Name: 皮肤去神经外科手术:一种用于皮肤病的小鼠模型测试要求的神经方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: 了解皮肤去神经外科手术方法，用于研究小鼠皮肤神经在正常和病理状态下的作用。该技术通过比较去神经与完整皮肤样本，帮助揭示神经对皮肤稳态和疾病的影响。

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作者感谢Autumn Peterson在小鼠摄影方面的协助，Daniel Thoresen在小鼠操作方面的协助，以及Nicole Ward博士和Abdelmadjid Belkadi博士在手术去神经化方面的协助。本研究得到了美国国家关节炎与肌肉骨骼和皮肤病研究所（资助号R00AR059796和R01AR065409）、密歇根大学皮肤病学系、生物科学学者计划、器官发生中心、密歇根大学综合癌症中心以及John S.和Suzanne C. Munn癌症基金的资助。S.C.P.得到了美国国家普通医学科学研究所（资助号T32 GM007315）的资助。本研究还得到了美国国立卫生研究院（NIH）院内研究计划、癌症研究中心、国家癌症研究所的支持。

本方案中描述的所有操作均按照密歇根大学实验动物医学单位制定的规定进行。
1. 在小鼠中诱导基因重组
注意：Gli1tm3(cre/ERT2)Alj/J 小鼠品系（Gli1-CreERT2）13 可实现他莫昔芬诱导的基因重组在胸腺上皮细胞中的靶向表达。将该品系与 B6.129S4-Gt(ROSA)26Sortm1Sor/J 报告小鼠（LacZ）22 杂交，以获得 Gli1;LacZ 小鼠，用于后续通过整体染色法可视化胸腺细胞。
<ol>
	<li>将他莫昔芬溶液配制为浓度 12.5 mg/ml 的玉米油溶液。
	<ol>
		<li>在 1.5 ml 离心管中加入最多 20 mg 结晶态他莫昔芬，然后加入 1 ml 玉米油。将管子牢固地固定在涡旋振荡器上，在室温下以最高转速持续涡旋，直至他莫昔芬完全溶解（2–4 小时），通过体视显微镜观察确认管内无他莫昔芬颗粒残留。</li>
		<li>将溶液转移至 15 ml 离心管中，用额外的玉米油稀释，使他莫昔芬终浓度为 12.5 mg/ml。通过涡旋振荡黏稠溶液 30 秒以充分混匀。该溶液可在 4 °C 避光条件下储存最多 1 周。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将他莫昔芬溶液按每 20 g 小鼠体重 200 µl 的体积，通过腹腔注射方式注入 Gli1;LacZ 小鼠体内，使每 20 g 体重小鼠接受的有效他莫昔芬剂量为 2.5 mg。</li>
</ol>
2. 收集皮肤活检样本
注意：根据实验需求，在他莫昔芬诱导后的数天至数周内采集皮肤活检样本。&#160;所有手术操作均应遵循啮齿类动物手术的标准规程，包括使用无菌手套、佩戴外科口罩或头网，并在手术过程中用无菌手术单覆盖动物。
<ol>
	<li>通过将90 mg/ml的氯胺酮和6.5 mg/ml的赛拉嗪溶于水中，配制10倍浓度的麻醉剂储备液。使用前将该储备液用无菌PBS按1:10比例稀释，并在室温避光条件下保存，最长可保存8个月。
	<ol>
		<li> alternatively，可通过异氟烷吸入对小鼠进行麻醉，起始气体浓度为4%（以氧气为载气）以实现充分麻醉，随后将浓度降至1-2%，维持至手术结束。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>以每20 g小鼠体重200 µl的剂量，将麻醉剂溶液经腹腔注射。通过脚趾夹捏试验检查动物是否达到适当的麻醉深度，并确认心率和呼吸频率正常（分别约为600次/分钟和160次/分钟）。</li>
	<li>使用电动剃毛器小心去除背部背侧活检区域的毛发，注意避免划伤或损伤下方皮肤。</li>
	<li>用碘伏和酒精棉片从前向后擦拭剃毛区域，完成手术部位准备，并确保清除所有毛发碎屑。</li>
