Name: 使用介电泳分离珠和多通道微流控芯片细胞和层流 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-04T18:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: 学习使用介电泳技术操控微流控芯片中的细胞和微珠，通过印刷电路板电极实现无接触分离。该方法为细胞生物学研究提供了一种经济高效的粒子操控方案。

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我们感谢Woo-Jin Chang提供了用于介电泳驱动的三分叉通道，并感谢Mitchell Collens在设备安装方面的协助。本工作得到了美国国家科学基金会（NSF）通过资助号OISE-0951647以及中国台湾国家科学委员会（NSC）通过资助号99-2911-1-002-007的支持。

图1A展示了设备设置的通用示意图。图1B进一步以截面示意图展示了PCB-样品组件的结构。
1. 制备PCB电极：
<ol>
<li>设计印刷电路板（PCB）电极至所需几何形状，以产生非均匀电场。可定制PCB电极芯片，并通过商业加工机构进行订购（图1C）。</li>
<li>通过将16号导线焊接到每个印刷金属电极末端，制备预制的PCB电极（图1D）。
<ol>
<li>将导线放置在电极末端，用热的电烙铁接触导线与PCB金属区域，使导线受热并保持位置固定。</li>
<li>向已加热的导线中加入少量焊料，使导线内部填充焊料。</li>
<li>导线填充焊料后，移开电烙铁，同时保持导线位置固定直至焊料冷却。</li>
</ol>
</li>
<li>对PCB上的每个电气连接重复上述焊接过程（图1D）。</li>
</ol>
2. 准备微流控通道：
<ol>
<li>使用道康宁（Dow Corning）的聚二甲基硅氧烷（PDMS）弹性体Sylgard 184制备基于PDMS的微流控通道。通常使用硅片和SU-8光刻胶通过标准微加工工艺制备用于定义通道的母模。</li>
<li>按10:1的比例将基础化合物与固化剂混合，持续5分钟。</li>
<li>将液态PDMS浇注到预制的SU-8母模上，并通过将液态PDMS置于真空环境中数分钟以去除气泡。如有需要，可重复抽真空过程，以彻底清除所有气泡。</li>
<li>在70 °C下固化PDMS 2小时。</li>
<li>使用剃刀刀片小心地将带有微流控通道的PDMS块从硅片上取下，注意不要损坏硅片。</li>
<li>打孔以引入流体和细胞至微流控装置。（注意：可采用注射泵、重力或基于表面张力的流动方式与介电泳（DEP）联用。）</li>
<li>检查微流控装置，确保其无灰尘和碎屑。可使用3M Scotch Magic胶带轻松清洁PDMS表面。</li>
<li>通过等离子体键合将PDMS微流控通道与洁净的0号厚度（80–130 μm）盖玻片结合。将盖玻片-微流控组件在100 °C下加热至少15分钟。</li>
</ol>
3. 准备低电导率培养基：
<ol>
<li>通过将 8.5% 蔗糖 + 0.3% 葡萄糖（w/v）溶于去离子水（DI 水）中，制备低电导率培养基。1 
注意：我们先前已证实，细胞在短时间（约 30 分钟）暴露于低电导率环境后，可在常规细胞培养基中继续培养数天。11</li>
</ol>
4. 将微流控通道组装到 PCB 电极上：
<ol>
<li>取少量矿物油（约 10 μL）滴加到 PCB 上，以确保 PCB 与盖玻片之间紧密接触。 
注意：若需减少电极的可视性，可选步骤是在 PCB 表面涂覆一层极薄的黑色永久性记号笔墨或油漆。</li>
<li>将盖玻片-微流控通道组件放置于涂有油的 PCB 上，使盖玻片与油接触（盖玻片朝下）。轻轻按压盖玻片-微流控组件，以确保良好接触，并尽量减少可能影响细胞和微珠观察的气泡。图 1D 展示了组装完成的装置示例。</li>
</ol>
5. 使用介电泳（DEP）对珠子和细胞进行分选与浓缩：
<ol>
<li>用去离子水或低电导率培养基填充微流控通道；等离子体键合过程可使通常具有疏水性的PDMS表面暂时变为亲水性，从而促进水溶液轻松加载至微流控通道中。</li>
<li>将细胞和/或聚苯乙烯微珠引入通道储液池中（图1C）。本实验中使用人结肠腺癌（HT-29）细胞。</li>
<li>将信号发生器的输出端连接至交流功率放大器的输入端，再将放大器的输出端连接至电极导线。使用绝缘胶带覆盖装置中所有电线及带电表面，以防止使用者意外触电。设备连接示意图见图1A。</li>
