研究线粒体结构与功能 果蝇 卵巢

本实验的总体目标是展示在模式生物黑腹果蝇（drosophila melanogaster）的活体及固定组织中研究线粒体结构与功能的方法。该方法有助于回答线粒体生物学领域中的关键问题，例如线粒体功能的调控机制。

该技术的主要优势在于能够对线粒体的结构与功能关系进行详细分析。根据文本方案，将五只麻醉后的雌性果蝇分离后，在解剖显微镜下，使用两对镊子将胸部与腹部切断。然后，小心地将腹部转移至培养皿的第二个孔中。

用一对镊子夹住腹部后端，用另一对镊子缓慢将卵巢推出。然后用镊子夹住单个卵巢不透明的后端，小心将其移至培养皿的第三个孔中，用于解剖或固定。用一对镊子夹住卵巢后端，用解剖针从后端向前端轻轻扫动，仔细剥离包裹卵巢的保护鞘。

为制备多聚赖氨酸包被的培养腔，将两滴独立的20微升多聚赖氨酸分别滴加在玻璃底培养皿的盖玻片上。在37摄氏度下空气干燥培养板一小时，并在培养板底部标记出多聚赖氨酸的范围。通过打开共聚焦显微镜的图像采集软件，在采集选项卡中设置相应的扫描参数，以完成扫描参数的设定。

选中时间序列、漂白和区域复选框以打开各自的选项卡。然后，在每个选项卡中输入相应的采集参数值。接着，将一个已解剖并分离的卵巢放置在标记好的多聚赖氨酸包被区域上，使用解剖针铺开卵巢并分离卵巢组织。

在卵巢上方放置一滴10微升的昆虫解剖液，确保完全覆盖聚赖氨酸包被的区域。然后盖上培养皿。卵巢固定后立即把样品放到显微镜载物台上，通过目镜快速定位活体组织中感兴趣的视野。

点击“实时”以获取所选感兴趣区域的实时图像，然后点击“停止”以结束实时扫描。如有必要，调整采集参数，使检测到的荧光信号低于饱和水平，并根据调整偏移值设定的背景进行优化。在图形选项卡中，使用贝塞尔绘图工具在扫描获得的图像上绘制一个小的感兴趣区域（ROI），以标定光漂白区域。

然后通过点击“开始实验”进行图像采集。为了使用荧光线粒体染料进行活体染色，将染料原液用预热的解剖液稀释至最终工作浓度。在完成前述的解剖与分离操作后，将卵巢放入解剖皿孔板中含200 µL染色液的孔内。

用铝箔包裹的盒子盖住培养皿，以避光，并将组织在其中孵育10分钟。接着，使用镊子将染色后的卵巢小心转移至三个连续含有不含染料培养基的孔中，进行清洗。若需与TMRE进行共染色，在使用兼容的全线粒体染料时，应先进行TMRE染色，然后无需洗涤组织，立即将样品转移至全线粒体染料中。

按照本视频前面演示的方法清洗并安装卵巢后，若要对样品进行共聚焦成像，请勾选z轴层切（z-sectioning）框以打开相应选项卡。在样品实时扫描的同时，将焦距调节轮向样品底部转动，并点击“设置起始（set-first）”以确定最底部的z轴层面。然后将焦距调节轮向相反方向移动，以定义最顶部的层面。

单击“开始实验”以进行图像采集。对于活体xvivamicroscopy，应在组织安装后15分钟内获取数据，否则由于组织逐渐死亡导致的生理变化可能影响实验结果。在通风橱下解剖后，立即将卵巢放入玻璃解剖皿孔中的200微升新鲜室温PFA中。

将组织孵育15分钟以进行固定。根据文本方案用PBS洗涤卵巢后，在仍处于PBS中时，轻轻分离卵巢，仔细去除可能阻碍抗体接触抗原的保护性纤维鞘。将分离后的卵巢置于含有500微升含0.5% Triton X-100的PBS溶液的微量离心管中，以进行透化处理。

接下来，将离心管放入带盖的盒子中，设置为25 RPM轻轻摇动30分钟。根据文本方案步骤，移除PBS/TX，通过加入200微升溶于0.5% PBS/TX中的BSA对组织进行封闭。将样品在室温下于摇床上孵育1小时。

除去封闭液后，加入抗兔 desycline E 抗体和抗小鼠 ATPB 抗体。将组织在室温下于摇床上孵育两小时。孵育结束后，用 PBS-TX 洗涤卵巢三次，每次 15 分钟。

然后，加入200 µL适当的二抗和新鲜的PBS-TX，室温孵育一小时。清洗组织两次后，在第三次洗涤中加入钩子。接着用1 mL移液器将免疫染色后的卵巢从微熔管中移至玻璃解剖皿的一个新孔中，该孔内含有200 µL PBS。

在载玻片上加入一滴基于甘油的封片剂，然后将免疫染色的卵巢逐个加入封片剂中。在解剖显微镜下，用镊子夹住卵巢的不透明部分，用解剖针轻轻剥离透明的卵巢管组织，使其与不透明的成熟卵室分离。随后，将成熟卵室从封片剂中移除。

将盖玻片置于载玻片上，轻轻按压以确保封片剂均匀分布。室温下晾干样本15分钟，随后用指甲油封固盖玻片边缘。最后根据需要进行共聚焦显微镜观察。

如图所示，对与神经细胞相关的线粒体云之一进行定点翻转后，在200秒内，红色翻转ROI周围蓝色和白色ROI的荧光信号损失超过50%，而黄色对照ROI的荧光漂白程度极小。果蝇卵巢的信号随组织深度增加而减弱，因此在活体成像过程中，明确诸如TMRE和mitostain等荧光探针可检测到信号的最大组织深度至关重要。通过TMRE与总体线粒体染料的共染色进行定性分析表明，果蝇卵原巢在2B阶段单位质量的线粒体膜电位更高。

在本图中，半定性分析展示了从9期卵室中分析得到的AFC与MBC之间单位质量线粒体电势的差异。这些图像显示，在有丝分裂及有丝分裂后的果蝇滤泡细胞中均存在MitoSOX的摄取。在本实验中，共免疫染色表明，在卵原库以及9期卵室中，升高的Dec-cyclin信号与线粒体ATPB信号以及GFP阴性的DRP1体细胞克隆存在共定位。

所述方法可经修改后用于研究其他果蝇组织中的线粒体结构与功能。观看本视频后，您应能充分掌握如何解剖、染色以及成像固定或活体果蝇卵巢，以研究线粒体的结构与功能。