Name: 研究线粒体结构与功能果蝇卵巢 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: 学习利用黑腹果蝇卵巢研究线粒体结构与功能的方法，包括活体和固定组织的显微成像技术。该方法可深入分析线粒体结构与功能的关系，为线粒体生物学研究提供重要实验框架。

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我们感谢 Leena Patel 和 Diamond Woodard 提供的帮助 黑腹果蝇 培养基制备，以及 Igor Chesnokov 博士提供带摄像头体视显微镜的使用权限。

1. 准备 果蝇 （所需工具如图2A所示）
<ol>
	<li>对于所描述的任何实验，收集羽化后 5 天内的 Drosophila （在室温或 25 ºC 下培养），放入含有 5 - 7 mL Drosophila 食物的试管中（参见材料表），每管不超过 25 只果蝇；保持雌:雄比例为 2:1。</li>
	<li>撒入少量颗粒状酵母以促进 Drosophila 产卵。在 2 - 4 天内进行实验操作。</li>
</ol>
2. Drosophila 卵巢的解剖（所需工具如图 2A 所示）
<ol>
	<li>温热的昆虫解剖培养基（参见 材料表)至室温，25 &#176;C. 在八孔玻璃解剖皿中，向三个孔内各加入 200 &#181;每孔加入 L 培养基。</li>
	<li>麻醉 果蝇 与 CO2 通过将吹枪的针头置于小瓶塞下方吹气。将果蝇放在果蝇垫上。使用解剖显微镜，挑选出5只雌蝇，放入解剖皿的第一个孔中。每次操作一只 果蝇 进行活细胞显微观察时</li>
	<li>通过解剖显微镜的目镜观察，使用两把镊子将胸部与腹部分离。用镊子小心地将腹部转移至培养皿的第二个孔中。</li>
	<li>用一对镊子夹住腹部后端，用另一对镊子缓慢将卵巢（连同其他腹部内容物）推出。若此操作失败，可将镊子插入前端，小心去除腹部外骨骼以释放卵巢。</li>
	<li>使用镊子夹住单个卵巢不透明的后端即， 将充满卵黄的晚期卵子小心转移至培养皿的第三个孔中，用于后续活体显微观察（步骤3）或固定后进行免疫染色（步骤7）的处理。</li>
	<li>用镊子夹住卵巢后端，同时用解剖针轻轻从每个卵巢的后端向前端扫动，仔细将卵巢周围的保护鞘剥离。 
	注意： 为尽量减少解剖过程中的损伤，可弯曲解剖针尖端，并通过提高显微镜的放大倍数来对每个卵巢进行放大观察图 2A解剖时应充分分离以破开外鞘，但操作需谨慎，以保持卵管的完整性。</li>
</ol>
3. 活体组织显微镜观察的准备工作
注意： 所需工具如图2A所示。
<ol>
	<li>在解剖Drosophila之前，准备聚-L-赖氨酸（polyL-Lysine）包被的腔室。具体操作为：在玻璃底培养皿（35 mm）的盖玻片（14 mm，No. 0）上，滴加两滴20 µL的聚-L-赖氨酸溶液（0.1 mg/mL），两滴之间保持适当距离，以防合并。将培养皿在37 ºC下风干1小时，并用可擦除记号笔在培养皿底部标记白色聚-L-赖氨酸膜的边缘位置。 
	注意：聚-L-赖氨酸包被的腔室可在4 °C下保存一周。若使用预先包被的腔室，需在开始解剖Drosophila前将其恢复至室温。</li>
	<li>在共聚焦显微镜上设置扫描参数，以确保样品在完成解剖和封片后可立即进行成像，具体如下。</li>
	<li>将一个已解剖并分离的卵巢（按步骤2操作，如需染色则按步骤5操作）置于标记好的聚-L-赖氨酸包被区域上，用解剖针轻轻拨散以分离各卵管。在卵巢上方滴加10 µL昆虫解剖液，确保完全覆盖聚-L-赖氨酸包被的区域。盖上培养皿盖。</li>
	<li>立即在室温下对封片后的样品进行共聚焦显微成像。 