<li>设置信号发生器以输出频率为1.0–1.5 MHz的正弦波信号。调节输出幅度，使射频功率放大器向PCB输出80–100 V电压。本实验所用射频功率放大器所需的输入电压约为220–330 mV。为实现细胞与微珠的分离，层流流速必须与介电泳力相匹配，以驱动细胞和微珠从主通道（宽度 w = 100 μm，高度 h = 27 μm）进入目标通道（宽度 w = 100 μm，高度 h = 27 μm）。 
注意：请咨询PCB制造商以确定最大工作电压，避免出现PCB过热或熔化等问题。查阅信号发生器和功率放大器制造商的技术规格，确认安全操作参数。</li>
<li>启动介电泳（DEP）以实现细胞与微珠的分选。在指定频率下的非均匀电场中，细胞表现出正介电泳效应，而聚苯乙烯微珠则表现出负介电泳效应。该方法利用低成本且可重复使用的PCB作为电极，在微流控装置中实现基于介电泳力的生物驱动与颗粒分离。</li>
</ol>
6. 代表性结果：
当介电泳（DEP）有效驱动细胞或颗粒时，在静态流体或低流速条件下，可在非均匀电场中观察到细胞或颗粒的稳定排列。在较高流速条件下，细胞或颗粒的行为取决于轴向流动与电场的相对方向以及流速大小。此外，细胞和颗粒的行为还依赖于电场强度以及电场内非均匀程度。细胞或颗粒的典型行为包括形成“珠链”结构、循环运动、停滞或转向。
影响或消除介电电泳（DEP）效应的条件包括：流体中存在盐类或其他离子分子、电场强度过弱、流速过高、盖玻片过厚，或盖玻片与PCB电极之间存在导电溶液（例如，盖玻片出现裂纹可能导致水与矿物油混合）。
此处，当使用厚度为0号（80-130 μm）的盖玻片且电极间距为231 μm时，施加于HT-29细胞和微珠的电场强度平方梯度估计在2-8至6-8 V2/μm3之间。1
通过测量介电泳（DEP）在静止流体中操控的粒子速度，可估算DEP力（图2A-B）。由于粒子惯性较小，且微流控通道环境黏度较高，流体动力学拖曳力将与DEP力大小相等、方向相反。在低电导率介质中，当DEP电压为93 Vpp、频率为1.5 MHz时，微珠的平均速度为34.5 μm/s。流体动力学拖曳力可通过以下公式计算。1
Fdrag = 6πηRv
在20 °C时，低电导率介质的平均黏度η为1.27 mPa•s，微珠半径R为7.5 μm。聚苯乙烯微珠所受流体动力学阻力估计为6.19 pN。为展示在微流控通道内操控微珠的能力（图2C-F），我们利用由表面张力介导的流动来启动低电导率介质的流动。在单一入口通道中，微珠的平均速度为1540 μm/sec，而在各个分支通道内的平均速度则降低至565 μm/sec（图2C）。通过施加介电泳（DEP），微珠被保留在中央通道内，而非进入侧边通道。因此，在这些条件下，介电泳力足以克服流体向两个侧边通道流动时产生的阻力。
通过简单改变通道的取向以及珠粒流动相对于介电泳（DEP）电极的方向，同样原理也可用于将珠粒从中央通道引导至单一侧通道（图2E-F）。当在单入口通道的一侧对金属电极进行倾斜设计后，在启动介电泳时，随着珠粒接近三分岔点，珠粒被引导至通道的一侧。在此处，介电泳力足以将珠粒拉入其中一个侧通道，随后层流持续推动珠粒沿通道向下移动（图2F）。
由于细胞与聚苯乙烯微球在非均匀电场中被极化和驱动的能力存在显著差异，我们利用介电泳（DEP）技术演示了在同一芯片上同时实现细胞与微球分离的能力。我们采用了与图2E-F中相同的微流控通道结构和印刷电路板（PCB）电极，并将含有HT-29细胞与微球的悬浮液在低电导率介质中通过单一入口通道引入（图3）。当施加介电泳力后，在此条件下，HT-29细胞被保留在左侧两个输出通道中，而微球则被保留在右侧单独的输出通道中。在此过程中，细胞在左侧输出通道中聚集时表现出典型的“珍珠链状”行为。偶尔，微球与细胞会相互粘连并一同被捕获，通常出现在细胞的输出通道中。根据该实验数据，我们确定分离速率为每分钟713个颗粒（细胞和微球），相当于20分钟内完成14,260个细胞和微球的分离。所回收的细胞与微球数量对于分子生物学、成像、生物化学以及芯片实验室应用具有重要意义和实用价值。
 <img src="/files/ftp_upload/2545/2545fig1.jpg" alt="用于微珠细胞操控的微流控芯片装置；PCB电极、函数发生器、射频放大器。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 微流控通道中基于PCB的细胞与微粒介电泳（DEP）操控。 （A）基于介电泳的驱动装置配置始于函数发生器，用于设定电信号的频率和振幅，随后通过功率放大器增强施加在PCB上的电场信号强度。（B）用于样本驱动的微流控装置组装包括：通过氧等离子体处理将PDMS微流控通道不可逆地键合至0号厚度盖玻片（80–130 μm），并使用非导电介质浸没细胞和/或微珠。（C）此处使用的PCB电极包含两个电极交错区域，以产生强非均匀电场。（D）组装完成的装置：单个盖玻片上的PCB三叉微流控装置，插图显示整个装置及其电极导线。（C–D）比例参考：PCB尺寸为8.4 cm（长）、2.1 cm（宽），电极宽度为5 mm。