	<li>用黑色记号笔标出活检区域，将动物置于无菌手术区域的加热垫上，并覆盖无菌手术巾（为便于演示，此处省略了无菌手术巾以提高可见性）。&#160; &#160; 
	注意：为了获得毛囊的纵切面，活检区域的长边（用于组织学切片的一边，约1 cm）应沿前后方向（与毛囊走向平行），位于背部中线旁的旁矢状面（图1A）。</li>
	<li>使用无菌#11手术刀沿标记区域进行全层皮肤切除，注意不要损伤下方肌肉筋膜。 
	注意：切除的皮肤组织包括表皮、真皮、皮下脂肪和肉膜肌（panniculus carnosus）。通常出血量极少。</li>
	<li>将切除的皮肤样本平铺于干燥的纸巾上，真皮面朝下，修剪掉多余的纸巾。若需等待其他样本采集完成，可将样本置于冷PBS中保存不超过1小时。准备就绪后，进入步骤3.1或3.2进行组织学处理，或进入步骤4进行整体β-半乳糖苷酶（LacZ）染色。</li>
	<li>使用6-0尼龙缝线，以间断简单缝合方式关闭活检创口，缝线间距约为3 mm。</li>
	<li>手术后的小鼠在完全恢复前不得与其他动物同笼饲养。</li>
	<li>手术后立即对动物进行监测，直至其恢复意识，并在术后每日观察直至手术部位愈合，通常在1周内完成。若小鼠出现疼痛或不适迹象，应根据指定的机构动物护理与使用指南给予镇痛药物。术后7-10天内拆除缝线。 
	注意：如需配制镇痛剂溶液，可将卡洛芬（50 mg/ml储备液）用无菌水按1:100稀释。以每20 g体重200 µl的剂量（即5 mg/kg小鼠体重），在肩胛间区域靠近颈背部皮肤皱褶处进行皮下注射。</li>
</ol>
3. 组织学样品处理
注意：根据应用需求，使用以下任一方法对切除的组织进行固定和处理。
<ol>
	<li>为制备石蜡包埋的组织学样本，将皮肤在室温下用 PBS 中 3.7% 的甲醛固定过夜，随后转移至 70% 乙醇中保存，最长可保存 2 周。包埋前需去除纸巾。</li>
	<li>为制备冷冻组织学样本，将组织浸入预冷的含 4% 多聚甲醛的 PBS 溶液中，轻轻振荡孵育 1 小时。移除溶液后，用 PBS 洗涤样本三次，每次约 5 分钟。随后将样本浸入含 30% 蔗糖的 PBS 溶液中以进行组织冷冻保护（&#34;蔗糖沉降&#34;）。</li>
	<li>在 4 °C 下轻轻振荡孵育过夜。次日，去除纸巾，并从皮肤真皮侧修剪掉多余的脂肪组织。直接将组织包埋于 OCT 包埋剂中，并将冷冻组织块保存于 -80 °C。 
	注意：切片后，无论是石蜡包埋样本还是冷冻样本，均可通过免疫组织化学染色鉴定触觉小体（TDs）、默克尔细胞和神经纤维，分别使用针对角蛋白 17（Keratin 17）、角蛋白 8（Keratin 8）和神经丝蛋白（Neurofilament）的抗体，具体方法如先前所述5,19。</li>
</ol>
4. 通过整体 LacZ 染色观察样品
<ol>
	<li>制备 X-gal 染色液。
	<ol>
		<li>将 0.94 g 磷酸二氢钠和 2.6 g 磷酸氢二钠溶于 250 ml 无菌水中，调节 pH 至 7.3。向该溶液中加入 0.5 ml 1 M 氯化镁、0.528 g 亚铁氰化钾和 0.412 g 铁氰化钾。再加入 250 µl 辛基苯基聚乙二醇和 125 mg 脱氧胆酸钠。基础溶液可在避光条件下于 4 °C 保存最多 6 个月。</li>
		<li>通过向 X-gal 储存液瓶中加入二甲基甲酰胺，配制 50 倍浓缩的 X-gal 储存液，使其浓度为 50 mg/ml。将该溶液避光保存于 -20 °C。</li>
		<li>使用前，将 X-gal 储存液按 1:50 比例稀释至 X-gal 基础溶液中，制成染色液。对于较小的活检样本（&#60;1 cm2），每份样本加入 1–2 ml 染色液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将第 2.7 步采集的皮肤样本置于含有 2% 多聚甲醛和 0.2% 戊二醛的冷 PBS 溶液中固定 30 分钟，于冰上轻轻振荡。对于较小的活检样本（&#60;1 cm2），每份样本使用 1–2 ml 固定液。 
