使用介电泳和层流在多通道微流控装置中分离微珠与细胞

本实验的总体目标是利用印刷电路板（PCB）通过介电电泳（DEP）在微流控装置中操控细胞和微珠。该目标的实现首先需要设计并制备PCB电极和微流控通道。实验的第二步是准备PCB微流控组件以及微珠和细胞溶液。

该操作流程的第三步是用低电导率培养基填充通道，然后加载微珠和细胞。最后一步是将PCB组件与功率放大器和信号发生器连接，随后启动介电泳（DEP）。最终可获得结果，显示通过介电泳技术在微流控装置中实现细胞与微珠的分离与操控。

通常，初学者会遇到困难，因为用户必须理解介电泳（DEP）的基本原理，才能设计出适用于目标细胞或微珠操控、并能与微流控装置配合使用的有效电极。另一方面，使用印刷电路板（PCB）作为电极，使得微流控装置中的细胞和微珠操控技术能够被更广泛的科学领域所采用。该方法的第一步是设计具有理想几何形状的印刷电路板（PCB）电极，以产生非均匀电场。

设计完成后，通过商业加工机构订购定制的PCB电极芯片。定制PCB到货后，打开并检查其是否适用于本次演示。该PCB长8.4厘米，宽2.1厘米。

金属电极的宽度为五毫米。本示例中，电极包含两条长金属条和两个4.5毫米长的交叉区域，其中电极呈叉指状排列。这些叉指状区域可产生强非均匀电场，从而实现刺激器与PCB电极之间的连接。

将一根16号导线放置在电极末端。使用热烙铁将导线固定在PCB的金属区域上，以加热导线。

将焊料接触已加热的导线，使少量焊料流入导线中。导线填充焊料后，在焊料冷却过程中保持导线位置不变，移开电烙铁。对印刷电路板上的另一个电气连接重复上述焊接过程。

下一步是制备具有理想分支模式的微流控通道。采用标准的微加工技术，使用硅片和 SU-8 光刻胶制作用于定义通道的主模具。该主模具包含一个输入通道和三个目标通道。

通道的宽度为100微米，高度为27微米。一旦制备好母模，按10:1的质量比将聚甲基丙烯酸酯（polymethyl LAANE）或PDMS弹性体与固化剂混合，搅拌五分钟。将液态PDMS倒入预制的SU-8母模上，并将液态PDMS置于真空环境中三分钟以去除气泡。

如有需要，可重复抽真空过程，以彻底去除所有气泡。如有必要，可使用氮气流去除多余的气泡。将PDMS置于70°C的烘箱中固化两小时。

使用剃须刀片将带有微流控通道的 P-D-M-S-S 芯片从晶圆上切下，注意避免损坏通道面朝上的晶圆。使用活检打孔器在微流控装置上打孔，用于引入流体和细胞。修剪。

多余的PDMS。检查微流控装置，确保其无灰尘和碎屑。使用3M Scotch Magic胶带清洁PDMS。

将PDMS通道和一块厚度为80至130微米的洁净零号盖玻片暴露于等离子气体中处理1.5分钟。将PDMS芯片和盖玻片从等离子清洗仪中取出，置于培养皿中进行等离子键合，使PDMS微流控通道面朝下贴合在盖玻片上。将该盖玻片-微流控装置组装体置于设定为100摄氏度的加热板上，加热至少15分钟。制备微流控装置的最后一步是将PDMS通道与盖玻片组合体对准并放置在PCB电路板的电极上方。

首先，在PCB上放置约10微升矿物油。为确保PCB与盖玻片之间紧密接触，将带有盖玻片的微流控通道组件置于涂有油的PCB上。轻轻按压使盖玻片微流控组件与油接触，确保良好贴合，并尽量减少可能影响细胞和微珠观察的气泡。

另一个重要步骤是配制低电导率培养基混合液，即在去离子水中按质量体积比加入8.5%蔗糖和0.3%葡萄糖。微流控装置现已准备就绪，可使用移液器向每条微流控通道中加入15至20 µL低电导率培养基（必要时）。使用真空抽吸法去除通道中的任何气泡。

下一步是将测试颗粒引入微流控装置中。本实验采用每微升低电导率介质中含有550个聚苯乙烯微球的悬浮液，由于微球随时间可能发生沉降，因此在使用前需通过振荡重新悬浮。然后用移液器将200微升的聚苯乙烯微球悬浮液注入通道中。

下一步是准备电极，将信号发生器的输出端连接到交流功率放大器的输入端，然后将放大器的输出端连接到电极导线上。使用绝缘胶带覆盖装置的所有电线和带电表面，以保护使用者免受潜在电击风险。

将函数发生器设置为输出频率为1至1.5兆赫兹的正弦波。启动介电泳（DEP）以开始在此装置中对细胞和微珠进行分选。入口通道位于右侧，三个目标通道在三分叉连接处分开。

PCB电极对应于无层流且无介电泳（DEP）时的黑色条带区域。在启动介电泳但无流体流动时，微珠基本保持静止。当层流开启时，微珠向PCB电极迁移，并远离电极之间的区域。

但当DEP关闭时，流经入口通道的微珠被分配到三个目标通道中。当启动DEP且层流开启时，微珠被驱动仅在中央通道中流动。在接下来的视频中，微流控装置在PCB电极上方旋转，导致通道的方向发生改变。

关于PCB电极，进样通道在层流开启时，相对于PCB电极的方向由原先的垂直变为几乎平行。但在介电泳（DEP）关闭时，微珠会均等地进入全部三个目标通道。

当介电泳（DEP）启动时，微珠向三分叉点移动，DEP 力将微珠拉入电极上方的侧通道。视频中的下一组图像显示了人结肠腺癌细胞（HT-29 细胞）与荧光微珠的混合物在微流控装置中的情况。在此微分干涉差（DIC）图像中，空心箭头指示层流流动方向，通道以虚线标出。

反射性金属电极呈现为明亮的背景条带，采用微分干涉差（DIC）显微镜对发光的微珠进行成像。通过调整强度尺度，使细胞在图像中更加清晰可见。

该图与另一幅图像是同一图像，只是以辉光强度图的形式显示，因此可以同时观察细胞和微珠。在本图中，反射性金属电极显示为黄色和绿色条纹。在介电泳（DEP）作用下，微珠从右侧通道流出（如微分干涉差（DIC）图像所示），而HT 29细胞则在启动DEP之前从中央和左侧通道流出（如辉光强度图所示）。细胞与微珠的混合溶液从一个入口通道流入三个独立的目标通道。

在诱导介电泳（DEP）后，微珠和细胞被选择性地驱动进入不同的通道。观看本视频后，您应能够充分理解如何开始在微流控装置中实施介电泳以操控细胞和微珠。