	注意：每次仅解剖、处理并成像一只Drosophila。此外，不应在37 °C下进行显微成像，以免对Drosophila组织造成热激效应。</li>
</ol>
4. 荧光漂白丢失（FLIP）检测法评估线粒体基质连续性
注意： 融合的线粒体结构中，线粒体基质的连续性是在线粒体内外膜完全融合后建立的，这一过程需经历一系列中间步骤。线粒体的分裂可能遵循相同的步骤，但方向相反。图 3A）。FLIP 是一种基于延时显微成像的半定量方法，可用于评估线粒体在最终融合状态下的基质连续性 离体 线粒体（步骤 3 和 4 中） 图3A) 在活体中 果蝇 卵巢9. FLIP 实验通过定期对线粒体基质中表达荧光分子的线粒体特定小区域（即光漂白感兴趣区域，FLIP ROI）进行光漂白来实施 图 3A）。因此，任何与FLIP ROI（实验ROI）相连的周围线粒体区域（ 图 3A）会由于连续的线粒体基质中分子交换而导致信号丢失。此处展示的FLIP实验是在转基因个体上进行的 果蝇 表达 mitoYFP，其中包含人细胞色素氧化酶 VIII 亚基的线粒体靶向序列，该序列与 YFP 标记融合，以自由扩散的形式将其靶向定位至线粒体基质。类似的实验也可使用此前报道的 mito pUASP-mito-GFP 转基因进行。9. 可采用类似的FLIP方案，使用靶向线粒体膜间隙的探针，以检测因外膜融合而产生但内膜未融合的连续性（步骤2） 图3A).
<ol>
	<li>打开共聚焦显微镜的图像采集软件，在“采集”选项卡中设置适当的扫描参数（表1）。勾选“时间序列”、“漂白”和“区域”选项，以打开各自的选项卡。在每个选项卡中输入相应的采集参数值（表1）。 
	注意：针孔应保持打开状态，因为本实验旨在监测单个细胞中整个线粒体群体的总体信号。</li>
	<li>使用目镜快速定位固定活体组织中的目标视野。 
	注意：应选择在玻璃底培养皿上充分铺展的卵管，因为共聚焦显微镜无法对漂浮的卵管进行成像。</li>
	<li>点击“实时”以获取所选目标区域的实时图像，点击“停止”以结束实时扫描。</li>
	<li>如有必要，调整采集参数，使检测到的荧光信号低于饱和水平（当勾选“范围指示器”选项时，无红色像素出现），并根据偏移值设定明确定义的背景水平。</li>
	<li>在实时扫描获得的图像上，使用“区域”选项卡中的贝塞尔绘图工具绘制一个小的兴趣区域（ROI），以划定光漂白区域。 
	注意：该兴趣区域的大小应约为细胞内总荧光线粒体信号的20–50%。</li>
	<li>点击“开始实验”以执行图像采集。</li>
	<li>使用专有软件或开源软件（见材料表）对荧光强度进行定量。记录在重复漂白区域（FLIP）内的平均信号；同一细胞中未进行漂白的区域（实验组）；同一视野中另一个未经漂白细胞的区域，用于评估实验期间的整体漂白情况（漂白对照）；以及背景区域的信号（背景）。将其他各区域的平均信号减去背景平均信号，并以相应细胞的初始前漂白信号为基准对荧光信号进行归一化处理。</li>
	<li>使用任意标准绘图软件绘制归一化后的数据。</li>
</ol>
5. 使用荧光线粒体染料进行活体染色
注意：可通过使用特异性地进入活细胞和组织中线粒体的染料来评估稳态下线粒体的结构和膜电位。活体 Drosophila 卵巢可在离体（ex vivo）条件下用荧光线粒体染料进行染色，以观察线粒体形态、评估线粒体活性氧（mito-ROS）的产生水平，以及测定单位质量的线粒体膜电位。该目的可通过联合染色实现：使用线粒体膜电位染料四甲基罗丹明乙酯（TMRE）和一种可兼容的、标记线粒体质量的活细胞线粒体染料（具体染料见材料表）。
<ol>
	<li>将染料储备液用温热的昆虫解剖液稀释至以下终工作浓度：线粒体染料为 250 nM；TMRE 为 50 nM；线粒体 ROS 染料为 5 μM。</li>
