L'application d'un système d'expression inductible pour étudier les interférences de facteurs de virulence bactérienne avec signalisation intracellulaire

La méthode décrite ici est utilisée pour induire la cascade de signalisation apoptotique à des étapes définies afin de disséquer l’activité d’une protéine effectrice bactérienne anti-apoptotique. Cette méthode peut également être utilisée pour l’expression inductible de protéines pro-apoptotiques ou toxiques, ou pour disséquer l’interférence avec d’autres voies de signalisation.

L’objectif général de l’expérience suivante est d’étudier l’interférence des facteurs de virulence bactérienne avec la signalisation intracellulaire. Ceci est réalisé en établissant des lignées cellulaires stables, exprimant la protéine d’intérêt Pour étudier son activité au niveau des cellules en vrac dans un deuxième temps, un système de vecteurs d’expression inductible est créé, qui permet d’activer une cascade de signalisation de la cellule hôte à une étape définie. Ensuite, il sera analysé si la protéine d’intérêt peut interférer avec l’activation de la cascade de signalisation de la cellule hôte afin de réduire le point d’activité de la protéine d’intérêt, les résultats montrent que le facteur de virulence de Burnett jaune confortable KA B interfère avec la cascade apoptotique en aval des dos et en amont de l’activation de la cascade trois sur la base de l’analyse par western blot.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie infectieuse, telles que l’identification de l’étape clé d’une cascade de transduction de signal à laquelle une protéine effectrice bactérienne donnée interfère. Cela nous aidera non seulement à mieux comprendre comment les micro-organismes pathogènes manipulent leurs hôtes, mais aussi comment fonctionnent ces processus cellulaires de base. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu des stratégies bactériennes pour empêcher la mort cellulaire apoptotique de se produire, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes de transduction de signaux dans le domaine de la mort cellulaire, tels que l’ons ou la pyroptose, ou également aux réseaux de signalisation impliqués dans la prolifération cellulaire, la régulation des gènes ou les réactions du système immunitaire.

La démonstration de cette procédure sera Stephanie Besler, une étudiante diplômée du laboratoire de Mann. Commencez cette procédure en ensemencant des cellules HEK 2 93 exprimant de manière stable la GFP ou la GFP, disons B dans un 12. Plaque de puits à une densité de 100 000 cellules par puits.

Ensuite, préparez séparément le réactif de transfection de l’ADN et du polyéthylène dans 75 microlitres de milieu opt, et incubez pendant cinq minutes à température ambiante pour la formation du complexe. Incuber les deux mélanges ensemble pendant 15 minutes à température ambiante. Après cela, ajoutez la solution d’ADN de polyéthylène goutte à goutte aux cellules et incubez à 37 degrés Celsius dans 5 % de dioxyde de carbone.

Cinq heures après la transfection, induire l’expression des protéines pro-apoptotiques en ajoutant un microgramme par millilitre de doxycycline au milieu de culture. Ensuite, incubez les cellules pendant 18 heures à 37 degrés Celsius dans 5 % de dioxyde de carbone sous microscope optique. Inspectez les cellules pour détecter l’induction de la mort cellulaire avant la récolte.

Examinez les cellules apoptotiques induites, qui sont détectables par la présence de corps apoptotiques. Ensuite, retirez le surnageant et lavez les cellules collées. Une fois avec du PBS chaud, remettez les cellules en suspension dans 100 microlitres de deux tampons d’échantillon x lamby.

Ensuite, chauffez pendant cinq minutes à 95 degrés Celsius et pour une utilisation ultérieure, conservez à moins 20 degrés Celsius par la suite. Après cela, chargez six microlitres d’une échelle de protéines commerciale comme marqueur de poids moléculaire. Chargez ensuite environ 40 000 cellules par échantillon sur un gel de page à 12 % de SDS.

Faites fonctionner les gels dans un système d’électrophorèse sur gel sous une tension constante de 180 volts pendant 45 à 60 minutes avec un tampon de fonctionnement x laly. Ensuite, BLO les protéines sur des membranes PVDF à une tension constante de 16 volts pendant 60 minutes. À l’aide d’une cellule de transfert semi-sèche SD trans blot, bloquez ensuite les membranes dans 10 millilitres de MPT pendant une heure à température ambiante.

Diluez sept microlitres d’anticorps PARP anti-clivage dans sept millilitres de MPT. Incuber la membrane PVDF avec la solution d’anticorps pendant une nuit à quatre degrés Celsius. Retirez la solution d’anticorps et effectuez trois lavages de 10 minutes avec du PBS 0,05 % Tween 20, incubez les membranes avec 1,4 microlitres d’anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de raifort dilués dans sept millilitres de MPT pendant une heure à température ambiante après l’incubation.

Laver les membranes trois fois avec du PBS 0,05 % Tween 20, détecter l’activité de la peroxydase de raifort avec un kit commercial selon le protocole du fabricant. Et appliquez un équipement standard pour le développement de films afin de visualiser les bandes de protéines. Ensuite, éliminez les anticorps liés en incubant les membranes avec sept millilitres de tampon de stripping Western Blot pendant 30 minutes à température ambiante après trois lavages avec du PBS 0,05 % Tween 20, sondez les membranes avec quatre microlitres d’anticorps anti-actine dans quatre millilitres de MPT pendant la nuit à quatre degrés Celsius.

Le lendemain, effectuez trois étapes de lavage de 10 minutes sur les membranes avec environ 10 millilitres de PBS 0,05 % Tween 20, puis incubez les membranes avec 1,4 microlitres d’anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de raifort dilués dans sept millilitres de MPT Après une heure d’incubation à température ambiante. Lavez les membranes trois fois avec du PBS 0,05 % Tween 20, détectez l’activité de la peroxydase de raifort avec un kit commercial et appliquez un équipement standard pour le développement de films afin de visualiser les interdictions de protéines. Dans cette expérience, des lysats de cellules entières de cellules SABE HEK 2 93 GFP et HEK 2 93 GFP ont été immuno-sanguins pour que la GFP présente une expression stable.

L’analyse par cytométrie en flux représentative des cellules sabe HEK 2 93 GFP et HEK 2 93 GFP montre l’intensité de l’expression de la GFP. Les cellules sabe HEK 2 93 GFP et HEK 2 93 GFP ont été traitées avec quatre micromolaires pendant six heures pour induire l’apoptose intrinsèque. L’apoptose a été analysée par immuno-blot PARP clivé, dans laquelle on a constaté que le clivage de PARP diminuait dans les cellules B SA HK 2 9 3 GFP par rapport aux cellules GFP HK 2 93

CB protège de l’apoptose induite par la bax, mais pas de l’apoptose induite par la caspase trois. Lors de la mise en œuvre de cette procédure, il est important de sonder autant de composants que possible de la voie de signalisation pour aider à identifier l’étape d’interaction. Il est également bon de tester les protéines qui sont activées à la fois dans leurs états fondamental et activé pour déterminer si la protéine effectrice choisie interfère avec la voie elle-même, ou plutôt avec l’étape d’activation suivant cette procédure.

D’autres méthodes telles que l’inactivation, l’inactivation de la levure, la suppression de deux hybrides, la modification post-traductionnelle ou les tests de stabilité protéolytique peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires telles que : quels sont les mécanismes moléculaires exacts que ces effecteurs microbiens utilisent pour manipuler la physiologie normale de la cellule hôte ? Et comment cela profite-t-il à la survie et à la dissémination des agents pathogènes ?