Name: 鼠后肢长骨解剖和骨髓隔离 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: 学习小鼠后肢长骨解剖和骨髓分离技术，通过离心法快速获取骨髓样本。该方法约七分钟即可完成，适用于骨髓生物学、癌症转移和免疫学研究的下游分析。

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本研究由美国国家癌症研究所（NCI）资助，资助编号为 U54CA143803、CA163124、CA093900 和 CA143055，授予 K.J.P.。作者感谢 Weilbaecher 实验室现任及前任成员，特别是 Katherine Weilbaecher、Michelle Hurchla 和 Hongju Deng，以及 Brady 泌尿外科研究所的成员，尤其是 Pienta 实验室成员，对本文手稿的审阅提出了宝贵意见。

所有动物实验均经机构动物护理和使用委员会批准，符合美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》中所述的建议。
1. 后肢长骨解剖
<ol>
	<li>根据机构指南对小鼠实施安乐死。</li>
	<li>将小鼠置于仰卧位，通过踝关节以下的足垫用针固定四肢。</li>
	<li>用70%乙醇喷洒小鼠，彻底浸湿腿部。</li>
	<li>在下腹部中线右侧、髋部上方稍作切口。</li>
	<li>沿腿部向下延伸切口，并越过踝关节。</li>
	<li>向后拉开皮肤，剪开附着在股骨近端的股四头肌，以暴露股骨前侧，并将腿固定在板上，插针时使针与板呈45度角。</li>
	<li>将剪刀的刀刃贴住股骨后侧，从膝关节处剪断腘绳肌。</li>
	<li>向后牵拉皮肤和附着于股骨近端的腘绳肌，以暴露股骨后侧，并将腿部固定于解剖板上，以与板面成45度角插入固定针。</li>
	<li>用镊子夹住股骨远端，位置在膝关节上方。将剪刀刀片沿股骨干两侧向髋关节方向剪开，注意不要剪到股骨本身。</li>
	<li>到达股骨头时，剪刀会略微张开，此时应旋转剪刀，使剪刀的上刃直接越过股骨头，以使股骨脱位，注意避免在股骨头下方折断骨骼。</li>
	<li>用镊子夹住股骨干上端，切断股骨头周围的软组织，使其从髋臼中分离。</li>
	<li>将整条腿骨（包括股骨、膝关节和胫骨）从身体上拉起并移开，小心切断连接腿部与皮肤的结缔组织和肌肉。</li>
	<li>过度背屈踝关节，再次使用剪刀以扭转动作使胫骨脱位。</li>
	<li>握住胫骨远端，注意不要切断肌腱，将胫骨向上并远离身体和插针板拉起。</li>
	<li>在膝关节处切断将长骨与小鼠相连的剩余结缔组织。</li>
	<li>去除附着在股骨和胫骨上的多余肌肉或结缔组织。</li>
	<li>对于任何需要保持骨骼完整性的应用（组织学、组织形态计量学、生物力学测试， 等等。），按照标准的实验室内部方案进行（如 4-7）。为分离骨髓，请进入第2节。</li>
</ol>
2. 骨髓分离用长骨的制备
<ol>
	<li>用镊子夹住股骨，使髌骨朝外，近端（股骨头）朝下。</li>
	<li>过度伸展膝关节，并用剪刀以扭转动作使胫骨与股骨脱位。</li>
	<li>剪断连接股骨和胫骨的任何结缔组织。</li>
	<li>用镊子夹住股骨，使前面朝外，近端（股骨头端）朝下。</li>
	<li>将剪刀沿股骨干向上引导至髁部。</li>
	<li>轻轻来回旋转剪刀，去除髁、髌骨及骨骺，以暴露干骺端。</li>
	<li>使用镊子、剪刀和Kimwipes去除附着在股骨上的其他肌肉或结缔组织。</li>
	<li>用镊子夹住胫骨，使前面朝外，远端（踝端）朝下。</li>
	<li>若胫骨骨骺完整，将剪刀沿胫骨干向上引导至髁部。</li>
	<li>轻轻来回旋转剪刀，去除髁和骨骺，以暴露干骺端。</li>
	<li>使用镊子、剪刀和Kimwipes去除附着在胫骨上的其他肌肉或结缔组织。</li>
</ol>
3. 骨髓分离
<ol>
	<li>将一根18 G针头从0.5 ml&#160;微量离心管底部穿入。</li>
	<li>将长骨（最多2根股骨和2根胫骨）放入管中，膝端朝下，盖上管盖。</li>
	<li>将装有骨骼的0.5 ml微量离心管插入1.5 ml微量离心管中。</li>
	<li>将嵌套的双层管在微量离心机中以≥10,000 × g离心15秒。</li>
	<li>通过肉眼观察确认骨髓是否已从骨骼中甩出。骨骼应呈现白色，且外层大管中应可见明显的沉淀物。</li>
	<li>丢弃含有骨骼的0.5 ml微量离心管。</li>
	<li>将骨髓沉淀重悬于适当的溶液（例如，PBS、培养基、FACS缓冲液）中，并根据实验方案进行后续操作（DNA、RNA或蛋白质提取、FACS分析或原代细胞培养）。</li>
</ol>

