当目标蛋白质发生相互作用时，YFP荧光信号才会重建。...

利用适用于Gateway系统的双分子荧光互补（BiFC）技术检测植物中的蛋白质相互作用

植物提供了一种新颖的系统，可用于大规模商业化生产药用蛋白，相较于现有的表达模式，该系统更具可扩展性、成本效益更高且更安全。在本研究中，我们报道了一种简单便捷且可扩展的方法，将含有目的基因的根癌农杆菌（Agrobacterium...

高效农杆菌浸润法实现植物中重组蛋白的高水平瞬时表达

本研究介绍了一种利用BioRad基因枪检测的植物亚细胞器选择性靶向新方法。...

利用Gibson组装和基因枪在烟草中进行瞬时基因表达

关键词：瞬时表达，烟草，Gibson组装，基因枪，植物转化，分子克隆，重组DNA技术

利用双分子荧光互补技术在烟草原生质体和叶片中可视化蛋白质-蛋白质相互作用

成像细胞器及其他亚细胞结构的动态行为 体内 可以揭示它们在生理和疾病状态下的功能。本文介绍了对两种细胞器——中心体和线粒体——进行遗传标记的方法，并利用宽场显微镜和共聚焦显微镜对活体斑马鱼胚胎中这些细胞器的动态行为进行成像。...

活体斑马鱼胚胎中亚细胞结构的成像

植物细胞间的连接结构——胞间连丝（Pd），在植物生理过程及植物与病毒的相互作用中发挥着核心作用。决定蛋白质向胞间连丝运输的关键因素是引导蛋白质定位至胞间连丝的分选信号。然而，目前对这类信号序列的认识仍处于初级阶段。本文介绍一种用于鉴定靶向胞间连丝蛋白中胞间连丝定位信号的策略。...

鉴定蛋白质中的胞间连丝定位序列 活体植株中

非裂解型昆虫细胞表达系统在蛋白质生产、细胞内运输/定位以及重组蛋白功能分析方面尚未得到充分利用。本文介绍了在商业可得的鳞翅目细胞系中构建表达载体并进行瞬时蛋白表达的方法。同时展示了烟粉虱（Bemisia...

培养昆虫细胞中重组蛋白的瞬时表达与细胞定位

基于荧光蛋白的方法在监测细菌向宿主细胞分泌效应蛋白时面临挑战，这主要是由于荧光蛋白与III型分泌系统之间存在不兼容性。本文采用一种优化的分裂型超折叠GFP系统，用于可视化细菌向宿主植物细胞中分泌的效应蛋白。...

利用分裂型绿色荧光蛋白系统可视化细菌感染过程中递送的效应蛋白

在Nicotiana benthamiana中瞬时表达IgG融合蛋白的制备

本文介绍一种利用荧光标记蛋白结合基于BiFC的FRET-FLIM检测技术，可视化三种蛋白质伙伴之间三元复合物形成的方法。该方法对于研究蛋白质-蛋白质相互作用复合物具有重要价值。 体内.

通过BiFC-FRET-FLIM检测法测定MADS-box转录因子两个单体与钙感受蛋白之间的三元相互作用

荧光共振能量转移（FRET）是一种用于在活细胞中检测蛋白质相互作用的成像技术。本文介绍了一种FRET实验方案，用于研究组蛋白修饰酶与转录因子之间的相互作用，后者可将这些酶招募至靶启动子，从而在植物组织中实现基因表达的表观遗传调控。...

研究组蛋白修饰酶与转录因子之间的相互作用 在体 通过荧光共振能量转移

了解在植物中高效协同表达多嵌合体荧光融合蛋白的方法。该技术利用单一表达质粒中的多个独立蛋白表达盒，显著提高蛋白共表达效率，适用于植物分子生物学和细胞生物学研究。

高效共表达多种嵌合荧光融合蛋白的植物方法

探索更多视频