	注意：也可选择仅使用 2–4% 多聚甲醛或仅使用 0.5% 戊二醛进行固定。最佳固定条件取决于组织类型、LacZ 表达水平及具体应用。</li>
	<li>去除固定液，用 PBS 洗涤样本三次，每次 5 分钟，在室温下振荡洗涤。</li>
	<li>移除样本下方的滤纸，用钝头镊夹住真皮侧的脂肪组织，使用解剖剪剪除多余的脂肪组织。</li>
	<li>将样本完全浸入 X-gal 染色液中，于 37 °C 过夜孵育。LacZ 表达可在解剖显微镜下观察到蓝色染色（图 1B）。 
	注意：若信号强度较弱，可于次日更换染色液并再次过夜孵育。若背景染色过强，可缩短染色时间，或将样本在室温而非 37 °C 下孵育。</li>
	<li>去除染色液，用含 3% DMSO 的 PBS 洗涤样本三次，每次约 5 分钟，在室温下轻轻振荡。</li>
	<li>用 70% 乙醇洗涤样本 2–3 次，每次 5 分钟&#160;。将样本保存于 70% 乙醇中。</li>
</ol>
5. 手术去神经
<ol>
	<li>按照步骤 2.2 对动物进行麻醉，并剃除整个背部皮肤的毛发。</li>
	<li>使用聚维酮碘和酒精棉片准备背部手术区域，&#160;并用无菌手术巾覆盖动物（出于演示目的，省略了无菌手术巾以提高可见性）。在无菌手术环境中操作时，使用加热垫保持动物体温。</li>
	<li>使用无菌的 #11 手术刀沿背部中线从颈部基部至尾部上方约 0.5 cm 处做一切口。</li>
	<li>使用钝头镊子轻轻将左侧皮肤从侧腹区掀开，以观察从颈部附近的肩胛脂肪垫至后肢上方的皮下组织。 
	注意：背侧皮神经表现为白色条索状结构，穿过躯干壁半透明的筋膜向尾端走行，在进入皮肤下方疏松结缔组织前会形成明显的弯曲（图 2）。</li>
	<li>在解剖显微镜下使用超细镊子，仅从动物左侧 T3-12 节段解剖位置处拔除神经，操作范围从神经在躯干壁弯曲处至其穿入皮肤的部位（图 2）。
	<ol>
		<li>将镊子垂直放置，夹住神经弯曲点下方约 0.5 cm 处，向上牵拉，使神经拉伸并从周围组织分离（图 2C-E）。注意避免撕裂邻近的血管。</li>
		<li>持续操作直至所有从躯干壁延伸至皮肤的神经均被去除。切勿破坏躯干壁致密筋膜内的神经。在整个操作过程中，定期滴加无菌 0.9% 氯化钠溶液以保持组织湿润。</li>
		<li>或者，可用镊子夹住神经近端靠近躯干壁的位置，用精细剪刀剪断；随后，在靠近皮肤处切断远端（图 2F-H）；最后，移除中间的神经节段（图 2I）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>去除步骤 5.4 中暴露的皮瓣上的任何残留神经。这些纤维为背侧皮神经的远端分支，表现为在皮瓣真皮侧结缔组织中零星分布的白色分枝状细丝（图 2J-K）。
	<ol>
		<li>为去除这些细小分支，将精细镊子大致平行于真皮表面放置，夹住神经后向上拔除，以避免损伤血管或刺穿皮肤。持续操作直至所有可见神经均被清除。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过钝性分离，将背中线切口右侧的皮肤掀开，但不切除神经。该侧将作为对侧假手术对照。</li>
	<li>采用单纯间断缝合法沿背中线缝合切口以关闭创面。术后按照前述方法（步骤 2.8–2.10）监测动物恢复情况。术后 7–10 天拆除缝线。</li>
	<li>为在术后数周内功能性评估去神经状态是否稳定，使用电动剪刀去除背部皮肤的毛发。</li>
	<li>使用皮下注射针轻轻刺击去神经区域的皮肤，观察动物是否出现反应（通常表现为颤抖或转头）。若该区域已稳定去神经，动物将几乎无反应或完全无反应。</li>
	<li>使用黑色记号笔标记无反应区域，同时在对侧假手术侧标记大小和位置相似的区域。</li>
	<li>按照步骤 2.1–2.9 从上述部位采集活检样本用于分析。 
	注意：或者，可将整个背部皮肤（包括去神经区域和假手术区域）作为一个整体完整取下，用于全层染色，方法类似于步骤 4 中所述。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

