小鼠后肢长骨解剖与骨髓分离

本长骨解剖及骨髓分离操作的总体目标是快速、系统地取出长骨，并收集骨髓用于后续分析。该方法有助于解答与骨髓生物学、癌症转移及免疫学相关的关键科学问题。本技术的主要优势在于解剖过程快速且标准化，骨髓分离操作相对无菌。首先将小鼠置于仰卧位。

然后将踝关节下方的四个脚掌垫固定住，并用70%乙醇喷洒小鼠，彻底浸湿腿部。接着，在下腹部中线右侧、髋部稍上方做一个小切口，将切口沿腿部向下延伸，越过踝关节。将皮肤向后拉开。

然后剪断附着在股骨近端的股四头肌，以暴露股骨的前面，并将大头针以与解剖板成45度角的方向插入，将肌肉从腿部固定展开。将剪刀紧贴股骨的后面，剪断附着在膝关节处的腘绳肌。然后向后牵拉附着在股骨近端的皮肤和腘绳肌，以暴露股骨的后面，并用大头针以45度角将腘绳肌从腿部固定展开。

用镊子夹住股骨远端膝关节上方的位置。然后将剪刀刀片沿股骨干两侧向髋关节方向引导。到达股骨头后，扭转剪刀，使上刀片正对股骨头，从而脱位股骨。

现在用镊子夹住股骨干上端，剪除股骨头周围的软组织，使股骨从髋臼中分离。然后将整条腿骨（包括股骨、膝关节和胫骨）向上并远离身体方向牵拉，仔细剪除连接腿部与皮肤的结缔组织和肌肉。当所有结缔组织均被去除后，过度伸展踝关节，并如前所示旋转剪刀，使胫骨脱位。

抓住胫骨远端，注意不要切断肌腱，将胫骨从身体和固定板方向向上拉离。随后去除附着在膝关节处长骨上的残留结缔组织，以及附着在股骨和胫骨上的多余肌肉或结缔组织。为准备进行骨髓分离，用手握住股骨，使髌骨朝向远离操作者的方向，股骨头朝下。

伸展膝关节并扭转剪刀，使胫骨与股骨脱位。随后去除连接股骨与胫骨之间的任何结缔组织。接着，握住股骨，使前面朝向远离操作者的方向，股骨头朝下，将剪刀沿股骨干向上引导至髁部。

轻轻来回旋转剪刀，以去除髁突、髌骨和骨骺，暴露干骺端。然后使用镊子、剪刀和擦镜纸清除附着在股骨上的任何多余肌肉或结缔组织。接着，用镊子夹住胫骨，使前面朝外、踝端朝下。

若胫骨骨骺完整，将剪刀沿胫骨干向上引导至髁部，并轻轻来回旋转剪刀以去除髁部和骨骺，暴露胫骨干骺端。随后去除附着在胫骨上的其他肌肉或结缔组织，操作方法如前所述。为采集骨髓，首先将18号针头穿过0.5毫升微量离心管底部。

然后将长骨放入离心管中，膝端朝下，并盖紧管盖。将0.5毫升微量离心管插入1.5毫升微量离心管中，在微量离心机中以不低于10,000 ×g的转速离心15秒。通过肉眼观察确认骨髓已从骨组织中完全离出。

骨骼应呈现白色，且在较大的管中可见大量沉淀物。随后将0.5毫升微量离心管中的骨骼弃去，并将骨髓悬浮于适当的溶液中，用于后续所需的分析。这种快速解剖技术适用于多种后续分析，包括组织形态计量学和组织学。

事实上，如该代表性组织形态计量学显微CT三维重建所示，松质骨和皮质骨壳均得到良好保存，从而能够对骨组织形态计量学的标准结构参数进行准确定量分析。在此张代表性组织学切片中，胫骨经福尔马林固定、脱钙并进行H&E染色，可见钙化骨组织及细胞骨髓结构的完整性均得以保持，适用于组织学分析。此外，通过本方法分离获得的骨髓可用于多种后续实验应用，包括破骨细胞或成骨细胞的原代细胞培养。

一旦掌握，该技术从长骨解剖到骨髓分离可在约七分钟内完成，前提是操作得当。在进行该操作时，重要的是要记住将小鼠摆放在便于解剖的位置。在完成该步骤后，可进一步采用其他方法，如流式细胞术（FACS）或其他单细胞处理技术，以探究骨髓细胞群体变化相关的更多问题。

观看本视频后，您应该能够很好地掌握如何快速解剖小鼠的长骨，并通过离心法分离骨髓。