 <img src="/files/ftp_upload/2545/2545fig2.jpg" alt="微流控装置中的介电泳过程；流体控制；实验装置；示意图。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2. 细胞和微珠在通道中施加介电泳（DEP）前后的代表性图像。 （A）在无层流条件下，低电导率培养基溶液中的15 μm荧光聚苯乙烯微珠流经PDMS微流控通道（时间间隔为1.23秒）。（B）启动DEP后，微珠向PCB电极图案（黑色条带）迁移，而非在电极之间移动（时间间隔为8.18秒）。（C）在相同通道中施加层流时，微珠被分配至三个独立通道中（时间间隔为5.3秒）；当启动DEP后（D），微珠被驱动仅沿中央通道流动（时间间隔为4.3秒）。（E）通过改变通道相对于PCB电极的方向，可利用DEP将微珠选择性地引导至侧通道（F），而非如（D）所示进入中央通道。（E–F）的时间间隔分别为8.23秒和5.16秒。所有比例尺 = 100 μm。
 <img src="/files/ftp_upload/2545/2545fig3.jpg" alt="微珠与细胞分选示意图、发光强度标尺、显微镜图像、微分干涉图像。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 介电泳（DEP）作用前后微通道中细胞与微珠的代表性图像。 （A-B）在启动介电泳之前，人结肠腺癌（HT-29）细胞与微珠的混合溶液从一个通道流入三个独立的输出通道。空心箭头指示层流方向，虚线标示通道轮廓，以提供方位参考和清晰说明。（C-D）通过施加介电泳，微珠与细胞被选择性地驱动进入不同的通道。HT-29细胞从中央和左侧通道流出，而微珠则从右侧通道流出。在介电泳作用过程中，可观察到微珠和细胞典型的“珍珠链”状排列。（A, C）微通道中细胞与微珠的微分干涉差（DIC）成像使微珠清晰可见。相同DIC图像（A, C）对应的发光强度标尺图像（B, D）可增强通道中细胞的可视化效果。具有反射性的金属电极（（A, C）中的亮条纹以及（B, D）中的黄色和绿色区域）为微通道与电极的对准提供了显著的定位标志，从而实现有效的基于介电泳的操控。比例尺 = 100 μm。

<ol><li>Park, K., Suk, H. J., Akin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dielectrophoresis-based+cell+manipulation+using+electrodes+on+a+reusable+printed+circuit+board%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Dielectrophoresis-based cell manipulation using electrodes on a reusable printed circuit board.</a> Lab Chip. 9, 2224-2224 (2009).</li>
<li>Nilsson, J., Evander, M., Hammarstrom, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((+et+al.%2C+Review+of+cell+and+particle+trapping+in+microfluidic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)"> et al., Review of cell and particle trapping in microfluidic systems.</a> Anal. Chim. Acta. 649, 141-141 (2009).</li>
<li>Fu, A. Y., Chou, H. P., Spence, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+microfabricated+cell+sorter%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">An integrated microfabricated cell sorter.</a> Anal. Chem. 74, 2451-2451 (2002).</li>
