Co-expression of Multiple Chimeric Fluorescent Fusion Proteins in an Efficient Way in Plants

这种方法可以帮助回答植物分子和细胞生物学领域的关键问题，例如，我们如何在细胞中构建蛋白质。该技术的主要优点是在一个表达载体中共表达细胞融合蛋白的高效率。演示该程序的是我们实验室的研究生 Guitao Zhong。

首先，按照文本方案中的说明设计用于 DNA 片段分子克隆的引物。通过标准PCR反应及其相应的引物和高保真聚合酶，扩增构建半非依赖性蛋白表达盒所需的DNA片段。这些包括启动子、荧光报告基因、靶基因和终止子。

使用 1% 琼脂糖凝胶进行 DNA 电泳，寻找 DNA 降解和污染，检查第一轮 PCR 产物的质量。用分光光度计定量 PCR 产物。PCR 产物在 260 和 280 纳米处的读数之间的比率应在 1.6 和 1.8 之间。

将设计用于相同蛋白表达盒的 DNA 片段在一个 PCR 管中混合，最终体积为 5 μL。关于混合来自不同表达盒数据的 DNS。由于相等会降低 DNA 组装的效率，因为需要连接的 DNA 分子数量增加。

现在，将 15 微升 2x 主混合物添加到 5 微升 DNA 混合物中，并在 50 摄氏度下孵育 60 分钟。通过第二轮 PCR 扩增整个半非依赖性蛋白表达盒。使用 0.5 比 1 微升来自第一轮等温组装反应的产物作为最外层引物中的模板。

使用 50 μL 反应体积的 1 个单位的高保真聚合酶 30 个循环，然后在 68 摄氏度下最后延伸 5 分钟。接下来，将最终蛋白表达骨架载体 POC 18 和载体 CAMBIA 1300 线性化，方法是在最终的 10 μL 反应体积中加入 4 个单位的小 1。这些载体设计用于蛋白质瞬时表达和遗传转化。

将限制性酶切酶在 25 摄氏度下孵育 1 至 2 小时。消化后，通过在 65 摄氏度下孵育 20 分钟来灭活限制性内切酶。接下来，将蛋白表达盒的等摩尔 DNA 分子和线性化的最终载体混合成 5 μL 的最终反应体积。

最后，通过将反应物与 15 μL 2x 主缓冲液混合，并在 50 摄氏度下孵育 60 分钟来进行第二轮 DNA 重组。为了制备用于轰击的烟草 BY-2 悬浮细胞，将真空压力设置为 40 毫巴，通过真空泵将 30 毫升培养的 BY-2 细胞过滤收集到一块 70 毫升高压灭菌滤纸上。同时，将几滴 BY-2 细胞液体培养基加入培养皿中。

将带有 BY-2 细胞的滤纸转移到培养皿中。为了准备用于轰炸的拟南芥幼苗，请按照文本方案中详细说明准备 7 天龄的样品植物。然后，将它们转移到新的半强度 MS 培养基板中心的矩形中，以提高轰击效率。

在转移和放置植物到盘子上时，请注意避免重叠植物。在植物或组织表面加入几滴半强度的 MS 液体培养基，以保持水分并防止在其余步骤中植物干燥。要用质粒 DNA 包被金颗粒，首先将金微载体溶液彻底涡旋 3 分钟。

现在，将 25 微升金颗粒加入新的 1.5 毫升试管中，涡旋 10 秒。每升亚精胺加入 10 微升 25.46 毫克，涡旋 10 秒。接下来，每微升质粒 DNA 加入 5 微升 1 微克，涡旋 3 分钟。

最后，每升加入 25 微升 277.5 毫克氯化钙溶液，涡旋 1 分钟。使用台式离心机以最大速度旋转金微载体 5 秒钟。离心后，小心地将其从上清液中挤出，不要干扰沉淀。

接下来，用 200 微升无水乙醇洗涤沉淀，然后涡旋 5 到 10 秒重新悬浮沉淀。获得后，以最大速度将金微载体旋转 5 秒钟，然后去除乙醇。将金颗粒重新悬浮在 18 微升无水乙醇中。

然后，将 6 微升颗粒悬浮液分装到三个微载体的中间，让它们风干。要通过粒子轰击将 DNA 转移到细胞和植物中，首先按照文本协议中的详细说明设置粒子递送系统。然后，在三个不同的位置轰击农用培养基板上的细胞或植物 3 次。

观察荧光信号之前，将受轰击的细胞和植物在植物生长室中避光 6 至 72 小时。将植物生长室设置为黑暗 24 小时和 22 摄氏度。将幼年植物或悬浮细胞转移到常规载玻片上，轻轻地将盖玻片放在顶部，以便通过标准共聚焦激光扫描显微镜进行成像。

使用文本协议中列出的设置，在 485 纳米处激发 GFP 标记的蛋白质，并在 525 纳米处检测荧光。对于 RFP 标记的蛋白质，在 585 纳米处激发，在 608 纳米处检测。最后，如文本协议中所述，计算荧光信号的共定位比。

拟南芥 VSR-2 和拟南芥 SCAMP4 在烟草 BY-2 细胞中的共表达是通过粒子轰击实现的，并显示正确的定位。RFP 拟南芥 VSR-2 呈点状模式，这与拟南芥 SCAMP4-GFP 的质膜定位不同，带有一些胞质点状点状点。此外，通过农杆菌介导的转化产生共表达拟南芥 SCAMP4-GFP 和 RFP 拟南芥 VSR-2 的拟南芥转基因植物。

显示了在根和根毛细胞中共表达两种嵌合蛋白的亚细胞定位。与以前的研究一致，转基因拟南芥的处理导致 RFP 拟南芥 VSR-2 标记的假阳区室，形成一个小的环状结构。而用前折叠蛋白 A 诱导的拟南芥 SCAMP GFP 标记了反式金 G 网络聚集。

作为阴性对照，通过应用相同的图像收集设置，在烟草 BY-2 细胞和拟南芥根和根毛细胞中观察到很少的自发荧光信号。这种方法可以深入了解蛋白质的亚细胞定位。它也可以应用于蛋白质方向的研究。

开发后，这项技术为植物细胞生物学领域的研究人员铺平了道路。方便地输出活植物细胞中蛋白质的亚细胞定位和空间相互作用。按照此程序，可以执行其他方法，如 PET 介导的转化和遗传杂交，以回答其他问题，例如如何在植物中共表达几种融合蛋白。

不要忘记，使用轰炸工作可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如护目镜。