L'application d'un système d'expression inductible pour étudier les interférences de facteurs de virulence bactérienne avec signalisation intracellulaire

L'objectif général de l'expérience suivante est d'étudier l'interférence des facteurs de virulence bactériens avec la signalisation intracellulaire. Cela est réalisé en établissant des lignées cellulaires stables exprimant la protéine d'intérêt afin d'étudier son activité au niveau global de la population cellulaire. Dans un deuxième temps, un système de vecteur d'expression inductible est mis en place, permettant d'activer une cascade de signalisation de la cellule hôte à une étape définie. Ensuite, on analysera si la protéine d'intérêt peut interférer avec l'activation de la cascade de signalisation de la cellule hôte afin de préciser le point d'action de cette protéine. Les résultats montrent que le facteur de virulence Cozy Yellow Burnett KAB interfère avec la cascade apoptotique en aval de Backs et en amont de l'activation de Cascade trois, selon une analyse par immunotransfert (western blotting).

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie des infections, comme l'identification de l'étape déterminante dans une cascade de transduction du signal à laquelle une protéine effectrice bactérienne donnée interfère. Cela nous aidera non seulement à mieux comprendre comment les micro-organismes pathogènes manipulent leurs hôtes, mais aussi le fonctionnement de ces processus cellulaires fondamentaux. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur les stratégies bactériennes visant à empêcher la mort cellulaire apoptotique, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes de transduction du signal dans le domaine de la mort cellulaire, tels que la necroptose ou la pyroptose, ou encore à des réseaux de signalisation impliqués dans la prolifération cellulaire, la régulation génique ou les réponses du système immunitaire.

Stephanie Besler, étudiante diplômante du laboratoire de Mann, démontrera cette procédure. Commencez cette procédure en semant des cellules HEK 293 exprimant de façon stable GFP ou GFP, par exemple B, dans une plaque de 12 puits à une densité de 100 000 cellules par puits.

Ensuite, préparez séparément l'ADN et le réactif de transfection au polyéthylène dans 75 microlitres de milieu opt, puis incubez pendant cinq minutes à température ambiante pour permettre la formation de complexes. Incubez les deux mélanges ensemble pendant 15 minutes à température ambiante. Ensuite, ajoutez la solution d'ADN au polyéthylène goutte à goutte aux cellules et incubez à 37 degrés Celsius dans une atmosphère contenant 5 % de dioxyde de carbone.

Cinq heures après la transfection, induire l'expression des protéines pro-apoptotiques en ajoutant un microgramme par millilitre de doxycycline au milieu de culture. Incuber ensuite les cellules pendant 18 heures à 37 degrés Celsius dans une atmosphère contenant 5 % de dioxyde de carbone, en utilisant un microscope optique. Examiner les cellules pour vérifier l'induction de la mort cellulaire avant la récolte.

Examinez les cellules apoptotiques induites, qui sont détectables par la présence de corps apoptotiques. Ensuite, retirez le surnageant et lavez les cellules adhérentes. Resuspendez les cellules une fois dans 100 microlitres de tampon d'échantillonnage deux x lamby préchauffé au bain-marie.

Ensuite, chauffer pendant cinq minutes à 95 degrés Celsius et, pour une utilisation ultérieure, conserver à moins 20 degrés Celsius par la suite. Après cela, charger six microlitres d'un marqueur de poids moléculaire (échelle protéique commerciale). Puis charger environ 40 000 cellules par échantillon sur un gel SDS-PAGE à 12 %.

Faites migrer les gels dans un système d'électrophorèse sur gel sous une tension constante de 180 volts pendant 45 à 60 minutes avec un tampon de migration x 1. Ensuite, transférez les protéines sur des membranes en PVDF à une tension constante de 16 volts pendant 60 minutes. À l’aide d’une cellule de transfert semi-sec Trans Blot SD, bloquez ensuite les membranes dans 10 millilitres de MPT pendant une heure à température ambiante.

Diluez sept microlitres d'anticorps anti-PARP clivé dans sept millilitres de MPT. Incubez la membrane en PVDF avec la solution d'anticorps toute la nuit à quatre degrés Celsius. Éliminez la solution d'anticorps et effectuez trois lavages de 10 minutes chacun avec du PBS contenant 0,05 % de Tween 20. Après l'incubation, incubez les membranes avec 1,4 microlitre d'anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de raifort, dilués dans sept millilitres de MPT, pendant une heure à température ambiante.

Lavez les membranes trois fois avec du PBS contenant 0,05 % de Tween 20, révélez l'activité de la peroxydase de raifort à l'aide d'un kit commercial selon le protocole du fabricant. Utilisez un équipement standard pour le développement de film afin de visualiser les bandes protéiques. Ensuite, éliminez les anticorps liés en incubant les membranes avec sept millilitres de tampon de décapage pour immunotransfert pendant 30 minutes à température ambiante après trois lavages avec du PBS contenant 0,05 % de Tween 20, puis sondez les membranes avec quatre microlitres d'anticorps anti-actine dans quatre millilitres de MPT toute la nuit à quatre degrés Celsius.

Le lendemain, effectuer trois étapes de lavage de 10 minutes chacune sur les membranes avec environ 10 millilitres de PBS contenant 0,05 % de Tween 20, puis incuber les membranes avec 1,4 microlitre d'anticorps secondaires marqués à la peroxydase de raifort, dilués dans sept millilitres de MPT, pendant une heure à température ambiante. Laver les membranes trois fois avec du PBS contenant 0,05 % de Tween 20, révéler l'activité de la peroxydase de raifort à l'aide d'un kit commercial et utiliser un équipement standard de développement de film pour visualiser les bandes protéiques. Dans cette expérience, des lysats totaux de cellules HEK 2 93 GFP et de cellules HEK 2 93 GFP sabe ont été immunodétections pour la GFP afin de montrer une expression stable.

L'analyse représentative par cytométrie en flux des cellules HEK 293 GFP et HEK 293 GFP sabe montre l'intensité de l'expression de la GFP. Les cellules HEK 293 GFP et HEK 293 GFP sabe ont été traitées avec quatre micromoles de sporine pendant six heures afin d'induire l'apoptose intrinsèque. L'apoptose a été analysée par immunotransfert détectant la PARP clivée, révélant une diminution du clivage de la PARP dans les cellules HK 293 GFP SA B par rapport aux cellules HK 293 GFP.

CB protège contre l'apoptose induite par Bax, mais pas contre l'apoptose induite par la caspase 3. Lors de la mise en œuvre de cette procédure, il est important d'analyser un nombre aussi élevé que possible de composants de la voie de signalisation afin d'identifier l'étape d'interaction. Il est également conseillé de tester des protéines activées à la fois dans leurs états basal et activé pour déterminer si la protéine effectrice choisie interfère avec la voie elle-même ou plutôt avec l'étape d'activation suivant cette procédure.

D'autres méthodes, telles que l'extinction génique, la délétion génique, le système de double hybride chez la levure, la précipitation d'hybrides, l'analyse des modifications post-traductionnelles ou les essais de stabilité protéolytique, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme : quels sont les mécanismes moléculaires exacts que ces effecteurs microbiens utilisent pour modifier la physiologie normale des cellules hôtes ? Et comment cela favorise-t-il la survie et la dissémination du pathogène ?