制备及体外磁共振成像基于树状大分子造影剂的表征

该程序的总体目标是展示树枝状顺磁螯合物的制备和表征，该螯合物可用作磁共振成像的造影剂，并证明其在成像实验中的性能。这种方法可以帮助回答 MRI 造影剂领域的关键问题，例如树突状造影剂的性质和功效。该技术的主要优点是可以方便地制备具有高蛋白的高效 MRI 造影剂，从而确保其易于表征。

该方法可以扩展到树枝状 MRI 造影剂的进一步结构修饰和功能优化，这与潜在的体内应用具有重要意义。其影响延伸到生物医学研究和诊断成像，因为树突状造影剂的高分子量会导致更长的组织保留时间并显着增强 MRI 信号。首先，将 1 克大环前体 DO3A 三丁酯溶解在 5 毫升 DMF 中。

加入 0.67 克碳酸钾，在室温下搅拌 45 分钟。在一小时内分次加入 0.87 克叔丁基-2-溴-4-丁硝酸丁苯酯，并在一小时内继续搅拌反应混合物 18 小时。然后，在 40 至 60 摄氏度下用球对球真空蒸馏去除 DMF。

用硅胶柱色谱纯化残留物，得到圆形固体。将 1 克固体溶解在 10 毫升乙醇和 150 微升 7 正常氨溶液的甲醇混合物中。在活性炭上加入 150 毫克钯，并在加氢器中设置瓶式反应器。

在 2.5 bar 氢气气氛下摇动混合物 16 小时。将硅藻土的乙醇悬浮液倒入烧结玻璃漏斗中，通过硅藻土过滤反应混合物，除去钯碳催化剂。在旋转蒸发器上从滤液中去除溶剂。

所得固体溶解在 15 毫升二氯甲烷和四种等效的三乙胺中。为此，加入 1.3 当量的硫代磷酸气，并在室温下搅拌混合物 16 小时。在旋转蒸发器上从反应混合物中除去溶剂，并用硅胶柱色谱纯化残留物，得到浅棕色固体的 DOTA 型单体。

通过在 40 摄氏度的旋转蒸发器上蒸发溶剂，从 10% 甲醇溶液中制备 66.7 毫克 G4 PAMAM 树枝状大分子。将树枝状大分子溶解在 4 毫升 DMF 中。将 0.105 毫升三乙胺加入树枝状大分子溶液中，并在 60 摄氏度下搅拌 45 分钟。

然后在一小时内分次加入 354 毫克单体。在 45 摄氏度下继续搅拌 48 小时。用球对球真空蒸馏去除溶剂。

在室温下将亲脂性凝胶过滤介质溶于甲醇中 3 小时，以填充体积排阻色谱柱。使用甲醇作为洗脱液收集 1 mL 馏分。通过 TLC 分析馏分。

在旋转蒸发仪上从含有受保护的树突状螯合剂的馏分中去除溶剂。获取化合物的质子 NMR 谱图，并整合芳香族和脂肪族区域。使用这些值，确定与 G4 PAMAM 树状大分子偶联的受保护 DOTA 型大环的数量。

为了脱保护产品，将固体溶解在 5 毫升甲酸中，并在 60 摄氏度下搅拌混合物 36 小时。用旋转蒸发器除去甲酸。将从旋转蒸发器中去除的残留物冷冻干燥，以获得树枝状螯合剂。

使用质子 NMR，确定与树状大分子偶联的大环单元的数量。将冻干螯合剂溶于水中。使用 0.1 摩尔氢氧化钠将溶液 pH 值调节至 7.0。

在 4 小时内，将 113 毫克氯化钆 III 溶液滴加到 1 毫升水中加入螯合剂溶液中。定期用 0.05 摩尔氢氧化钠将 pH 值调节至 7.0。在室温下搅拌混合物 24 小时。

然后，在 4 小时内分次加入 158 毫克 EDTA，根据需要将 pH 值校正回 7.0。在室温下再搅拌 24 小时。将体积排阻色谱柱与在水中溶胀的亲水性凝胶过滤介质一起填充。

浓缩反应混合物，将混合物加载到色谱柱上，并用去离子水洗脱。将纯化的样品放入 3 千道尔顿离心过滤器装置中，以 1， 800 倍 g 的速度离心 30 分钟。重复过滤约五次以去除多余的钆和 EDTA。

通过二甲酚橙测试确认滤液中不存在游离钆离子。从过滤的样品中去除挥发物并冷冻干燥残留物以获得树枝状造影剂。制备浓度在 5 至 10 毫摩尔之间的 DCA 水储备液。

为了确定精确的 DCA 浓度，首先将 360 微升储备液与 60 微升 D2O 和叔丁醇标准品混合。将 400 微升样品放入外部 NMR 管中。将含有叔丁醇和水参比溶液的同轴 NMR 插入管放入样品管中。

获取质子 NMR 谱并测量参比溶液和样品溶液的叔丁醇信号之间的频移。使用所示公式计算 DCA 浓度，校正样品中添加的叔丁醇。以相同的方式测定市售 GdDOTA 溶液的浓度。

将 DCA 和 GdDOTA 溶液放入 HEPES 缓冲液中，并将水控制器置于两组塑料瓶中。盖上带盖的样品瓶，确保没有气泡。将 0.01 和 0.02 毫摩尔 DCA 样品、一个 0.5 和 1.0 毫摩尔 GdDOTA 样品以及两个水对照品水平加载到 60 毫升注射器中。

通过将第二组样品装入第二个 60 mL 注射器中来重复此过程。用 1 毫摩尔 GdDOTA 溶液填充每个注射器，并盖上注射器尖端。将其中一个注射器水平放置在 MRI 扫描仪中，使样品相对于扫描仪垂直。

将注射器滑入扫描仪的中心。选择解剖扫描，将注射器定位在磁体的等中心。然后按下红绿灯按钮，调整初始扫描参数并开始扫描。

选择快/慢角度拍摄方法进行 T1 加权成像，或选择带松弛增强的快速采集方法进行 T2 加权成像。使用定位器扫描为垂直对齐的样品选择冠状切片。优化 Contrast to Noise 采集参数并采集图像。

使用圆形 ROI 确定背景和每个样品的平均信号幅度和标准偏差。计算信噪比。NMR、MALDI-TOF MS 和元素分析表明，平均有 49 个大环单元与 G4 PAMAM 树状大分子偶联。

DCA 溶液的浓度以及纵向和横向弛豫时间也用 NMR 测定。将获得的弛豫值与市售和临床使用的 GdDOTA 单体进行比较。还将 DCA 性能与 GdDOTA 单体进行了比较。

两组溶液具有相似的钆浓度（由共轭大环单元的数量确定），另外两组溶液具有相似的分子浓度。在钆浓度相似的 T1 加权成像实验中，DCA 的信噪比略高于 GdDOTA。当溶液的分子浓度相似时，DCA 信噪比约为 GdDOTA 的三倍。

在 T2 加权成像实验中，DCA 的信噪比在两个浓度对中均显著低于 GdDOTA，尤其是在较高的 DCA 浓度下。看完这个视频，你应该对如何制备纯化和表征的基于树枝状大分子的 MRI 造影剂有一个很好的了解。按照此程序，可以通过修改分子的单位来制备不同类型的树突状和纳米级 MRI 造影剂并方便地进行分析。

掌握这项技术后，MRI 造影剂开发领域的研究人员应该能够准备一系列特异性探针来执行对当代分子成像至关重要的各种功能研究。