	<li>在完成第 2 步的解剖并分离卵巢后，将卵巢放入解剖皿孔中的 200 µL 特定染色液中。将解剖皿用铝箔包裹的合适盒子覆盖以避光，孵育 10 分钟。用镊子小心地将染色后的卵巢依次转移至 3 个盛有不含染料培养基的孔中进行清洗。</li>
	<li>若需使用 TMRE 与兼容的全线粒体染料进行共染，请按照上述方案先用 TMRE 染色，随后立即加入全线粒体染料进行染色（中间无需洗涤步骤）。</li>
	<li>在完成第 3 步后，将卵巢接种于多聚-L-赖氨酸包被的玻璃底培养皿上，并按照相应的扫描参数（表 1）准备共聚焦显微镜观察，具体操作见步骤 4.2–4.4。 
	注意： 尝试将染色样本置于封片剂中封片时，染料的荧光信号无法持久维持。</li>
	<li>勾选 Z 轴层扫选项以打开相应标签页。在样本实时扫描过程中，转动调焦旋钮使其向样本底部移动，点击“set first”以设定最底层的 Z 轴截面。随后将调焦旋钮向相反方向移动，以确定最上层的 Z 轴截面。</li>
	<li>点击“start experiment”开始图像采集。</li>
	<li>对选定区域（ROI）进行背景校正后的荧光强度定量分析（方法同步骤 4.7），使用任意绘图软件对数据进行作图。</li>
</ol>
6. Drp1 缺失嵌合体的制备
注意： 此处使用的克隆策略可在表型正常的野生型背景（该背景在基因型上对 Drp1 无义突变呈杂合状态）中产生绿色荧光蛋白（GFP）阴性的 Drp1 空突变克隆9。通过热激诱导的翻转酶-翻转酶识别靶位点（FLP-FRT）介导的位点特异性有丝分裂重组，可产生功能上无义的 drpKG03815 等位基因的纯合克隆。携带 Drp1 突变体的 Drosophila 基因型为 drpKG03815 FRT40A/CYO，而携带热激诱导的 FLP（hsFLP）及 UbiGFP 克隆标记的基因型为 hsflp; ubiquitin nls-GFP（UbiGFP）FRT 40A/CyO。上述两种基因型杂交后所选后代的基因型为 hsFLP/+; drpKG03815FRT40A/UbiGFPFRT40A。
<ol>
	<li>同步 果蝇 每隔2至3天将果蝇转移至装有新鲜食物的新试管中，以收集处女蝇。每天监测化蛹的试管，以便收集新羽化的处女雌蝇。</li>
	<li>每天早晚各一次收集红眼、卷翅的 Drp1 突变型未交配雌蝇，放入单独的培养瓶中。同时，收集雄蝇 果蝇 具有深红色眼睛和直翅，携带 hsflp 和 UbiGFP，羽化后5天内。</li>
	<li>以2:1的雌雄比例将雄蝇与处女雌蝇进行杂交。</li>
	<li>撒少量颗粒状酵母以促进产卵。 
	注意： 小心移动 果蝇 每2至3天将果蝇转移至装有新鲜培养基的新试管中，以增加子代数量并减少试管内拥挤。</li>
	<li>麻醉、筛选并收集羽化后5天内的直翅红眼雌性子代。</li>
	<li>对于热激处理，将收集的 果蝇 转移到含有少量颗粒状酵母和一小块柔软擦拭纸（用于吸收热激过程中的水分）的空瓶中。将该瓶与 果蝇 在38℃水浴中 &#186;C 孵育 1 小时，以主要生成滤泡细胞克隆，并在 37 &#186;在连续两天内，每天 37 °C 处理 1 小时，每天两次（两次热激之间至少间隔 5 小时），以诱导生殖系和滤泡细胞克隆的产生。 
	注意： 确保小瓶完全浸入水中，直至瓶塞处。</li>
	<li>热激可能会使 果蝇 不移动。让热激后的 果蝇 在室温下恢复1小时，直至重新恢复活动能力。</li>
	<li>将雄性以与杂交时相同的比例重新加入雌性中，并转移至装有撒有少量颗粒状酵母的培养基的新试管中。维持培养 果蝇 至少 5 天。</li>
	<li>根据实验需要解剖卵巢，用于活体或固定样品实验。 
	注意： 从亲本中分离的卵巢 果蝇 表达 UbiGFP 的样本应作为阴性对照，以确认热激可有效诱导产生 GFP 阴性克隆。</li>
</ol>
7. Cyclin E 与线粒体的共免疫染色

