研究线粒体结构与功能果蝇卵巢

该程序的总体目标是展示研究模式生物黑腹果蝇活组织和固定组织中线粒体结构和功能的方法。这种方法可以帮助回答线粒体生物学领域的关键问题。如线粒体功能的调控机制。

该技术的主要优点是它可以对线粒体结构/功能关系进行详细分析。根据文本方案分选出 5 只麻醉的雌性苍蝇后，在解剖显微镜下，用两对镊子将胸部从腹部切断。然后，小心地将腹部转移到培养皿的第二个井中。

用一对镊子将腹部固定在后端，用另一对镊子慢慢推出卵巢。然后用镊子固定不透明的后端，小心地将其移动到培养皿的第三个孔中进行梳理或固定。小心地从卵巢周围梳理保护套，用一对镊子固定后端，然后用梳理针从后端轻轻扫到前端。

要制备聚赖烯涂层腔室，将两滴单独的 20 微升聚赖烯滴放在玻璃底培养皿的盖玻片上。将板在 37 摄氏度下风干 1 小时，并在板的底部勾勒出聚赖氨酸的轮廓。通过打开图像采集软件在共聚焦显微镜上设置扫描参数，然后在采集选项卡中设置适当的扫描参数。

选中 Time series（时间序列）、bleaching（漂白）和 regions（区域）复选框以打开各个选项卡。然后，在每个选项卡中输入相应的采集参数值。接下来，将一个解剖和梳理的卵巢放在标记的聚赖氨酸涂层区域，并使用梳理针展开卵巢并分离卵巢。

将 10 微升昆虫解剖培养基滴在子房顶部，确保覆盖整个聚赖氨酸包被区域。然后，盖上培养皿。安装卵巢后，立即将样品放在显微镜载物台上，并使用目镜快速定位活组织中的感兴趣区域。

单击实时以获取所选感兴趣区域的实时图像，然后单击停止实时扫描。如有必要，调整采集参数，使检测到的荧光信号低于饱和度水平，并通过调整偏移值设置定义的背景。在图形选项卡中，使用贝塞尔绘图工具绘制一个小的 ROI，以在通过扫描获取的图像上划定照片漂白区。

然后通过单击 Start experiment 进行图像采集。要使用荧光线粒体染料进行活体染色，请在温热的解剖培养基中将染色剂原液稀释至最终工作浓度。在前面演示解剖和梳理后，将卵巢放入解剖皿孔中的 200 微升染色溶液中。

用铝箔包裹的盒子盖住培养皿，使其避光，并将组织孵育 10 分钟。接下来，用镊子清洗染色的卵巢，小心地将它们移动到三个连续的含有无染色培养基的孔中。对于与 TMRE 的共染色，在兼容的整体线粒体染色中，首先使用 TMRE 进行染色，然后在不洗涤组织的情况下，立即将样品转移到整个线粒体染色中。

如本视频前面所示，清洗和安装卵巢后，要对样品进行共聚焦成像，请选中 z 切片框以打开选项卡。在实时扫描样品时，将聚焦轮转向样品底部，然后单击 set-first 以定义最底部的 z 截面。然后，向相反方向移动聚焦轮以定义最顶部的部分。

通过单击 Start experiment 来执行图像采集。在活体 xvivamicroscopy 的情况下，应在组织安装后 15 分钟内获得数据，否则，由于组织死亡，实验结果可能会受到生理学改变的影响。解剖后，立即在通风橱下将卵巢放入玻璃解剖皿孔中的 200 微升新鲜室温 PFA 中。

将组织孵育 15 分钟以固定它。根据文本方案在 PBS 中洗涤卵巢后，仍在 PBS 中，挑逗卵巢以小心去除可能阻碍抗原从抗体进入的保护纤维鞘。通过将逗弄的卵巢放入含有 500 微升 0.5% Tritan x 100 in PBS 的微熔丝管中，使它们透化。

接下来，将试管放入有盖的盒子中，以 25 RPM 的速度摇动 30 分钟。根据文本方案去除 PBS/TX，加入 200 微升溶解在 0.5% PBS/TX 中的 BSA，封闭组织。将样品在摇床上室温孵育 1 小时。

去除封闭溶液后，添加抗狂犬病 desycline E 和抗小鼠 ATPB 抗体。将组织在摇床上室温孵育 2 小时。孵育后，使用 PBS-TX 洗涤卵巢 3 次，每次 15 分钟。

然后，加入 200 μL 适当的二抗和新鲜的 PBS-TX，并在室温下孵育 1 小时。将纸巾清洗两次后，在第三次清洗中加入钩子。然后用 1 毫升微量移液管将免疫染色的卵巢从微量熔注管中取出，放入含有 200 微升 PBS 的玻璃解剖皿的新鲜孔中。

将一滴基于甘油的封固剂添加到载玻片中，并将免疫染色的卵巢逐个加入到封固剂中。在解剖显微镜下，用镊子握住卵巢的不透明部分，用梳理针轻轻地从不透明的成熟卵室中拔出透明的卵巢。然后，从封固剂中取出成熟的蛋室。

将盖玻片放在载玻片上，轻轻按压以确保封固剂均匀扩散。将样品风干 15 分钟，然后使用指甲油密封边缘。最后，根据需要进行共聚焦显微镜检查。

如此处所示，针对与 nerse 细胞相关的线粒体云之一的翻转导致红色翻转 ROI 周围的蓝色和白色 ROI 的荧光信号在 200 秒内损失超过 50%，而黄色对照 ROI 的漂白程度最低。果蝇卵巢随着组织深度的增加而表现出信号减弱，重要的是要辨别在实时成像过程中可以检测到 TMRE 和丝裂染色等韧皮细胞的组织的最大深度。与 TMRE 和整体线粒体染色的共染色的定性分析表明，Drisophilla germarium 在 2B 期每单位质量中表现出更高的线粒体电位。

在该图中，半定性分析表明，从第 9 阶段卵室分析的 AFC 和 MBC 之间每单位质量的线粒体电位存在差异。这些图像显示，有丝分裂的摄取发生在有丝分裂和有丝分裂后的 drisophilla 卵泡细胞中。在该实验中，免疫共染色鉴定出与线粒体 ATPB 信号和 GFP 阴性 DRP1 nole 克隆重叠的升高的脱环蛋白信号在天竺中和第 9 阶段卵室中。

所描述的方法可以修改并用于研究其他 Drisophilla 组织中的线粒体结构功能。看完这个视频，你应该对如何解剖、染色和成像固定和活的 drisophilla 卵巢有一个很好的了解，以研究线粒体的结构和功能。