<li>Rhee, S. W., Taylor, A. M., Cribbs, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((External+force-assisted+cell+positioning+inside+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Microdevices%22%5BJournal%5D)">External force-assisted cell positioning inside microfluidic devices.</a> Biomed. Microdevices. 9, 15-15 (2007).</li>
<li>Zhang, H., Liu, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+tweezers+for+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Soc.+Interface%22%5BJournal%5D)">Optical tweezers for single cells.</a> J. R. Soc. Interface. 5, 671-671 (2008).</li>
<li>Hunt, T. P., Westervelt, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dielectrophoresis+tweezers+for+single+cell+manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Dielectrophoresis tweezers for single cell manipulation.</a> Biomed. Microdevices. 8, 227-227 (2006).</li>
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<li>Burgarella, S., Bianchessi, M., Merlo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Modular+Platform+for+Cell+Characterization%2C+Handling+and+Sorting+by+Dielectrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">A Modular Platform for Cell Characterization, Handling and Sorting by Dielectrophoresis.</a> Cytometry A. 77A, 189-18 (2010).</li>
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<li>Vahey, M. D., Voldman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+Cell+and+Particle+Characterization+Using+Isodielectric+Separation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">High-Throughput Cell and Particle Characterization Using Isodielectric Separation.</a> Anal. Chem. 81, 2446-2446 (2009).</li>
<li>Park, K., Jang, J., Irimia, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Living+cantilever+arrays%27+for+characterization+of+mass+of+single+live+cells+in+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Living cantilever arrays' for characterization of mass of single live cells in fluids.</a> Lab Chip. 8, 1034-1034 (2008).</li>