神经不仅在感觉功能中起着关键作用，还在哺乳动物器官的发育、维持和再生中发挥重要作用13,24-27。由于近期研究发现神经与多种皮肤疾病相关，本文所述技术可用于研究不同动物疾病模型中皮肤神经支配的必要性。事实上，单侧去神经技术可实现对同一小鼠体内神经完整与神经受损皮肤的直接比较，从而提供理想的内部对照，以消除个体间差异的影响，后续数据分析可采用配对t检验。
尽管本文所述实验主要利用 LacZ 报告基因，但这些实验可进行调整，将 Gli1-CreERT2 等位基因与其他荧光报告基因或条件性等位基因组合，以在毛囊隆突区（TD）中调控基因表达。例如，可将 Gli1-CreERT2 小鼠与携带 Patched1 条件性等位基因的小鼠（B6N.129-Ptch1tm1Hahn/J）28 杂交，从而获得在他莫昔芬诱导后可形成源自TD的肿瘤的小鼠模型5。需要注意的是，Gli1-C...

近年来，人们越来越认识到神经对那些通常不被视为经典神经病变的疾病具有重要影响1-4。在皮肤中，最新的实验证据表明，感觉神经可调节多种病理过程，范围从银屑病到癌症5-9。这些发现是通过在啮齿类动物中采用手术去神经化以及药理学手段抑制神经功能等技术实现的。以银屑病为例，这些研究为理解人类银屑病斑块在神经功能丧失后发生退行的机制提供了理论框架7,10-12。
皮肤神经还能影响基因表达13,14，并在正常皮肤的机械感知中起关键作用15。特别是，触觉圆顶（TD）上皮由一群柱状表皮细胞构成，其内含有神经内分泌型的默克尔细胞，并由慢适应1型（SA1）神经纤维支配16-18。TD介导轻触觉感知，且已被证实存在Hedgehog信号通路活性5,19。TD的维持依赖于神经支配20,21，因为神经元可分泌Hedgehog配体，以维持正常的TD及其相关的默克尔细胞19。此外，神经支配还能促进TD上皮中依赖Hedgehog通路的肿瘤形成5。这些研究共同强化了一个观点：神经与其微环境中周围细胞之间发生的复杂分子相互作用，对于TD的正常生理功能以及疾病发生均至关重要。
为了探究这些相互作用的性质，本文描述了一系列 体内 用于操控TD中基因表达的技术，以及在谱系示踪后采集皮肤活检以观察TD的方法。最后，我们描述了单侧手术去神经的操作流程，即去除小鼠背部皮肤一侧的神经，而对侧保持完整，作为假手术内部对照。手术数周后，比较去神经侧与假手术对照侧的皮肤，以评估神经消融后发生的变化。尽管这些技术是在正常TD的背景下进行描述的，但去神经手术已被用于研究在小鼠银屑病模型中神经所发挥的必要作用6，伤口愈合13 和肿瘤发生5最后，由于皮肤适合进行多次活检，这为长期监测标记细胞的命运或在多个时间点评估疾病进展提供了机会。