注意： 为了检测 Drosophila Cyclin E（dCyclinE），我们使用了一种 commercially obtained 针对 dCyclinE9 的特异性抗体（见材料表）。作为线粒体标记物，我们使用了针对 ATP-B（线粒体ATP合酶复合体的一个亚基）的抗体9。
<ol>
	<li>将4%多聚甲醛（PFA）升温至室温（25 °C）。注意！多聚甲醛具有毒性。 
	注意：打开安瓿后，PFA应于4 °C保存，并在7天内使用完毕。因为PFA储存过程中可能发生氧化生成甲醇，即使痕量存在也会在固定过程中显著改变线粒体膜结构。</li>
	<li>解剖后立即用200 µL新鲜PFA将解剖所得卵巢固定，置于玻璃解剖皿的孔中（暂不分离组织）。将解剖皿置于通风橱中固定15分钟。用镊子小心将固定后的卵巢依次转移至3个盛有200 µL 1×磷酸盐缓冲液（PBS）的孔中进行清洗。 
	注意：实验可在此步骤暂停，样品可在4 °C保存1天。</li>
	<li>在PBS中进一步仔细分离卵巢（操作方式与步骤2.6类似），以小心去除可能阻碍抗体接触抗原的保护性纤维鞘。</li>
	<li>将分离后的卵巢置于含500 µL新鲜配制的0.5% PBS-Triton-X100（PBS-TX）的微量离心管中，于25 rpm振荡条件下孵育30分钟，以进行透化处理。 
	注意：振荡过程中，应将离心管平行于振荡方向放置；若垂直放置，可能导致组织黏附于管盖，造成组织丢失。</li>
	<li>为去除PBS-TX，将微量离心管置于管架上，使组织自然沉降至管底。肉眼观察，必要时轻弹管壁，使漂浮的组织沉降至底部。小心从上层吸除液体，确保管底组织不受扰动。</li>
	<li>加入200 µL含2%牛血清白蛋白（BSA）的0.5% PBS-TX封闭液，于室温在摇床上孵育1小时。按步骤7.5操作去除封闭液。</li>
	<li>在200 µL新鲜封闭液中加入一抗：抗兔dCyclinE抗体（1:100）和抗鼠ATP-B抗体（1:100）。将组织在摇床上于室温孵育2小时。</li>
	<li>按步骤7.5操作，用PBS-TX清洗卵巢3次，每次15分钟。</li>
	<li>在200 µL新鲜PBS-TX中加入适当的二抗：抗鼠CY3（1:1,000）和抗兔CY5（1:500）。于摇床上室温孵育1小时。</li>
	<li>按步骤7.5操作，用PBS-TX清洗卵巢3次，每次15分钟。</li>
	<li>为进行DNA染色，将Hoechst（1:1,000稀释）加入最后一次PBS-TX清洗液中。</li>
	<li>最后，将组织置于500 µL 1× PBS中保存。</li>
	<li>使用1 mL移液器将免疫染色后的卵巢从微量离心管转移至玻璃解剖皿的新孔中，孔内预先加入200 µL PBS。</li>
	<li>在载玻片上滴加一滴甘油基封片剂，然后将免疫染色的卵巢逐个加入封片剂中。 
	注意：确保卵巢确实转移至封片剂中，否则将导致组织丢失。</li>
	<li>在解剖显微镜下，用解剖针轻轻夹住卵巢不透明的成熟卵室部分，用镊子固定，再小心挑出透明的卵管（较年轻阶段），并将成熟卵室从封片剂中移除。</li>
	<li>将盖玻片（22 mm，No. 1）盖在载玻片上，轻轻按压，使封片剂在盖玻片下均匀铺展。 
	注意：按压盖玻片有助于组织在盖玻片下正确排列。若未充分按压，较小阶段的组织可能在封片剂中漂浮，影响显微成像质量。</li>
	<li>将样品在空气中干燥15分钟，然后用指甲油小心封固盖玻片边缘。</li>
	<li>根据实验需求进行共聚焦显微镜观察（表1）。</li>
</ol>