<li>Gomez-Sjoberg, R., Morisette, D. T., Bashir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impedance+microbiology-on-a-chip%3A+Microfluidic+bioprocessor+for+rapid+detection+of+bacterial+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microelectromech.+Syst%22%5BJournal%5D)">Impedance microbiology-on-a-chip: Microfluidic bioprocessor for rapid detection of bacterial metabolism.</a> J. Microelectromech. Syst. 14, 829-829 (2005).</li>
<li>Li, H. B., Zheng, Y. N., Akin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+modeling+of+a+microfluidic+dielectrophoresis+filter+for+biological+species%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microelectromech.+Syst%22%5BJournal%5D)">Characterization and modeling of a microfluidic dielectrophoresis filter for biological species.</a> J. Microelectromech. Syst. 14, 103-103 (2005).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

在微流控装置中对细胞进行操控，可用于单个细胞的分选或选择性定位，也可用于细胞群体研究2。通常结合使用层流、阀门和泵来在微流控装置内操控细胞。然而，仅依靠这些方法具有挑战性，且需要精细的制造工艺和技术3。离心法可简化细胞定位的操作要求，但难以实现同步成像；此外，在设计所需的操控方式时，必须仔细考虑离心作用下的通道结构以及向心力的影响4。激光镊子可用于细胞定位，但该方法成本较高，且不适用于高通量细胞分选5。相比之下，介电泳（DEP）已被证明是一种有效的“电镊”系统，可用于高效的细胞定位、表征与操控6,7。
具体而言，介电泳（DEP）已被用于选择性捕获和分选细胞，以实现对活细胞与死细胞的芯片内处理7-10，以及将细胞收集到共振传感器上用于细胞质量的测量11。我们先前已证明，当施加在细菌或微珠上的介电泳力超过流体拖曳力时，可在芯片上实现聚苯乙烯微珠和Listeria monocytogenes V7的富集与捕获12。E. coli和L. monocytogenes细菌的混合种群也可通过介电泳脉冲进行定向操控与释放。此外，基于较大的粒径，较大颗粒可在电极上被差异性捕获和富集，而较小颗粒则不会被捕获，而是随流体流动被冲走13。当介电泳力不足以克服颗粒所受的流体拖曳力时，微珠或细胞不会被捕获，而是在流体流中发生移动。如图2C所示，微珠可被聚焦至流体流的中央区域，足以使其保留在中央通道内。这可能是由于颗粒间在电场中的相互作用、流体速度高于介电泳拖曳力、上述因素的共同作用，或其他尚未明确的因素所致。
无接触介电泳（DEP）的最新进展使得在最小所需电场下最大化细胞捕获与操控成为可能，从而在介电泳操控过程中最大程度地保护细胞类型。1,9 无接触介电泳为微流控领域提供了在微流控装置内对细胞进行分选、收集和定位的前景。我们预计，随着微流控装置中对介电泳操控技术需求的增加和应用的推广，将进一步推动相关发现与创新，拓展对介电泳力的理解与影响。
印刷电路板（PCB）可通过大规模工艺以较低成本快速制造，使其成为商业化的理想平台。此外，PCB使用简便，便于各学科领域的科研人员进行芯片上的细胞操作与分选。