<ol><li>McHayleh, W. M., Ellerman, J., Roodman, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ch.+80%5BTitle%5D)+AND+%22Primer+on+the+Metabolic+Bone+Diseases+and+Disorders+of+Mineral+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Ch. 80.</a> Primer on the Metabolic Bone Diseases and Disorders of Mineral Metabolism. , American Socieyt for Bone and Mineral Research. 379-381 (2008).</li>
<li>Weilbaecher, K. N., Guise, T. A., McCauley, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+to+bone%3A+a+fatal+attraction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cancer to bone: a fatal attraction.</a> Nat Rev Cancer. 11 (6), 411-425 (2011).</li>
<li>Pedersen, E. A., Shiozawa, Y., Pienta, K. J., Taichman, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prostate+cancer+bone+marrow+niche%3A+more+than+just+%27fertile+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+J+Androl%22%5BJournal%5D)">The prostate cancer bone marrow niche: more than just 'fertile soil.</a> Asian J Androl. 14 (3), 423-427 (2012).</li>
<li>Amend, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombospondin-1+regulates+bone+homeostasis+through+effects+on+bone+matrix+integrity+and+nitric+oxide+signaling+in+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Thrombospondin-1 regulates bone homeostasis through effects on bone matrix integrity and nitric oxide signaling in osteoclasts.</a> J Bone Miner Res. 30 (1), 106-115 (2015).</li>
<li>Hurchla, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epoxyketone-based+proteasome+inhibitors+carfilzomib+and+orally+bioavailable+oprozomib+have+anti-resorptive+and+bone-anabolic+activity+in+addition+to+anti-myeloma+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">The epoxyketone-based proteasome inhibitors carfilzomib and orally bioavailable oprozomib have anti-resorptive and bone-anabolic activity in addition to anti-myeloma effects.</a> Leukemia. 27 (2), 430-440 (2013).</li>
<li>Rauch, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ARF+tumor+suppressor+regulates+bone+remodeling+and+osteosarcoma+development+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The ARF tumor suppressor regulates bone remodeling and osteosarcoma development in mice.</a> PLoS One. 5 (12), e15755(2010).</li>
<li>Su, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ADP+receptor+P2RY12+regulates+osteoclast+function+and+pathologic+bone+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">The ADP receptor P2RY12 regulates osteoclast function and pathologic bone remodeling.</a> J Clin Invest. 122 (10), 3579-3592 (2012).</li>
<li>Dempster, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+nomenclature%2C+symbols%2C+and+units+for+bone+histomorphometry%3A+a+2012+update+of+the+report+of+the+ASBMR+Histomorphometry+Nomenclature+Committee%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Standardized nomenclature, symbols, and units for bone histomorphometry: a 2012 update of the report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee.</a> J Bone Miner Res. 28 (1), 2-17 (2013).</li>
<li>Begley, C. G., Ellis, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+development%3A+Raise+standards+for+preclinical+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Drug development: Raise standards for preclinical cancer research.</a> Nature. 483 (7391), 531-533 (2012).</li>
<li>Festing, M. F., Altman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+design+and+statistical+analysis+of+experiments+using+laboratory+animals%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the design and statistical analysis of experiments using laboratory animals.</a> ILAR J. 43 (4), 244-258 (2002).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们介绍一种简单且高效的小鼠后肢长骨去除及后续骨髓分离方法。该方法能够保持骨骼和骨髓的高度结构完整性和细胞完整性，且操作时间短，最大限度地降低了因操作导致的骨折或骨表面划伤，从而避免对下游分析造成影响。此外，采用离心法分离骨髓时无需切割骨骼以暴露骨髓腔，也无需冲洗液冲出骨髓，减少了潜在的污染环节。同时，该离心技术通量相对较高，操作时间少于其他方法，因而缩短了整体处理时间。
由于小鼠个体间表型变异较大，体内小鼠实验本身具有较高的变异性。为了最大限度地提升昂贵且耗时的小鼠实验的研究价值，至关重要的是尽量减少技术性实验误差9,10。从动物处死到后续分析或组织固定的耗时会引入实验变异，这种变异可能掩盖细微的变化，并削弱组间显著差异。因此，快速处理样本对于准确的数据分析至关重要。本文所述的长骨解剖和骨髓分离技术经过优化，可实现动物和样本的快速处理，从而降低技术变异。
该方案可广泛应用于多个研究领域，包括骨组织本身的研究或骨髓细胞的分析。此外，这种简单的长骨解剖方法将使相关领域的研究人员能够直接探究骨骼在其他尚未充分研究的病理条件下对骨髓功能障碍的贡献，从而拓展我们对该领域的认知。