<table><tbody><tr><td>酒精消毒片</td><td>PDI</td><td>B339</td><td></td></tr><tr><td>镇静剂 AnaSed（赛拉嗪）</td><td>Lloyd</td><td>NADA 139-236</td><td></td></tr><tr><td>抗体，抗角蛋白 8</td><td>发育研究杂交瘤库</td><td>TROMA-I</td><td>大鼠抗体，使用浓度为 1:500</td></tr><tr><td>抗体，抗角蛋白 17</td><td>Cell Signaling</td><td>#4543</td><td>兔抗体，使用浓度为 1:1,000</td></tr><tr><td>抗体，抗神经丝蛋白</td><td>Cell Signaling</td><td>C28E10</td><td>兔抗体，使用浓度为 1:500</td></tr><tr><td>聚维酮碘消毒片</td><td>Medline</td><td>MDS093917</td><td></td></tr><tr><td>卡洛芬（Rimadyl）</td><td>Zoetis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>无线可充电剃毛剪</td><td>Wahl</td><td>修剪器型号 8900</td><td></td></tr><tr><td>玉米油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8267</td><td></td></tr><tr><td>冷冻切片机</td><td>Leica</td><td>CM1860</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1306</td><td>使用浓度为 1:1,000</td></tr><tr><td>脱氧胆酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>脱毛膏</td><td>Nair</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>二甲基甲酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>319937</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>戊二醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>ImmEdge 笔</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>盐酸氯胺酮</td><td>Hospira</td><td>NDC 0409-2051-05</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>微型盖玻片</td><td>VWR</td><td>48404-454</td><td></td></tr><tr><td>显微载玻片</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>10% 中性缓冲福尔马林</td><td>VWR</td><td>BDH0502-4LP</td><td></td></tr><tr><td>6-0 尼龙缝合线</td><td>DemeTECH</td><td>NL166012F4P</td><td></td></tr><tr><td>辛基苯基-聚乙二醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8896</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. 包埋剂</td><td>Sakura Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>亚铁氰化钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9387</td><td></td></tr><tr><td>铁氰化钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>702587</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>他莫昔芬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5648-1G</td><td></td></tr><tr><td>超细镊子</td><td>Dumont</td><td>0103-5-PO</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield 封片剂</td><td>Vector Laboratories</td><td>H1000</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>Roche</td><td>10 651 745 001</td><td>使用前用二甲基甲酰胺溶解，配制成 50 倍储存液</td></tr></tbody></table>

皮肤外科去神经术：一种用于检测神经在小鼠皮肤疾病模型中作用需求的方法

Cutaneous Surgical Denervation:  A Method for Testing the Requirement for Nerves in Mouse Models of Skin Disease

皮肤体感神经的功能是检测作用于皮肤的各种刺激。除了已知的感觉功能外，近期研究还表明神经可能调节特应性皮炎、银屑病和皮肤癌等多种皮肤疾病。本文中，我们描述了检测神经在维持皮肤机械感受器官——触觉圆顶（touch dome, TD）结构中所起作用的实验方案。具体而言，我们讨论了通过整体染色法对TD进行遗传标记、取材和可视化观察的技术，以及在小鼠背部皮肤实施单侧手术去神经的方法。结合这些方法，可直接在同一动物的去神经皮肤与假手术对照皮肤之间比较TD的形态学特征和基因表达情况。这些技术也可轻松应用于各类小鼠皮肤病理模型，以研究神经在其中的作用。此外，皮肤组织可多次取样，使得研究人员能够在疾病发生发展的不同阶段和时间点动态监测病情进展。

通过构建表达他莫昔芬诱导型的转基因小鼠 Gli1-CreERT2 和一个 LacZ 报告等位基因，可实现对TD上皮的可视化，并能够随时间追踪这些细胞的命运。整个去神经手术过程通常每只小鼠可在1小时内完成，且应对动物造成的不适最小。
我们之前的研究表明，神经对于维持正常的毛囊隆起（TD）及其相关的角蛋白8+ Merkel细胞均至关重要（图3A–C）5,19。神经对于促进TD中Gli1的表达也具有关键作用（图3D）。鉴于TD簇在皮肤中出现频率相对较低（图1B），为准确量化TD频率，必须取样多个冷冻切片。通常，我们从每只动物的假手术皮肤和去神经皮肤中各选取15个非连续切片（每个切片厚10 µm，长约1 cm）进行评估。去神经处理...