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</ol>

作者无竞争性财务利益。

方案中的关键步骤
光漂白：为实现高效的共聚焦显微镜成像，必须严格防止荧光样品发生过度光漂白。因此，应尽量缩短通过目镜定位样品或通过实时扫描模式设置图像采集参数的时间，以最大限度减少光漂白的发生。
组织损伤：由于线粒体被认为是细胞健康的感应器，因此确保使用所述方法获得的数据具有生理相关性至关重要，这些数据不应反映因解剖Drosophila卵巢操作不当所造成的损伤。解剖过程应尽可能迅速，同时必须极度谨慎以最大限度减少组织损伤。在我们操作下，解剖并分离5个Drosophila卵巢的平均时间为5至7分钟。必须努力识别出显示组织损伤的卵室，并将其排除在分析之外。解剖引起的组织损伤可能包括异常的间隙（*见图9A，表现为信号缺失）、切口或撕裂（*见图9B，表现为信号缺失）或卵室的形变（*见图9C）。然而，由实验操作引起的任何显著卵室形变都应仔细评估。尽管在本...

线粒体通常被称为细胞的“动力工厂”，因为它们是分化细胞中能量生成的主要场所。此外，线粒体在代谢、产热、脂质修饰、钙稳态和氧化还原稳态、细胞信号通路的协调等方面也发挥着关键作用等1。线粒体还积极参与细胞死亡的诱导2以及细胞周期的调控3。这种多功能性引出了以下两个基本问题：a）线粒体如何同时执行这些多种功能？b）是否存在特定的线粒体亚群或亚区域，专门负责不同的功能？在此背景下，值得注意的是，线粒体在单个细胞内的形态、大小和结构具有动态性，且不同细胞类型的线粒体稳态形态可能存在差异。来自多个实验室数十年的研究表明，线粒体形态、大小和结构的改变（统称为线粒体动力学）对于维持多种线粒体功能至关重要4,5,6。 这些发现提示，线粒体可能正是凭借其结构上的动态变化来实现其多功能性的。
目前，人们正在大力研究线粒体结构与功能之间的关系。线粒体结构的动态特性主要依赖于它们相互之间发生分裂与融合的能力。大型线粒体的分裂将其转化为较小的线粒体单元，而两个较小线粒体之间的融合则使它们合并为更大的线粒体单元7此外，两个线粒体之间可能发生瞬时融合，以实现其内容物的混合。线粒体内膜和外膜的分裂与融合事件由特定的蛋白质组精确调控。核心分裂机制由动力相关蛋白1（Drp1）构成，该蛋白通过与某些因子相互作用，从细胞质中被招募至线粒体。 真正有效的 线粒体蛋白（例如， Fis1 或 Mff1），而 Drp1 的功能也可受到线粒体表面其他蛋白质的调控4尽管 Drp1 作用于外膜，但其分裂功能同样会影响内膜。目前，外膜与内膜分裂过程的协调机制尚不明确。另一方面，内膜融合主要由 Opa1 的活性核心调控，而外膜融合则由线粒体融合蛋白（mitofusins）调控。5线粒体分裂与融合事件之间的平衡决定了细胞中线粒体稳态下的形态。例如，抑制线粒体分裂将导致完全且无对抗的融合，而线粒体分裂过度活跃则会引起线粒体碎片化。3.
线粒体结构与功能关系的研究主要涉及两种互补的方法：a）在线粒体分裂/融合蛋白的遗传操作后，分析细胞和生物体的表型；b）对线粒体结构与功能进行直接评估。值得注意的是，遗传学分析并不总能揭示目标分子（此处为线粒体分裂/融合蛋白）的直接功能，因为所观察到的表型可能源于间接或继发效应。因此，开发并使用能够直接研究线粒体结构与功能的工具至关重要。对线粒体结构的任何评估均需借助多种显微技术。活细胞荧光显微镜的应用极大地推动了线粒体动态的研究，因为借助适当的荧光显微镜工具与技术，线粒体的动态行为可实现定性与定量的同步监测。8基于荧光显微镜的技术已被开发用于研究活细胞和固定细胞中线粒体的结构与功能 黑腹果蝇 组织，阐明线粒体动态的重要性 体内9这些及相关方法在此描述，旨在研究线粒体的结构与功能 果蝇 卵巢
果蝇 卵巢由生殖系和体细胞系组成，它们分别起源于位于生殖囊中的成体干细胞10,11。16个合胞体生殖细胞（GCs）被体细胞滤泡细胞（FCs）包裹，形成独立的卵室，这些卵室从生殖囊中依次产生（图1）。在16个GCs中，其中一个被指定为卵细胞，其余15个GCs则发育为滋养细胞，支持卵细胞室的生长，促进卵子在产出前的成熟过程。大多数FCs在退出有丝分裂细胞周期并最终分化为具有特定模式的上皮细胞层之前，会经历9轮有丝分裂，该上皮层包括前端滤泡细胞（AFCs）、后端滤泡细胞（PFCs）和主体细胞（MBCs）。连续的卵室由 stalk 细胞连接，这些stalk细胞是分化细胞，也在发育早期由FCs衍生而来。线粒体裂变蛋白Drp1调控的线粒体形态在果蝇卵巢滤泡细胞层正常发育过程中的分化阶段发挥重要作用9,12。本文描述了这些研究中用于鉴定Drp1在果蝇滤泡细胞层发育中作用的方法。