在设计PCB电极布局时，应考虑目标颗粒/细胞的运动轨迹。需要考虑的关键因素包括颗粒大小和类型（微珠和/或细胞）、细胞类型、微通道尺寸、流速、电极间距（决定电场强度）、盖玻片厚度以及流体电导率。这些因素会影响操控颗粒或细胞所需及可获得的作用力，并最终影响分离效率。本文所展示的方案演示了一种有效启动用于微球和细胞分离的介电泳（DEP）的设置。对于潜在应用，用户应将微流控通道设计的结构与细胞和微珠所需的流动路径相匹配，并优化电极图案，以提高每种应用的效率。在设计微流控通道布局时，可依据先前报道的指导原则选择合适的电极间距和盖玻片厚度。1
细胞/颗粒及其周围介质的电导率和介电常数必须存在足够差异，以促进正向或负向介电泳（DEP）的发生，同时保持细胞的完整性。对于球形颗粒，其介电泳极性可由以下 Clausius-Mosotti 因子在 DEP 电压频率 ω 处的复数值的实部确定。
 <img src="/files/ftp_upload/2545/2545eq1.jpg" alt="复介电常数方程；光学研究；复介电函数公式。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Equation 1"> 
公式 1
在该方程中，ε 为介电常数，σ 为电导率，ε* 为复介电常数。下标 p 和 m 分别表示粒子和介质。当细胞的介电常数高于介质，或 Clausius-Mosotti 因子的实部为正值时，粒子的极化程度将高于周围介质。由于电场不均匀，粒子的极化也变得不均匀，从而产生正向介电泳（+DEP）力，使细胞向电场强度较高的区域移动。若细胞的介电常数低于周围介质，或 Clausius-Mosotti 因子的实部为负值，则会发生负向介电泳（-DEP），细胞被推向电场最弱的区域。若细胞与介质的复介电常数大致相等，则无法产生可操控细胞的力。因此，纯水是介电泳粒子操控的优选介质。然而，为避免纯水对细胞造成的渗透压应激，已配制出低电导率介质，以保持电导率不变的同时提高渗透压，从而降低对细胞的渗透压应激。传统的细胞培养基或生理缓冲液（如 DMEM 或 PBS）具有较高的电导率，不适用于介电泳操控。
我们此前还已证明，可使用低电导率培养基通过介电泳（DEP）将细胞捕获在传感器上。在短暂孵育以实现细胞贴壁后，可将低电导率培养基更换为所需的细胞培养基，以支持细胞持续生长数天。11
根据我们的经验，荧光微球的亮度远高于活细胞的荧光信号，因此将微球的强度与活荧光细胞的强度相匹配可能具有挑战性。为了更好地同时观察细胞和微球，我们使用正置显微镜上的微分干涉差（DIC）显微技术进行成像。为了展示细胞和微球，我们采用强度辉光色阶图像呈现数据，该方式保留了宽广的色彩光谱，便于观察。因此，在设计相关研究时，必须考虑成像参数和资源的配置。
综上所述，我们展示了利用介电泳（DEP）将微珠和细胞选择性地驱动至不同通道的能力。随着微流控通道在细胞生物学、生物化学和生物工程应用中日益广泛，介电泳成为细胞捕获、定位和分选的理想技术。印刷电路板（PCB）电极的制备成本低廉且操作便捷，电极易用，且制备迅速，非常适用于介电泳技术的实施。

<table><tbody><tr><td>硅胶184试剂盒（PDMS）</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td>Dow Corning Sylgard</td></tr><tr><td>16号美制线规连接导线</td><td>Belden</td><td>8521</td><td>(型号 MW) Mil-W-76C-PVC</td></tr><tr><td>金封盖玻片</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>260320</td><td>0号厚玻片，24 × 60 mm</td></tr><tr><td>Miltex活检打孔器</td><td>VWR国际公司</td><td>95039-104</td><td>Miltex，多种尺寸</td></tr><tr><td>定制PCB电极</td><td>Bay Area Circuits</td><td>定制部件</td><td></td></tr><tr><td>矿物油</td><td>费希尔科技公司</td><td>O121-1</td><td></td></tr><tr><td>去离子水</td><td>实验室去离子水供应</td><td>无</td><td>使用过滤的去离子水</td></tr><tr><td>无水D-葡萄糖颗粒，分析纯</td><td>默克化工有限公司</td><td>4912-06</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖，晶体</td><td>默克化工有限公司</td><td>8360-06</td><td></td></tr><tr><td>荧光聚合物微球</td><td>Bangs