Méthodes à découvrir Alternative Utilisation de promoteur et la régulation transcriptionnelle de Murine BCRP1

L’objectif global de cet ensemble de protocoles est de détecter des premiers exons alternatifs dans l’ARNm d’un gène tel que Bcrp1 et d’établir des tests rapporteurs basés sur la luciférase pour les promoteurs présumés en amont des premiers exons alternatifs identifiés. Les méthodes in-silico utilisées peuvent aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la transcription et de la régulation, telles que la façon dont l’expression de l’ARNm est contrôlée dans différents tissus. Le principal avantage de cette technique est qu’elle utilise des données génétiques accessibles au public pour identifier les premiers exons alternatifs dans l’ARNm du gène d’intérêt, ce qui implique l’utilisation d’un promoteur alternatif.

Cette méthode, qui prépare, produit un rapport, construit et effectue des essais de rapport, peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la régulation des gènes, telles que l’activité fonctionnelle d’un promoteur alternatif putatif. Pour commencer cette procédure, obtenez la séquence de l’exon 2 Bcrp1 de la souris en saisissant l’ID de la séquence de référence de l’ARNm dans la fenêtre de recherche du navigateur de génome Ensembl et cliquez sur OK.Ensuite, sélectionnez une séquence complète contenant 16 exons. Cliquez sur l’option Télécharger la séquence.

Ensuite, choisissez le format FASTA et cliquez sur Aperçu. Dans l’écran suivant, copiez la séquence de prévisualisation de l’exon 2 dans le presse-papiers. Naviguez vers la page d’accueil de l’explosion sur le site Web du NCBI.

Sélectionnez Génome de la souris. Collez la séquence de l’exon 2 du presse-papiers dans la boîte de requête. Après cela, sélectionnez ESTs dans la liste déroulante Base de données.

Optimisez-le pour les séquences très similaires, puis choisissez BLAST. Une fois l’exécution BLAST terminée, la page des résultats apparaît. Sous le sous-titre Descriptions de la page de résultats, sélectionnez Tout, puis Télécharger, puis FASTA dans la liste déroulante, puis choisissez Continuer.

Un fichier txt apparaîtra. Ouvrez et copiez l’intégralité du fichier dans le presse-papiers. Pour identifier l’emplacement de la séquence EST qui est de cinq premiers à l’exon 2 dans le gène Bcrp1, sur la page d’accueil de BLAST, sous le sous-titre BLAST spécialisé, sélectionnez Aligner deux séquences à l’aide de BLAST.

Collez le fichier texte du presse-papiers dans la zone de requête et entrez 372099104 dans la zone Séquence de sujet. Optimisez-le pour les séquences très similaires sous Sélection de programme et exécutez BLAST. Une fois que la fenêtre des résultats s’affiche, affichez les alignements sous forme graphique en cliquant sur Graphiques dans la fenêtre Alignements.

Utilisez les flèches droite et gauche et zoomez pour vous concentrer sur Bcrp1/ABCG2 et les alignements de séquence. Ensuite, enregistrez les alignements de séquence en sélectionnant Tout dans la zone Descriptions. Dans la liste déroulante Téléchargement, sélectionnez Table d’accès, puis cliquez sur Continuer.

Comme la position de l’extrémité cinq prime de l’exon 2 correspond au nucléotide 58, 655, 638 dans le contig du chromosome six, désignez-le comme plus un, puis calculez la position des séquences partielles de chaque cinq prime EST à 58, 655, 638. Une étape critique de cette procédure est la prédiction de plusieurs premiers exons. Les promoteurs alternatifs sont donc identifiés ici.

À l’aide de la séquence de E1U obtenue à partir de la base de données EST, désigner les cinq premiers nucléotides premiers de E1U comme étant plus un. Obtenir un clone arrière du chromosome six de souris qui contient la séquence du gène Bcrp1/ABCG2 et la séquence au moins 100 kilobases en amont du gène Bcrp1/ABCG2. Ensuite, identifiez un vecteur rapporteur approprié, tel que le plasmide rapporteur de la luciférase pGL3-Basic.

Déterminez les sites de clonage multiples dans le vecteur rapporteur. KpnI, SacI, MluI, NheI, SmaI, XhoI, BglII et HindIII sont les sites endonucléae de restriction dans le site de clonage multiple du vecteur pGL3-Basic dans l’orientation cinq premiers à trois premiers. Ensuite, sélectionnez la région de deux kilobases en amont de l’exon E1U et collez la séquence dans l’ADN5, puis lancez le programme.