长骨及其骨髓细胞的研究是众多科研领域的重要核心，包括但不限于骨骼生物学、癌症生物学、免疫学、血液学和生物力学。骨骼是一种高度动态的器官，与软骨共同构成骨骼系统，为身体提供抵抗负荷的机械支撑，并保护内脏器官。此外，骨骼中的矿物质成分可作为关键信号分子钙和磷以及其他因子的储存库1。最后，骨骼容纳骨髓，并与代谢活跃的成骨细胞和破骨细胞共同作用，形成维持造血细胞和淋巴细胞群体所必需的干细胞微环境。
许多疾病都会累及骨骼和骨髓，常导致骨髓功能障碍、严重骨痛以及病理性骨折。在多种实体瘤中，骨骼是转移的常见部位，尤其是乳腺癌和前列腺癌，其中肿瘤细胞直接与骨髓微环境相互作用，启动骨转移的恶性循环，并排挤造血干细胞2,3。包括骨髓瘤和白血病在内的造血系统恶性肿瘤，其特征也是骨髓功能障碍以及正常骨重建过程的失调1。其他非恶性骨骼疾病同样是当前研究的热点，例如骨关节炎、骨质疏松症、脊柱侧弯和佝偻病。即使在其他方面健康的人群中，骨骼的生物力学失效也会导致疼痛性骨折。上述所有疾病均为当前重点研究领域，旨在发现新的预防措施和治疗方案，以降低发病率和死亡率。
为了研究骨骼和骨髓在生理与病理条件下的多种功能，研究人员亟需一种简单、高效且标准化的小鼠长骨解剖方法，以便快速处理大量样本 体内 实验。此处概述的解剖方案适用于所有长骨分析，包括 离体 成像、组织学、组织形态计量学和强度测试等。同样，一种标准化的骨髓分离方法，具有较高的骨髓细胞回收率和较低的操作者间差异，对于荧光激活细胞分选（FACS）或定量PCR（qPCR）等实验分析，以及骨髓细胞原代培养等后续应用均至关重要。

<table><tbody><tr><td>样品板</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>固定针</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖剪&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖镊</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>吸水纸</td><td>金佰利公司</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>16 号针头</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 微量离心管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5 ml 微量离心管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>微量离心机</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠后肢长骨解剖与骨髓分离