<table><tbody><tr><td>Grace's 培养基（昆虫解剖培养基）</td><td>Fisher Scientific</td><td>30611031-2</td><td></td></tr><tr><td>41 甲醛水溶液</td><td>Electronic Microscopy Sciences</td><td>50-259-99</td><td></td></tr><tr><td>Mitotracker Green（线粒体总体染色剂）</td><td>Life Technologies</td><td>m7514</td><td>重悬并分装</td></tr><tr><td>四甲基罗丹明乙酯高氯酸盐</td><td>Sigma Aldrich</td><td>87917-25MG</td><td>重悬并分装</td></tr><tr><td>MitoSox（Mito-Ros 染色剂）</td><td>Life Technologies</td><td>m36008</td><td>重悬并分装</td></tr><tr><td>多聚赖氨酸</td><td>MP Biomedicals</td><td>ICN15017625</td><td></td></tr><tr><td>果蝇培养管</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS-515</td><td></td></tr><tr><td>果蝇锥形管</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS-355</td><td></td></tr><tr><td>果蝇培养管塞</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS273</td><td></td></tr><tr><td>果蝇锥形管塞</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS 277</td><td></td></tr><tr><td>Jazzmix 果蝇饲料（Drosophila 饲料）</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS153</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9647-50G</td><td></td></tr><tr><td>Cyclin E 抗体（d-300）</td><td>Santa Cruz</td><td>sc- 33748</td><td></td></tr><tr><td>ATPB 抗体 [3D5] - 线粒体标记物</td><td>AbCam</td><td>ab14730</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure 山羊抗小鼠 IgG（H+L）</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-165-146</td><td></td></tr><tr><td>Cy5 AffiniPure 山羊抗兔 IgG（H+L）</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-175-144</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>VectaShield</td><td>Fisher Scientific</td><td>H100</td><td></td></tr><tr><td>Azer Scientific EverMark Select 显微镜载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-026-252</td><td></td></tr><tr><td>显微镜盖玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>Mat Tek Corp&amp;nbsp;玻璃底细胞培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>P35G-0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>活性干酵母</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN10140001</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM 700</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子</td><td>Fine Science Technologies</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Moria 镍镀针夹</td><td>Fine Science Technologies</td><td>26016-12</td><td></td></tr><tr><td>微型细针</td><td>Fine Science Technologies</td><td>26002-15</td><td></td></tr><tr><td>MYFP（w[*]; P{w[+mC]=sqh-EYFP-Mito}3）</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>7194</td><td></td></tr><tr><td>果蝇操作垫</td><td>Fly stuff</td><td>59-118</td><td></td></tr><tr><td>吹管</td><td>Fly stuff</td><td>54-104</td><td></td></tr><tr><td>吹管针头</td><td>Flystuff</td><td>54-119</td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>分析软件</td><td>Carl Zeiss</td><td>Zen&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>分析软件</td><td>开源</td><td>Image J</td><td></td></tr><tr><td>研究用宏变焦显微镜</td><td>Olympus</td><td>MVX10</td><td></td></tr><tr><td>QICAM Fast 1394 冷却型数字相机，12 位，单色&amp;nbsp;</td><td>QImaging</td><td>QIC-F-M-12-C</td><td></td></tr><tr><td>QCapture Pro 5.1</td><td>QImaging</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

在 drosophila 卵巢中研究线粒体结构与功能

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

线粒体结构与功能关系的分析对于深入理解线粒体功能调控机制至关重要。荧光显微镜是直接评估活细胞中线粒体结构与功能、研究线粒体结构与功能关系不可或缺的工具，而线粒体结构与功能关系主要受调控线粒体分裂与融合事件的分子所调节。本文描述并演示了在模式生物中研究活体及固定组织中线粒体结构与功能的具体方法 黑腹果蝇首选的组织是 果蝇 卵巢，可被分离并处理以适用于 离体 活细胞共聚焦显微镜观察。此外，本文还描述了如何在遗传水平上操控线粒体分裂蛋白 Drp1 果蝇 卵巢以研究 Drp1 驱动的线粒体分裂在调控线粒体结构与功能关系中的作用。这些方法的广泛应用已在已发表的数据和新数据中得到证实。所述方法可进一步拓展用于理解营养物质和/或生长因子对线粒体特性的直接影响 离体鉴于线粒体功能失调是多种疾病病因的基础，本研究在一种遗传上易于操作的模式生物中开发了所述创新方法，果蝇有望显著促进对线粒体结构与功能关系的机制细节的理解，并推动靶向线粒体的治疗策略的开发。

所述方法可用于研究活体或固定后的黑腹果蝇（Drosophila）卵巢中线粒体的结构与功能（图2B）。以下提供了一些使用所述方法可预期获得的结果示例。
解剖 果蝇 卵巢：进一步解剖切断的腹部时（图3B）从整体 果蝇 (图 3A应释放腹腔内容物，包括每个个体的2个卵巢 果蝇完整的卵巢呈卵圆形、白色结构（箭头所示） 图3C 和 D）理想情况下应通过输卵管柄保持相互连接。每侧卵巢中的卵管应由纤维鞘（放大图中的#）维持在一起。 图3C），通过仔细剥离去除（图中粗箭头所示） 图3D；* 表示卵巢组织撕裂严重且卵巢小管已脱落）以暴露卵巢小管，便于染...