Laboratories</td><td>FS07F/9277</td><td>15&amp;#x03BC;m 龙绿微球</td></tr><tr><td>HT-29细胞系</td><td>美国典型培养物保藏中心（ATCC）</td><td>HTB-38D</td><td>人结肠腺癌细胞</td></tr><tr><td>0.05% EDTA胰蛋白酶</td><td>英潍捷基公司（Invitrogen）</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse E600FN直立荧光显微镜</td><td>尼康仪器公司</td><td>Eclipse E600FN</td><td></td></tr><tr><td>Phantom V310高速成像相机</td><td>Phantom</td><td>V310</td><td></td></tr><tr><td>BX51直立研究用显微镜</td><td>奥林巴斯公司</td><td>BX51</td><td></td></tr><tr><td>SpotFlex高分辨率彩色相机</td><td>诊断仪器公司</td><td>FX1520</td><td></td></tr><tr><td>函数发生器</td><td>安捷伦科技公司</td><td>3325A</td><td></td></tr><tr><td>射频功率放大器</td><td>EIN</td><td>2100L</td><td></td></tr></tbody></table>

使用介电泳和层流在多通道微流控装置中分离微珠与细胞

Separating Beads and Cells in Multi-channel Microfluidic Devices Using Dielectrophoresis and Laminar Flow

微流控设备通过在细胞尺度上提供动态的流体环境，推动了细胞研究的发展，可用于细胞的观察、操控、分选和计数。然而，在流体环境中对细胞进行操控仍然具有挑战性，通常需要复杂的制造工艺来构建阀门和电极，或依赖光镊等专用设备。本文中，我们展示了如何利用传统印刷电路板（PCB）结合介电泳（DEP）技术，在层流场中实现对微珠和细胞的非接触式操控，用于生物驱动，以及在多通道微流控装置中实现细胞与微珠的分离。首先，我们介绍了DEP电极与微流控装置的组装步骤，以及细胞进行DEP实验前的准备流程。接着，我们使用聚苯乙烯微珠对DEP操作性能进行表征。最后，我们展示了在多通道微流控装置中实现微珠与细胞分离的代表性结果。综上所述，介电泳（DEP）是一种在微流控装置内有效操控颗粒（微珠或细胞）的方法。

介电电泳（DEP）是一种有效的细胞操控方法。印刷电路板（PCB）可为微流控装置内的无接触细胞操控提供低成本、可重复使用且高效的电极。通过将基于PDMS的微流控通道与覆盖在PCB上的盖玻片相结合，我们展示了在多通道微流控装置内对微珠和细胞进行操控与分离。

微流控装置通过在细胞尺度上提供动态的流体环境，推动了细胞研究的发展，可用于细胞的观察、操控、分选……

本实验的总体目标是利用印刷电路板（PCB）通过介电电泳（DEP）在微流控装置中操控细胞和微珠。该目标的实现首先需要设计并制备PCB电极和微流控通道。实验的第二步是准备PCB微流控组件以及微珠和细胞溶液。该操作流程的第三步是用低电导率培养基填充通道，然后加载微珠和细胞。最后一步是将PCB组件与功率放大器和信号发生器连接，随后启动介电泳（DEP）。最终可获得结果，显示通过介电泳技术在微流控装置中实现细胞与微珠的分离与操控。通常，初学者会遇到困难，因为用户必须理解介电泳（DEP）的基本原理，才能设计出适用于目标细胞或微珠操控、并能与微流控装置配合使用的有效电极。另一方面，使用印刷电路板（PCB）作为电极，使得微流控装置中的细胞和微珠操控技术能够被更广泛的科学领域所采用。该方法的第一步是设计具有理想几何形状的印刷电路板（PCB）电极，以产生非均匀电场。设计完成后，通过商业加工机构订购定制的PCB电极芯片。定制PCB到货后，打开并检查其是否适用于本次演示。该PCB长8.4厘米，宽2.1厘米。金属电极的宽度为五毫米。本示例中，电极包含两条长金属条和两个4.5毫米长的交叉区域，其中电极呈叉指状排列。这些叉指状区域可产生强非均匀电场，从而实现刺激器与PCB电极之间的连接。将一根16号导线放置在电极末端。