Murine Hind Limb Long Bone Dissection and Bone Marrow Isolation

骨骼及骨髓的研究在基础骨骼生物学、免疫学、血液学、癌症转移、生物力学和干细胞生物学等多个研究领域中至关重要。然而，尽管骨骼在健康和疾病状态下均具有重要意义，但由于缺乏骨骼解剖和骨髓分离的专业知识，骨骼仍是一个研究相对不足的器官。小鼠是研究骨骼及骨髓影响的常用模式生物，因此需要一种标准化且高效的长骨解剖与骨髓分离方法，以处理大规模的实验样本。本文介绍了一种简便的解剖流程，用于完整取出股骨和胫骨，适用于包括但不限于组织形态学分析和力学强度测试在内的下游应用。此外，我们还概述了一种通过离心快速从长骨中分离骨 marrow 的方法，操作时间短，非常适合细胞分选、原代细胞培养或DNA、RNA及蛋白质提取。该方案经过优化，可实现样本的快速处理，以减少实验误差，并通过标准化操作最大限度地降低不同操作者之间的差异性。

本方案经过优化，可快速分离小鼠股骨和胫骨，并最大程度减少对骨组织的损伤。该技术适用于多种后续分析，包括生物力学研究、骨组织形态计量学（图1A - B）和组织学（图1C）4,7。代表性骨组织形态计量学微计算机断层扫描（microCT）三维重建图像（图1A - B）显示，松质骨和皮质骨壳均保持完整，从而能够准确量化标准化的骨结构参数，包括骨小梁数量、厚度和间距、骨体积以及皮质骨厚度等其他指标8。代表性组织学切片显示经苏木精-伊红（H&amp;E）染色的福尔马林固定并脱钙的胫骨（图1C），图像展示了矿化骨组织和细胞骨髓在组织学分析中的完整性。
骨髓分离操作可保持骨髓腔的无菌状态，操作步骤少，可降低污染风险，且无需切割长骨，从而减少骨髓收获量的损失。所获得的骨髓适用于多种后续实验，包括流式细胞术5和PCR分析。此外，该操作还可用于分离骨髓细胞以进行原代细胞培养，包括破骨细胞和成骨细胞（图2A - B）4,6。
<img alt="骨CT扫描与组织学图像；结构分析与细胞细节观察" src="/files/ftp_upload/53936/53936fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 小鼠长骨的组织形态学与组织学分析 小鼠胫骨的三维微计算机断层扫描重建图像显示（A外皮质壳和（B）小梁骨（比例尺 = 0.5 mm）。（C）组织学H&amp;脱钙并切片的胫骨伊红染色（4×）。图片由美国华盛顿大学医学院 Katherine Weilbaecher 提供。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53936/53936fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="组织学切片和细胞培养分析、显微镜图像、组织形态、样本研究。" src="/files/ftp_upload/53936/53936fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 用于破骨细胞和成骨细胞分化的原代骨髓细胞培养。 （A）在破骨诱导培养基中培养 7 天后，对多核破骨细胞进行 TRAP 染色（4×）。（B）在成骨诱导培养基中培养 21 天后，成骨细胞的碱性磷酸酶染色（紫色）及矿化结节的茜素红染色（红色）。图片由美国华盛顿大学医学院 Katherine Weilbaecher 提供。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53936/53936fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文介绍了一种从小鼠后肢长骨（股骨和胫骨）中进行解剖的实验方案。此外，我们还描述了一种快速分离这些骨骼中骨髓的技术，该技术利用离心法将骨髓从骨髓腔中分离出来。