本文包含小鼠皮肤遗传标记、手术去神经、皮肤活检以及通过整体β-半乳糖苷酶染色观察标记上皮的详细实验方案。这些方法可用于检测在正常及病理皮肤小鼠模型中神经所必需的作用。

皮肤体感神经的功能是检测作用于皮肤的各种刺激。除了已知的感觉功能外，近期研究……

本实验的总体目标是研究神经对正常皮肤及病理性皮肤的影响。该方法可用于回答正常皮肤生物学中的关键问题，例如皮肤神经是否影响皮肤的稳态及疾病发生。该技术的主要优势在于，能够对同一动物个体的完整神经支配皮肤与去神经皮肤样本进行直接比较。对该技术进行可视化演示至关重要，因为神经可能难以辨认，且在尽可能减少对周围组织损伤的情况下进行分离具有挑战性。首先，对小鼠实施麻醉，并通过脚趾夹捏法检查其是否达到适当的镇静水平。同时，确认小鼠呼吸和心跳正常。现在将动物置于无菌手术区域的加热垫上。使用电动剪毛器，小心地去除将要取活检的背部区域的毛发。然后用碘伏和酒精擦拭棉球擦拭脱毛区域。确保清除该区域的所有毛发碎屑。现在使用黑色标记笔标出活检区域。为了获得毛囊的纵切面，活检切口的长边应平行于背侧中线，从前向后方向进行。使用手术刀进行全层切除，避免损伤下方的肌筋膜。通常出血量极少。活检样本应包含表皮、真皮、皮下脂肪和肉膜层（panniculus carnosus）。将切除的皮肤样本展平于干燥的纸巾上，真皮面朝下。修剪掉多余的纸巾，若需采集其他样本，可将该样本置于冷TBS中保存不超过一小时。返回小鼠身上，使用6-0尼龙缝线，每间隔约三毫米缝合一次，关闭活检部位。然后将小鼠置于恢复笼中进行监测，直至其恢复意识。根据指定的机构动物护理规范使用镇痛剂，若小鼠出现痛苦迹象，应遵循相关指南进行处理。术后7至10天内拆除缝线。继续对活检样本进行组织学或全片染色处理。将动物麻醉后，剃除整个背部皮肤的毛发，并参照活检操作步骤清洁该区域。随后使用无菌手术刀从颈部基部沿背部中线切开，直至尾部上方约半厘米处。使用无菌钝头镊子，轻轻将左侧体侧的皮肤从肩胛脂肪垫靠近颈部处至后肢上方区域向一侧牵拉，以暴露下方组织。在解剖显微镜下辨认背侧皮神经。该神经呈白色条索状结构，沿躯干壁半透明的筋膜向尾侧走行，随后出现明显弯曲，进入皮肤下方的疏松结缔组织。接下来，使用超细镊子，从动物左侧位于解剖位置 T3 至 T12 的区域中仅分离出神经，将其从神经节段在体壁弯曲处至其进入皮肤的部位拔除。将镊子垂直定向，在神经弯曲点下方约半厘米处夹住神经。一旦夹住，向上牵拉，使神经拉伸并从周围组织中分离，从而将其移除。避免损伤邻近的血管。在整个操作过程中，需定期滴加0.9%生理盐水以保持组织湿润。继续清除从躯干壁延伸至皮肤的所有神经，但不要破坏躯干壁致密筋膜内的神经。接下来，去除暴露的皮瓣中的任何神经。这些纤维为背侧皮神经的远端分支，呈白色分枝状细丝，零星分布于皮瓣真皮侧的结缔组织中。去除这些细小分支时，应将镊子大致平行于真皮表面放置，夹住神经后向上拔除。以这种方式去除所有可见的神经。切勿刺破血管和皮肤。在此步骤中，重要的是避免损伤邻近的血管。如果发现神经附近有伴行的血管，应沿着神经追踪至无邻近血管的区域，然后通过拔除的方式将其去除。现在，松解背侧正中切口右侧的皮肤，但不要去除任何神经。这将作为对侧假手术对照。最后，缝合动物，并像之前一样进行术后监测。术后数周，为确认神经去支配的稳定性，用无菌皮下注射针轻轻刺击去神经区域。观察动物是否出现反应，通常表现为颤抖或转头。如果皮肤区域已稳定去神经化，动物将表现出极轻微或无反应。从无反应区域及其对侧假手术侧采集皮肤活检样本，以获得配对的实验组和对照组样本。在活检样本中，重要的是要取多个组织学切片，以识别假手术组与去神经化样本之间在触觉小体数量或形态上的潜在差异。glebe one cree ERT2 小鼠品系可将他莫昔芬诱导的基因重组靶向至皮肤中 Hedgehog 信号通路活性较高的区域，例如触觉圆顶上皮。这些小鼠与 abolaxi 报告小鼠杂交，以实现对触觉圆顶上皮的可视化。淋巴结对于维持正常的触觉圆顶结构及其相关的 Merkel 细胞至关重要。通过实验可观察到，去神经处理后，正常触觉圆顶结构逐渐丧失，同时角蛋白8沉积细胞也随之减少。神经对于促进触觉圆顶中的Hedgehog信号通路也至关重要，这一点可通过Glebe1-CreER2表达以及假手术组和去神经皮肤组织的免疫荧光共聚焦染色（home-mount beta-catenin staining）进行监测。观看本视频后，您应能够充分理解如何通过手术切除背侧皮神经，以检测这些神经是否参与正常皮肤功能或是否对皮肤疾病具有调节作用。一旦掌握，该技术可常规且可靠地实施，对动物造成的应激极小。在完成该操作后，可采用氨基荧光染色等方法来确认皮肤中的神经是否已被完全消融，以及基因表达是否受到影响。