Les détails des sites de digestion unique et multiple seront affichés. Ensuite, comparez la liste des sites de digestion sur la région E1U avec le MCS sur le vecteur pGL3-Basic dans une feuille Excel. Par la suite, préparez des amorces directes et inverses pour la PCR qui contiennent des sites endonucléay de restriction à l’aide de services commerciaux de synthèse d’amorces de gènes ou d’un logiciel de sélection d’amorces.

Sélectionnez une amorce directe située à environ deux kilobases en amont de la séquence E1U et une amorce inverse à l’intérieur de la séquence E1U. Ensuite, amplifiez la région génomique E1U à l’aide de ces amorces avec PCR 01 à un microgramme de Bak et PCR Master Mix contenant de la taq polymérase haute fidélité. Ensuite, vérifiez la longueur du produit de PCR amplifié en le comparant à une échelle d’ADN d’un kilobase à l’aide d’une électrophorèse sur gel d’agarose TAE à 0,8 %.

Ensuite, digérer le produit de PCR obtenu et le vecteur pGL3-Basic à l’aide d’endonucléases de restriction spécifiques aux sites de digestion de restriction introduites dans les amorces avant et arrière. Ensuite, vérifiez la digestion du produit PCR à l’aide de l’électrophorèse sur gel d’agarose. Coupez l’ADN du vecteur digéré et la bande PCR de deux kilobases du gel d’agarose.

Ensuite, extrayez l’ADN du vecteur digéré et la bande PCR de deux kilobases des tranches de gel à l’aide d’un kit commercial de gel SV et de systèmes de nettoyage PCR. Mesurer la concentration du produit PCR purifié et du vecteur purifié à l’aide de la spectrométrie UV. Par la suite, préparez la construction du rapporteur E1U en ligaturant le produit de PCR digéré par l’enzyme de restriction purifiée et le vecteur rapporteur de la luciférase pGL3-Basic Firefly à l’aide du kit de ligature rapide de l’ADN ligase T4, produisant ainsi la construction du rapporteur E1U nommée pGL3 E1U.

Dans cette étape, cultivez les cellules TM4 dans des plaques de 24 puits à une densité initiale de 200 000 cellules par puits. Six heures après avoir placé les cellules en culture, transfectez les cellules avec 0,2 microgramme de vecteur MP pGL3-Basic ou 0,2 microgramme de vecteur pGL3 avec quatre nanogrammes de pRL-TK comme contrôle interne. Trente heures après la transfection, retirez le milieu de croissance des cellules transfectées.

Lavez les cellules avec du PBS, puis retirez la solution de lavage. Après cela, mesurez l’activité de la luciférase et de la luciférase à l’aide d’un kit commercial. Exprimez l’activité de chaque tube comme le rapport entre l’activité de la luciférase des lucioles divisée par le contrôle interne.

Cette étape confirme l’activité fonctionnelle du promoteur spécifique du testicule. Voici le test rapporteur pour les promoteurs de Bcrp1 E1U, E1A, E1B et E1C dans les bulbes, ce sont des cellules TM4 totalement dérivées de cellules. Les données sont exprimées comme la luminescence de la luciférase normalisée à celle de la luciférase Renilla.

L’astérisque indique une différence significative par rapport à la lutte antivectorielle MP pGL3. Ce graphique montre les effets de la mutation de l’élément de réponse SF-1 dans la construction du rapporteur Bcrp1 E1U sur l’activité de la luciférase. Les constructions rapporteures de Bcrp1 avec une région de liaison SF-1 présumée ont été transfectées dans des cellules TM4 avec et sans l’expression forcée de SF-1.

Sur la figure, a indique une différence significative par rapport au vecteur vide témoin pGL3 ; b signifie une différence statistiquement significative par rapport à la construction du promoteur E1U dans les cellules transfectées du vecteur. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de sélectionner une lignée cellulaire appropriée pour le test du rapporteur. La lignée cellulaire doit exprimer le gène d’intérêt sous le contrôle du promoteur dans la construction rapporteure.

À la suite de cette procédure, d’autres méthodes, telles que la RT-PCR quantitative, peuvent être effectuées afin de faciliter l’évaluation de l’utilisation alternative du promoteur dans plusieurs échantillons de tissus. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de prédire l’utilisation d’un promoteur alternatif pour un gène d’intérêt et de déterminer la fonctionnalité de ce promoteur.