对骨及骨髓的研究在许多研究领域中至关重要，包括基础骨生物学、免疫学、血液学、癌症转移等。

本长骨解剖及骨髓分离操作的总体目标是快速、系统地取出长骨，并收集骨髓用于后续下游分析。该方法有助于回答与骨髓生物学、癌症转移及免疫学相关的关键科学问题。该技术的主要优势在于解剖过程快速且标准化，骨髓分离操作具有较高的无菌性。首先将小鼠置于仰卧位。然后将踝关节下方的四个脚掌垫用针固定，并用70%乙醇喷洒小鼠，彻底浸湿腿部。接着，在下腹部中线右侧、髋关节上方做一个小切口，将切口沿腿部向下延伸，越过踝关节。将皮肤向后拉开。然后剪断附着在股骨近端的股四头肌，以暴露股骨的前侧面，并以与解剖板呈45度角的方向用大头针将肌肉从腿部固定展开。将剪刀紧贴股骨的后侧面，剪断附着于膝关节的腘绳肌。接着向后拉开附着在股骨近端的皮肤和腘绳肌，以暴露骨骼的后侧面，并用大头针以45度角将腘绳肌从腿部固定展开。用镊子夹住股骨远端膝关节上方位置。然后将剪刀刀片沿股骨干两侧向髋关节方向引导。到达股骨头后，扭转剪刀，使上部刀片正对股骨头，以使股骨脱位。现在用镊子夹住股骨干上端，剪除股骨头周围的软组织，使股骨从髋臼中游离出来。然后将包括股骨、膝关节和胫骨在内的整个腿骨向上并远离躯体方向牵拉，仔细剪除连接腿部与皮肤的结缔组织和肌肉。当所有结缔组织均被去除后，过度背屈踝关节，并如前所示旋转剪刀以使胫骨脱位。握住胫骨远端，注意不要切断肌腱，将胫骨向上并远离身体和插针板方向拉起。随后，清除附着在膝关节处长骨以及股骨和胫骨上残留的任何肌肉或结缔组织。为准备进行骨髓分离，用手握住股骨，使髌骨朝向远离操作者的方向，股骨头朝下。过度伸展膝关节，并扭转剪刀使胫骨与股骨脱位。随后去除连接股骨与胫骨之间的任何结缔组织。接着，握住股骨，使其前面朝外、股骨头朝下，将剪刀沿股骨干向上引导至髁部。轻轻来回旋转剪刀，去除髁突、髌骨和骨骺，暴露干骺端。然后使用镊子、剪刀和擦镜纸清除附着在股骨上的任何多余肌肉或结缔组织。接着，用镊子夹住胫骨，使前面朝外、踝端朝下。如果胫骨骨骺完整，将剪刀沿胫骨干向上引导至髁部，轻轻来回旋转剪刀以去除髁和骨骺，暴露胫骨干骺端。然后去除附着在胫骨上的其他肌肉或结缔组织，方法如前所述。为采集骨髓，首先将一根18号针头穿过0.5毫升微量离心管底部。然后将长骨放入离心管中，膝端朝下，并盖上管盖。将0.5毫升微量离心管套入1.5毫升微量离心管中，在微量离心机中以不低于10,000 × g的离心力离心15秒。通过肉眼观察确认骨髓已从骨组织中完全离出。骨骼应呈现白色，且在较大的离心管中可见较大的沉淀物。然后将0.5毫升微量离心管中的骨骼弃去，并将骨髓悬浮于适当的溶液中，用于后续所需的分析。该快速解剖技术适用于多种下游分析，包括骨组织形态计量学和组织学。事实上，如本代表性组织形态计量学显微CT三维重建所示，松质骨和皮质骨壳均得以保持，从而能够对骨组织形态计量学的标准结构参数进行准确定量。在本例经福尔马林固定、脱钙处理并进行苏木精-伊红染色的小腿胫骨代表性组织切片中，可观察到钙化骨组织及细胞骨髓结构的完整性均得到良好保存，适用于组织学分析。此外，通过本方法分离获得的骨髓适用于多种后续应用，包括破骨细胞或成骨细胞的原代细胞培养。一旦掌握，若操作得当，从长骨解剖到骨髓分离的整个技术可在约七分钟内完成。进行该操作时，重要的是要注意将小鼠摆放于便于解剖的位置。在完成该步骤后，可进一步采用其他方法，如流式细胞术（FACS）或其他单细胞处理技术，以探究骨髓细胞群体变化的相关问题。观看本视频后，您应能够很好地掌握如何快速解剖小鼠的长骨，并通过离心法分离骨髓。

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