保存睾丸生殖细胞三维染色质结构的制片方法

这种三维载玻片制备方法可保留细胞的三维染色质结构，已在小鼠睾丸生殖细胞中得到验证。首先，对曲细精管进行通透处理，以去除细胞质成分并提高染色试剂（如抗体和FISH探针）的可及性。固定细胞核材料后，使用镊子机械解离生殖细胞，并将样本滴加至载玻片上。

接下来，当对三维切片样本进行战略性应用时，需获取多个Z轴层面的数据，以完整覆盖细胞核的三维结构。利用COT技术，一种RNA FISH方法可显示细胞核内的新生RNA，从而检测细胞核中转录活跃的区域。我在麻省总医院基因实验室工作期间开发了该方法。

当时，我优化了用于棉花RNA荧光原位杂交（fluorescent in situ hybridization，简称FISH）以检测新生RNA的载玻片制备方法。棉花探针可与内含子及转座序列（tls）中的重复序列杂交，从而可视化活跃转录位点。棉花RNA FISH需要保持细胞核内RNA分布的完整性。

该右侧制备方法的关键在于，透化步骤必须在固定步骤之前进行。为了去除细胞质背景，将破裂的睾丸中的曲细精管在冰上用 PBS 分离，然后将数段长度为 5 至 10 毫米的曲细精管转移至含有 0.5% Triton X-100 的 500 微升 CSK 缓冲液中，在冰上孵育 6 分钟。随后，将所有曲细精管转移至四孔板中一个孔内的 4% PFA-PBS 溶液中，在室温下孵育 10 分钟。

接下来，在室温下将所有小管在 PBS 中孵育五分钟。孵育期间，在玻璃载玻片背面安装好细胞离心涂片装置和细胞离心涂片室，将所有小管转移至 30 µL PBS 中。然后用两把镊子的尖端将小管撕成碎片。

用两把镊子的尖端夹住小管，水平方向剪切小管。加入30 µL PBS后，通过移液混匀悬浮液，然后将其转移至微量离心管中，并加入PBS至总体积为1.3 mL。现在将100 µL悬浮液分别加入每个细胞离心涂片仪腔室中。Cyto。

在室温下以2000 RPM转速离心样品10分钟。使用含有PBS的共聚焦染色缸，在室温下将载玻片在实验台上干燥几分钟。在室温下洗涤载玻片5分钟。

然后将载玻片转移至70%乙醇中，至少孵育两分钟。在20微升反应体系中加入100纳克捕获的1D NA探针、20毫摩尔的核糖核苷酸钒酸盐复合物以及杂交缓冲液。使用PCR仪，在80摄氏度孵育10分钟，随后进行预退火。

在42摄氏度下静置，直至准备使用。随后依次将载玻片在80%乙醇中脱水两分钟，再在100%乙醇中脱水两分钟。在室温下于实验台上将载玻片完全晾干。

现在将载玻片置于42摄氏度的尖端盒室中。接着，短暂离心预热的探针，并直接用移液器将其加到脱水的载玻片上。轻轻盖上盖玻片，于42摄氏度下进行至少六小时的杂交步骤。

将 Coplan 瓶中的洗涤液置于水浴中，使用刀片在 42 摄氏度下预热 30 分钟，从载玻片边缘小心移除盖玻片，避免刮伤样本，随后将载玻片依次浸入洗涤液中，每瓶浸泡五分钟。首先放入第一瓶 Coplan 瓶（含 2×SSC 和 50% 甲酰胺），接着放入第二瓶 Coplan 瓶（含 2×SSC 和 50% 甲酰胺），最后放入两个含 2×SSC 的 Coplan 瓶中。

然后向样本中加入 20 µL DPI 封片剂，并盖上盖玻片。轻轻按压盖玻片，并用擦拭纸吸去多余的封片剂。本实验采用了一种 RNA FISH 技术，可同时检测新生转录产物以及定位于 XY 小体的蛋白质的免疫组织化学染色。

在此PACU中，精母细胞检测到异染色质蛋白CCB X1以及组蛋白变体H2A X的磷酸化形式位于XY小体上。经低渗溶液处理的表面铺展样本中，所得到的FISH结果显示信号在常染色质区域聚集。三维染色质结构被破坏，所有减数分裂染色体轴均可在单个Z平面内被捕获。

然而，3D 载玻片制备方法可在后续操作中保持完整的染色质结构。这种正确的制备方法适用于免疫荧光、DNA 和 RNA FISH 检测，以及这些检测方法的联合使用。