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Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

皮肤去神经外科手术：一种用于皮肤病的小鼠模型测试要求的神经方法

本文描述的 spared nerve injury（SNI）动物模型是一种小鼠模型，通过损伤坐骨神经的胫神经和腓总神经分支，保留剩余的腓肠神经完整，从而建立外周神经病理性疼痛模型。由机械性异常性疼痛引起的行为学改变通过 von Frey...

小鼠中诱导机械性异常性疼痛的 spared nerve injury（SNI）模型

本视频通过手术去神经化小鼠模型的一侧并保留另一侧作为对照，演示了如何检测感觉神经功能。机械刺激的反应证实了感觉神经的作用。...

测试手术去神经小鼠模型中的感觉神经功能

胫神经横断模型是一种耐受性良好、经过验证且可重复的骨骼肌萎缩模型。该模型的手术方案在C57Black6小鼠中进行了描述和演示。...

胫神经横断——小鼠去神经诱导骨骼肌萎缩的标准模型

神经病理性疼痛是由影响躯体感觉系统的损伤或疾病引起的后果。小鼠神经病理性疼痛的“套管模型”是将聚乙烯套管植入坐骨神经主支周围。使用冯·弗雷丝（von...

小鼠神经病理性疼痛的坐骨神经套管模型

本文介绍了一种在小鼠面神经上进行切断或压榨性轴突切断术的手术方案。面神经轴突切断术可用于研究神经损伤后的生理反应，并测试治疗技术。...

小鼠面神经切断术：研究运动神经元损伤反应的模型

本研究建立了一种使用树脂毒素（RTX）的纯小纤维神经病变实验模型。特定剂量的RTX（50...

建立纯小纤维神经病小鼠模型的瞬时受体电位香草素受体1超强激动剂方法

这种改良手术是一种简化的用于小鼠或大鼠的保留神经损伤模型的方法，仅需一次结扎和一次切割即可同时损伤腓总神经和腓肠神经。...

小鼠神经病理性疼痛的改良部分神经结扎手术模型

坐骨神经部分结扎可诱导产生持续时间较长的慢性神经病理性疼痛，其特征是对热和机械刺激的反应显著增强。该神经病理性疼痛小鼠模型常用于研究疼痛管理方面的创新疗法。本文详细描述了手术操作步骤，以提高实验的标准化程度和可重复性。...

部分坐骨神经结扎：一种用于研究新型疗法镇痛效果的慢性神经病理性疼痛小鼠模型

本文提供了一种从小鼠体内手术切除腹后神经节腰段交感神经元的实验方案。该操作将有助于开展多种研究，以探究交感神经支配在远端组织靶标中的作用。...

小鼠腰交感神经切除术

本方案介绍了一种可重复的利用感觉神经模拟人类神经瘤疼痛并评估手术治疗方法的大鼠模型，为转化神经瘤研究提供了有价值的工具。...

一种用于研究通过隐神经靶向肌肉再神经支配治疗神经瘤疼痛新方法的新型手术啮齿动物模型

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