从放射性标记的底物在二氧化碳生成的测量果蝇

该方案的总体目标是测量完整果蝇产生的二氧化碳，设置放射性标记的底物，如棕榈酸或葡萄糖。这种方法可以帮助回答果蝇研究人员的关键问题，例如给定的突变是否会影响能量代谢。该技术的主要优点是它允许对少量果蝇的燃料氧化进行定量、灵敏和可重现的测量。

这种方法的视觉演示至关重要，因为苍蝇舱组装步骤需要快速作小部件，以确保在苍蝇从麻醉中恢复之前正确构建实验装置。碳 14 是一种低能量的 β 发射器，在空气中的射程很短，但仍必须注意防止放射性标记分子溢出或实验人员意外摄入。将 1 至 2 微居里放射性标记底物与 15 微升 FD&C Number One 蓝色食用染料和水混合，以获得 25 微升的总体积。

将所有放射性标记的底物和蓝色染料混合物吹入空的苍蝇食品小瓶的底部。由于苍蝇食品小瓶很容易翻倒，因此请务必将它们存放在防止它们倾倒的容器中。在微波炉中加热标准苍蝇食物，直到食物刚刚液化。

在高功率下 15 到 20 秒通常足以处理一个装有 10 毫升食物的小瓶。将 975 μL 的熔融食物添加到放射性标记的底物和蓝色染料混合物中，快速旋转，同时监测蓝色的均匀性，以确保完全混合。可能需要用剪刀剪断管头尖端以加宽窄端，从而允许内脏熔融食物的准确管头。

让食物在室温下冷却并完全凝固 20 到 30 分钟。二氧化碳麻醉装置由多孔聚乙烯与丙烯酸基座熔合而成，并连接到带有压力调节器的二氧化碳罐，用于麻醉成年果蝇。以每分钟 5 升的速度将二氧化碳流入麻醉装置。

将麻醉的苍蝇转移到含有放射性标记的蓝色染色食物的小瓶中。用泡沫塞盖住每个小瓶，并将其水平放置，直到果蝇醒来。将样品瓶转移到带盖的丙烯酸容器中。

对于短期喂养，饥饿苍蝇在转移到放射性标记食物之前 18 到 24 小时，以确保它们在 2 到 3 小时的喂养步骤中会进食。对于五到七天的长期喂养，苍蝇不需要饿死，但实验者应监测小瓶中放射性标记食品的含水量，并使用针头和注射器向装有干粮的小瓶中加水。当放射性标记的底物喂养期结束后，通过将果蝇敲入新小瓶中，将果蝇转移到未标记的食物中。

最初的追逐期为 2 到 4 小时，使苍蝇能够清除角质层中的放射性标记食物颗粒，并允许消化残留在肠道中的放射性标记食物。通过目视检查果蝇以寻找蓝色腹部，监测食物通过肠道的进度。随后，将果蝇转移到不同的食物类型或环境温度下。

此追踪期的长度将根据正在进行的实验而变化。在制作二氧化碳收集装置之前，组装材料以构建苍蝇舱，这些苍蝇舱是网状管，其中包含用 C-14 葡萄糖或 C-14 棕榈酸标记的苍蝇，并保持对大气开放。用止血钳夹住剃须刀片，在本生灯的火焰中加热至红热，然后用加热的刀片切掉 12 毫米 x 75 毫米聚丙烯管的顶部 50 毫米，留下 25 毫米长的圆底管。

准备 35 毫米 x 35 毫米的 130 微米尼龙网。剪下几条一英寸半到两英寸长的透明胶带。接下来，组装二氧化碳收集装置的材料。

对于每个飞行舱，组装一个 20 毫升玻璃闪烁瓶、一个带有中心孔的橡胶顶塞、一个中心孔和等级 GFB 玻璃超细纤维滤纸。将中心孔插入顶部塞子上的孔中。使用当天准备 5% 新鲜的氢氧化钾。

在麻醉苍蝇转移到蝇荚之前，将圆形 GFB 滤纸折叠并放入穿过橡胶顶部塞子孔的中心井中，并用 100 微升 5% 氢氧化钾浸透。将麻醉的苍蝇转移到苍蝇舱中是该协议中最困难的步骤。为确保成功，请将所有需要的材料放在附近，并迅速限制苍蝇接触二氧化碳，并避免苍蝇在网眼牢固地固定在管子上之前醒来并逃跑。

在未标记的培养基上孵育后，用二氧化碳麻醉果蝇。将麻醉的苍蝇刷入切下的聚丙烯管中，用尼龙网封住，然后用透明胶带将网片粘附在管子上。对于特定实验，每个苍蝇舱中应使用相同数量的苍蝇。

每个苍蝇群 10 到 20 只苍蝇产生足够的放射性标记二氧化碳，用于通过闪烁计数进行测量。将 fly pod 转移到 20 毫升玻璃闪烁瓶中。用橡胶盖塞盖住玻璃瓶，固定一个含有氢氧化钾饱和 GFB 滤纸的中心孔。

橡胶盖塞的宽顶部折叠在玻璃闪烁瓶的边缘上。将装有果蝇的玻璃瓶放在带盖的丙烯酸容器中，并孵育不同的时间。孵育结束时，打开玻璃瓶盖，将氢氧化钾饱和的 GFB 滤纸转移到装有 4 mL 闪烁混合物的 6 mL 塑料闪烁瓶中。

准备额外的闪烁瓶，一个包含未使用的 GFB 滤纸作为背景，一到两个其他小瓶含有 0.1 至 0.5 微居里放射性标记底物，以确定每个微居里每分钟的计数。使用闪烁计数器，根据制造商的方案每分钟测量每个样品的计数。随后，按照协议文本中的描述计算二氧化碳总产生量。

将果蝇禁食 18 小时，喂食放射性标记的棕榈酸 2 小时，然后以 12 或 25 只动物为一组进行 3 或 6 小时的孵化测试放射性标记二氧化碳的产生。如图所示，25 只果蝇产生的二氧化碳量几乎是 12 只果蝇产生的二氧化碳量的两倍，当孵育时间从 3 小时增加到 6 小时时，每组的二氧化碳量增加了一倍。每组每只苍蝇每小时的皮摩尔放射性标记二氧化碳几乎相等。

由于禁食会刺激 β 氧化分解脂肪酸，因此与喂食动物相比，禁食动物脂肪酸氧化产生的二氧化碳应增加。为了测试这一点，将禁食 18 小时的果蝇喂食放射性标记的棕榈酸 2 小时，分为两组，并转移到未标记的果蝇食物或 1% 琼脂中。在两个独立的实验中，在琼脂上追逐的苍蝇比在食物上追逐的苍蝇产生的放射性标记二氧化碳多得多，这表明禁食动物的 β 氧化增加。

按照此程序，可以执行补充方法，例如测量总二氧化碳产生量和总耗氧量以及计算呼吸交换比，以回答其他问题，例如首选燃料来源是什么。观看此视频后，您应该对如何使用此协议来确定给定突变或实验作对使用特定燃料作为能源的能力的影响有一个很好的了解。不要忘记，与放射性一起工作可能是危险的，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如戴手套、实验室外套和护目镜，以及使用适当的防护罩。