要深入理解线粒体功能的调控机制，必须分析线粒体结构与功能之间的关系。本文描述并演示了在活体和固定处理的黑腹果蝇（Drosophila）卵巢中研究线粒体结构与功能的特定方法。

在 Drosophila 卵巢中研究线粒体结构与功能

线粒体结构与功能关系的分析对于深入理解线粒体调控机制至关重要……

本实验的总体目标是展示在模式生物黑腹果蝇（drosophila melanogaster）的活体及固定组织中研究线粒体结构与功能的方法。该方法有助于回答线粒体生物学领域中的关键问题，例如线粒体功能的调控机制。该技术的主要优势在于能够对线粒体的结构与功能关系进行详细分析。按照文本方案将五只麻醉后的雌性果蝇分拣后，在解剖显微镜下，使用两对镊子将胸部与腹部分离。然后，小心地将腹部转移至培养皿的第二个孔中。用一对镊子夹住腹部后端，用另一对镊子缓慢将卵巢推出。然后用镊子夹住单个卵巢不透明的后端，小心将其移至培养皿的第三个孔中，用于解剖或固定。用一对镊子夹住卵巢后端，用解剖针从后端向前端轻轻扫动，小心剥离包裹卵巢的保护鞘。为制备多聚赖氨酸包被的培养腔，将两滴独立的20微升多聚赖氨酸溶液滴加至玻璃底培养皿的盖玻片上。在37摄氏度下空气干燥培养板一小时，并在培养板底部标记出多聚赖氨酸的范围。通过打开共聚焦显微镜的图像采集软件，在采集选项卡中设置相应的扫描参数，以完成扫描参数的设定。选中时间序列、漂白和区域复选框以打开各个标签页。然后，在每个标签页中输入相应的采集参数值。接着，将一个已解剖并分离的卵巢放置在标记好的多聚赖氨酸包被区域上，使用分离针展开卵巢并分离卵巢组织。在卵巢上方放置一滴10微升的昆虫解剖液，确保完全覆盖聚赖氨酸包被的区域。然后盖上培养皿。卵巢固定后立即将其置于显微镜载物台上，通过目镜快速定位活体组织中感兴趣的视野。点击“实时”以获取所选感兴趣区域的实时图像，然后点击“停止”以结束实时扫描。如有必要，调整采集参数，使检测到的荧光信号低于饱和水平，并根据调整偏移值设定的背景进行优化。在图形选项卡中，使用贝塞尔绘图工具在扫描获得的图像上绘制一个小的感兴趣区域（ROI），以标定光漂白区域。然后通过点击“开始实验”进行图像采集。若需使用荧光线粒体染料进行活体染色，请将染料原液用预热的解剖液稀释至工作浓度。在完成前述的解剖和分散操作后，将卵巢放入解剖皿孔中的200微升染色液中。用铝箔包裹的盒子盖住培养皿，以避光，并将组织在其中孵育10分钟。接着，使用镊子将染色后的卵巢小心转移至三个连续盛有不含染料培养基的孔中，进行清洗。若需与TMRE共染色，在使用兼容的全线粒体染料时，应先进行TMRE染色，然后无需洗涤组织，立即将样品转移至全线粒体染料中。按照本视频前面演示的方法清洗并安装卵巢后，若要对样品进行共聚焦成像，请勾选z轴层切（z-sectioning）框以打开相应选项卡。在样品实时扫描的同时，将焦距调节轮向样品底部转动，并点击“set-first”以确定最底部的z轴层面。然后将焦距调节轮向相反方向转动，以确定最顶部的层面。单击“开始实验”以进行图像采集。对于活体xvivamicroscopy，应在组织安装后15分钟内获取数据，否则由于组织逐渐死亡导致的生理变化可能影响实验结果。在通风橱下解剖后，立即将卵巢放入玻璃解剖皿孔中的200微升新鲜室温PFA中。将组织孵育15分钟以进行固定。根据文本方案用PBS洗涤卵巢后，在仍处于PBS中的情况下，轻轻分离卵巢，仔细去除可能阻碍抗体接触抗原的保护性纤维鞘。将分离后的卵巢置于含有500 µL PBS中0.5% Triton X-100的微量离心管中，以进行透化处理。接下来，将离心管放入带盖的盒子中，设置为25 RPM轻轻摇动30分钟。根据文本方案步骤，移除PBS/TX，通过加入200微升溶解于0.5% PBS/TX中的BSA对组织进行封闭。将样品在室温下置于摇床上孵育1小时。除去封闭液后，加入抗兔 desycline E 抗体和抗小鼠 ATPB 抗体。将组织在室温下于摇床上孵育两小时。孵育结束后，用 PBS-TX 洗涤卵巢三次，每次 15 分钟。然后，加入200 µL相应的二抗和新鲜的PBS-TX，室温孵育一小时。洗涤组织两次后，在第三次洗涤中加入钩子。接着用1 mL移液器将免疫染色后的卵巢从微熔管中移至玻璃解剖皿的新孔中，该孔内含有200 µL PBS。在载玻片上加入一滴基于甘油的封片剂，然后将免疫染色后的卵巢逐个加入封片剂中。在解剖显微镜下，用镊子夹住卵巢的不透明部分，用解剖针轻轻剥离透明的卵巢管，使其与不透明的成熟卵室分离。随后，将成熟卵室从封片剂中移除。将盖玻片置于载玻片上，轻轻按压使封片剂均匀分布。样本室温晾干15分钟，然后用指甲油封固边缘。最后根据需要进行共聚焦显微镜观察。如图所示，对与神经细胞相关的线粒体云之一进行光漂白处理后，在200秒内，红色光漂白区域周围蓝色和白色ROI的荧光信号损失超过50%，而黄色对照ROI的荧光信号几乎未发生漂白。果蝇卵巢的信号随组织深度增加而减弱，因此在活体成像过程中，明确TMRE和MitoStain等荧光探针可检测到信号的最大组织深度至关重要。通过TMRE与总线粒体染色的共染色进行定性分析表明，果蝇卵原细胞在2B阶段单位质量的线粒体膜电位更高。在该图中，半定性分析展示了从9期卵室中分析得到的AFC与MBC之间单位质量线粒体电势的差异。这些图像显示，在有丝分裂及有丝分裂后阶段的果蝇滤泡细胞中均存在MitoSOX摄取现象。本实验中，共免疫染色结果显示，在卵原库以及9期卵室中，升高的Dec-cyclin信号与线粒体ATPB信号以及GFP阴性的DRP1克隆存在共定位。所述方法可经修改后用于研究其他果蝇组织中的线粒体结构与功能。观看本视频后，您应能够充分理解如何解剖、染色以及对固定和活体果蝇卵巢进行成像，以研究线粒体的结构与功能。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

