微流控缓冲液更换为无干扰微/纳米颗粒细胞工程

该程序的总体目标是展示一种方便、高效和高通量的微流体纯化技术，在用纳米颗粒进行细胞工程改造后，从细胞中分离游离纳米颗粒。这项技术的主要需求是允许快速有效地去除未结合的纳米颗粒 在细胞分娩程序之后，我们收集了我们所有的 ses-fa-tion。由于螺旋微器件中细胞和纳米颗粒的差异惯性聚焦效应，这种微流控细胞纯化技术实现了高效的基于尺寸的分离。

它每密耳浓度可处理多达 1000 万个细胞，这对于再生医学以及锁存体积细胞处理非常有用。这项技术在细胞工程领域非常需要，该领域通常使用纳米颗粒来构建细胞，用于成像目的或功能控制。演示该程序的是我实验室的研究助理 Hui Min Tay 以及 习 教授实验室的博士后研究员 David Yeo 博士。

用纳米颗粒标记细胞之前，在 6 孔板上培养间充质干细胞至 80% 汇合度以上。同样，将 THP-1 细胞培养至密度为每毫升 100 万个细胞。接下来，将 1 毫克二氧化硅纳米颗粒与 1 毫升 200 微摩尔钙染料溶液溶解。

并将颗粒搅拌过夜。此外，使用此处所示的参考文献中描述的方法制造 PLGA 钙 AM 纳米颗粒。通过上下吹打溶液 1 分钟，将 1 毫克 PLGA 钙 AM 纳米颗粒或 150 微克二氧化钙纳米颗粒与 01% 聚-l-赖氨酸水溶液混合。

然后让它在室温下孵育 15 到 20 分钟。接下来离心纳米颗粒。去除过量的聚-l-赖氨酸上清液，并将纳米颗粒重新悬浮在一毫升适合待标记细胞类型的培养基中。

培养物中的每 100 万个细胞，将 1 毫克标记的纳米颗粒添加到 1 毫升培养基中。将细胞、纳米颗粒和培养基的混合物彻底移液 1 分钟。然后将混合物孵育约 24 小时。

标记后，解离并收获干细胞，并将其重新悬浮至每毫升 100， 000 至 1， 000， 000 个细胞的浓度，以进行微流体处理。使用相同浓度的标记 THP-1 细胞。为了制造微流体螺旋装置，首先使用标准微纳加工技术准备硅胶晶片母模。

然后，在称量舟中将 30 克基础 PDMS 预聚物和 3 克固化剂充分混合。在真空下对混合物进行脱气 60 分钟，以去除任何气泡。将 PDMS 混合物倒入母模上，小心地将 5 到 10 毫米的高度倒入母模上，采用螺旋通道设计。

然后将混合物脱气 60 分钟以去除任何气泡。重复此过程，直到消除所有气泡。接下来，将晶圆放入烘箱中，并确保晶圆在固化过程中不会倾斜，以确保器件高度恒定。

在 80 摄氏度下固化 PDMS 两个小时。冷却后，使用手术刀切出 PDMS 螺旋装置，然后小心地从母模上剥离 PDMS 板。然后，使用手术刀修剪设备的边缘，以确保粘合表面光滑。

接下来，使用 1.5 毫米的活检打孔器为入口创建两个孔，为出口创建两个孔。用异丙醇清洗设备以去除任何碎屑。并在 80 摄氏度的烤箱中干燥设备 5 分钟。

然后，使用遮蔽胶带清洁 PDMS 设备的底面和载玻片的一侧。小心地将载玻片和 PDMS 装置放入等离子室中，露出干净的表面。将等离子体功率调至最大，降低腔室压力，直到腔室变为粉红色，然后暴露组件 60 秒。

然后，从腔室中取出载玻片和 PDMS 设备。并通过将等离子体暴露表面紧紧地压在一起来将它们粘合在一起。确保两个表面之间没有气泡。

将粘合装置放在 80 摄氏度的热板上加热两个小时，以加强粘合。剪下两根 15 至 20 厘米长的管子作为入口，并在每根管子的一端连接一根 23 号针头。然后，剪下两根长度为 5 到 10 厘米的相同管子作为出口，并将它们连接到设备的出口孔中。

在运行样品之前，用含有 70% 乙醇的注射器手动灌注设备，直到它从出口管流出。让乙醇在设备中静置至少 30 秒以对其进行消毒。然后，将 30 毫升含 1% BSA 的过滤 PBS 装入 60 毫升注射器中。

此外，将 3 毫升标记的细胞装入 3 毫升注射器中，并检查两个注射器中是否没有气泡。从喷嘴中轻轻喷出几滴液体，去除所有气泡。将入口注射器尖端和管路连接到注射器，并将注射器固定到注射泵上。

将管子插入设备各自的入口，并确保管子上没有气泡。设置好液流系统后，将设备安装到倒置相差显微镜上，以便在细胞分选过程中进行实时成像。将一个小废烧杯和两个 15 毫升的试管固定在显微镜载物台上的设备附近。

将设备两个出口的出口管放入废液杯中。现在，通过将样品注射器的流速设置为每分钟 120 微升，将鞘套注射器的流速设置为每分钟 1， 200 微升，将样品与鞘套缓冲液的流速比设置为 1 比 10。运行设备一分半钟，让流速有机会稳定下来。

使用高速相机确认在具有相差的明场下通道内壁附近是否存在惯性聚焦单元。一旦达到稳态流速并且设备正常运行，将出口管放置在不同的样品瓶中，以从池出口和废液出口收集单独的洗脱液。该设备能够从荧光二氧化硅纳米颗粒中正确分选标记的 THP-1 单核细胞悬浮液。

成像和流式细胞术分析均证实了高分离效率。单步纯化策略能够连续回收悬浮在新鲜缓冲溶液中的标记悬液和贴壁细胞，无需离心。该设备能够对二氧化硅和 PLGA 纳米颗粒进行高效分离，并且可以以相同的高效率每毫升分离多达 1000 万个细胞。

看完这个视频，你应该对如何用纳米颗粒标记细胞有了很好的了解。以及如何通过使用我们专用的微流控设备去除多余的未结合颗粒来纯化标记的细胞。