使用热烙铁将导线固定在PCB的金属区域上，以加热导线。将焊料接触已加热的导线，使少量焊料流入导线中。导线填充焊料后，在焊料冷却过程中保持导线位置不变，移开电烙铁。对印刷电路板上的另一个电气连接重复上述焊接过程。下一步是制备具有理想分支模式的微流控通道。采用标准的微加工技术，使用硅片和 SU-8 光刻胶制作用于定义通道的主模具。该主模具包含一个输入通道和三个目标通道。通道的宽度为100微米，高度为27微米。一旦制备好母模，按10:1的质量比将聚甲基丙烯酸酯（polymethyl LAANE）或PDMS弹性体与固化剂混合，搅拌五分钟。将液态PDMS倒入预制的SU-8母模上，并将液态PDMS置于真空环境中三分钟以去除气泡。如有需要，可重复抽真空过程，以彻底去除所有气泡。如有必要，可使用氮气流去除多余的气泡。将PDMS置于70°C的烘箱中固化两小时。使用剃须刀片将带有微流控通道的 P-D-M-S-S 芯片从晶圆上切下，注意避免损坏通道面朝上的晶圆。使用活检打孔器在微流控装置上打孔，用于引入流体和细胞。修剪。多余的PDMS。检查微流控装置，确保其无灰尘和碎屑。使用3M Scotch Magic胶带清洁PDMS。将PDMS通道和一块厚度为80至130微米的洁净零号盖玻片暴露于等离子气体中处理1.5分钟。将PDMS芯片和盖玻片从等离子清洗仪中取出，置于培养皿中进行等离子键合，使PDMS微流控通道面朝下贴合在盖玻片上。将该盖玻片-微流控装置组装体置于设定为100摄氏度的加热板上，加热至少15分钟。制备微流控装置的最后一步是将PDMS通道与盖玻片组合体对准并放置在PCB电路板的电极上方。首先，在PCB上放置约10微升矿物油。为确保PCB与盖玻片之间紧密接触，将带有盖玻片的微流控通道组件置于涂有油的PCB上。轻轻按压使盖玻片微流控组件与油接触，确保良好贴合，并尽量减少可能影响细胞和微珠观察的气泡。另一个重要步骤是配制低电导率培养基混合液，即在去离子水中按质量体积比加入8.5%蔗糖和0.3%葡萄糖。微流控装置现已准备就绪，可使用移液器向每条微流控通道中加入15至20 µL低电导率培养基（必要时）。使用真空抽吸法去除通道中的任何气泡。下一步是将测试颗粒引入微流控装置中。本实验采用每微升低电导率介质中含有550个聚苯乙烯微球的悬浮液，由于微球随时间可能发生沉降，因此在使用前需通过振荡重新悬浮。然后用移液器将200微升的聚苯乙烯微球悬浮液注入通道中。下一步是准备电极，将信号发生器的输出端连接到交流功率放大器的输入端，然后将放大器的输出端连接到电极导线上。使用绝缘胶带覆盖装置的所有电线和带电表面，以保护使用者免受潜在电击风险。将函数发生器设置为输出频率为1至1.5兆赫兹的正弦波。启动介电泳（DEP）以开始在此装置中对细胞和微珠进行分选。入口通道位于右侧，三个目标通道在三分叉连接处分开。PCB电极对应于无层流且无介电泳（DEP）时的黑色条带区域。在启动介电泳但无流体流动时，微珠基本保持静止。当层流开启时，微珠向PCB电极迁移，并远离电极之间的区域。但当DEP关闭时，流经入口通道的微珠被分配到三个目标通道中。当启动DEP且层流开启时，微珠被驱动仅在中央通道中流动。在接下来的视频中，微流控装置在PCB电极上方旋转，导致通道的方向发生改变。关于PCB电极，进样通道在层流开启时，相对于PCB电极的方向由原先的垂直变为几乎平行。但在介电泳（DEP）关闭时，微珠会均等地进入全部三个目标通道。当介电泳（DEP）启动时，微珠向三分叉点移动，DEP 力将微珠拉入电极上方的侧通道。视频中的下一组图像显示了人结肠腺癌细胞（HT-29 细胞）与荧光微珠的混合物在微流控装置中的情况。在此微分干涉差（DIC）图像中，空心箭头指示层流流动方向，通道以虚线标出。反射性金属电极呈现为明亮的背景条带，采用微分干涉差（DIC）显微镜对发光的微珠进行成像。通过调整强度尺度，使细胞在图像中更加清晰可见。该图与另一幅图像是同一图像，只是以辉光强度图的形式显示，因此可以同时观察细胞和微珠。在本图中，反射性金属电极显示为黄色和绿色条纹。在介电泳（DEP）作用下，微珠从右侧通道流出（如微分干涉差（DIC）图像所示），而HT 29细胞则在启动DEP之前从中央和左侧通道流出（如辉光强度图所示）。细胞与微珠的混合溶液从一个入口通道流入三个独立的目标通道。在诱导介电泳（DEP）后，微珠和细胞被选择性地驱动进入不同的通道。观看本视频后，您应能够充分理解如何开始在微流控装置中实施介电泳以操控细胞和微珠。

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生物工程

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