研究线粒体结构与功能果蝇卵巢

本方案描述了在黑腹果蝇（Drosophila...

研究有丝分裂的显微注射技术 黑腹果蝇 合胞体胚胎

动粒是纺锤体组装检查点（SAC）启动信号、监控姐妹染色单体有丝分裂分离的位点。本文介绍了一种利用徕卡激光扫描共聚焦系统，在Drosophila胚胎中可视化动粒蛋白招募与周转过程，并将其与染色体运动进行协调分析的方法。...

通过展示活细胞中动粒蛋白动态行为与染色体运动研究有丝分裂检查点 果蝇 合胞体胚胎

黑腹果蝇 卵巢解剖：一种技术方法 离体 组织制备

线粒体在调节代谢和稳态中发挥核心作用。在线粒体代谢中可能影响生物体生理功能的细微变化，在整体生物体代谢组学研究中往往难以被检测到。本文介绍一种分离方法，可增强对黑腹果蝇（Drosophila...

用于代谢分析的线粒体富集组分的制备 黑腹果蝇

果蝇 卵子发生过程在研究线粒体增殖与遗传方面仍然具有极高的应用价值。本文描述了一种用于标记正在复制的线粒体DNA（mtDNA）的详细实验方案。 果蝇...

原位 线粒体DNA复制的标记 果蝇 通过EdU染色标记成年卵巢

固定样品中减数分裂I期前中期和中期的成像技术 果蝇 卵母细胞

在本方案中，我们展示了连续切片电子断层扫描技术在阐明果蝇（Drosophila）间接飞行肌线粒体结构中的应用。...

三维线粒体超微结构 果蝇 通过连续切片电子断层扫描揭示的间接飞行肌

本文介绍了一种利用高分辨率呼吸测定法测量果蝇透化胸段耗氧量的方法。与传统的线粒体分离技术相比，该技术所需组织量极少，且获得的结果更具生理相关性。...

利用少量组织测量果蝇透化肌纤维的线粒体耗氧量

基底膜在发育过程中对组织和器官的形态发生至关重要。为了更好地理解导致该结构正确定位的机制，本文介绍了一种利用共聚焦显微镜和超分辨率显微镜观察和表征上皮细胞中基底膜蛋白的细胞内转运与分泌的方法。...

共聚焦与超分辨率成像技术揭示基底膜蛋白极化性细胞内运输及分泌过程 黑腹果蝇 卵子发生

本文介绍了一种高分辨率呼吸测定方案，用于分析PINK1B9基因缺失突变果蝇中的生物能量学。该方法采用底物-解偶联剂-抑制剂-滴定（SUIT）方案。...

使用高分辨率呼吸测定法分析 Drosophila melanogaster PINK1B9 缺失突变体中的线粒体功能

学习利用黑腹果蝇卵巢研究线粒体结构与功能的方法，包括活体和固定组织的显微成像技术。该方法可深入分析线粒体结构与功能的关系，为线粒体生物学研究提供重要实验框架。

在 Drosophila 卵巢中研究线粒体结构与功能

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