一个简单的一步解剖协议成人全安装准备果蝇脑

成年果蝇大脑是研究神经回路，大脑高级功能和复杂性疾病的宝贵制度。一种有效的方法来剖析来自小苍蝇头全脑组织将促进脑为基础的研究。在这里，我们描述了一个简单的一步解剖成人的大脑保存完好的形态协议。

该协议的总体目标是描述一种针对成年果蝇大脑的简单一步解剖程序，该程序可以快速产生具有保存完好的形态的大脑，适合进行整座分析。这种方法可以帮助回答神经科学和遗传学领域的问题。这包括大脑回路的精细定位、研究神经元遗传作的影响以及基因的功能表征。

这种技术的主要优点是它涉及一个易于学习的程序。它可以帮助在不到 10 秒的时间内解剖出形态保存完好的成年果蝇大脑。这种方法的视频演示至关重要，因为在释放镊子以撕开围绕苍蝇头的外骨骼时控制所需的动量需要技巧和练习。

这些微小、烦人的果蝇教会了我们很多关于生物学原理的知识。它们还可以帮助我们找到人类疾病的原因和治疗方法，例如阿尔茨海默病和帕金森病。使用设置为 1.2 倍放大倍率的解剖显微镜，固定麻醉的苍蝇并将其浸入冷解剖溶液中，腹部朝上。

将镊子与解剖板保持 160 至 170 度角，然后对果蝇的腹部施加小力。这应该可以固定苍蝇，迫使头部向后 15 到 25 度，并将喙向上伸展。在这个动作之后，喙下方角质层的柔软半透明区域应该变得明显。

增加放大倍率并调整此区域的焦平面。用惯用手拿一对解剖镊子并施加压力以闭合尖端。将镊子垂直于约束苍蝇的镊子放置。

镊子的闭合尖端刺穿角质层的柔软半透明区域，注意不要穿透得太深以至于它们接触到大脑。然后快速但稳定地松开镊子，使镊子点打开，撕下苍蝇头的外骨骼。利用释放镊子尖端的动量，以一个动作轻轻地从脑组织中去除外骨骼和大部分头壳相关的眼睛和气管。

现在应该可以看到一个完整的大脑。使用镊子小心地去除剩余的附属组织，例如白色纤维气管组织，注意不要拉扯或损坏大脑。将解剖的脑样本和相关躯干放入大约 1 毫升 4% 多聚甲醛的冰上 40 至 60 分钟。

去除多聚甲醛，然后用 1 毫升 1 X PBS 冲洗样品，上下吹打溶液 3 次，注意不要吸出大脑。接下来，去除 PBS，然后用 1 毫升 1 X PBT 洗涤 5 次，每次 5 分钟，章动。以适当的稀释度添加目标一抗。

然后将样品在 4 摄氏度下孵育过夜，并进行章动。去除一抗，用 1 毫升 1 X PBT 洗涤样品 5 次，每次章动洗涤 5 至 10 分钟。以适当的稀释度和孵育时间向洗涤的样品中加入二抗。

之后，在 1 毫升 1 X PBT 中洗涤样品 6 次，每次 10 分钟，每次章动。此步骤对于去除任何非特异性结合的二抗至关重要。将样品以 1 至 10， 000 稀释液（1 毫克/毫升 DAPI）与 1 毫升 1 X PBT 溶液中孵育 30 至 60 分钟，同时进行章动。

最后，加入 1 毫升 1 X PBS，然后上下吹打溶液 3 次，冲洗样品。将盖玻片放在安装玻片上。使用带有切割尖端的移液器，将 1 X PBS 溶液中的大脑转移到盖玻片上。

接下来，使用镊子将大脑与身体分离。使用细移液器吸头去除脑组织周围的液体。然后，添加 20 至 40 微升抗褪色封片剂。

轻轻地展开大脑，同时将粘性介质向外移动。从一侧开始，轻轻地将第二个盖玻片放到样品上，注意尽量减少大脑与气泡的接触。让玻片沉淀，然后使用实验室抹布去除玻片边缘多余的液体。

使用一小块胶带将盖玻片对临时连接到安装载玻片上。要对样品进行成像，请使用复合荧光或共聚焦显微镜。这些图像显示了同一成年果蝇的正面和背面。

通过 DAPI 染色观察细胞核，并使用泛神经元标志物和抗 ELAV 抗体标记神经元。多巴胺能 （DA） 神经元通过抗 TH 抗体染色显示。对于所有图像通道，在大脑两侧之间观察到相似的强度水平。

大脑前部和后部的放大视图允许详细检查 DA 神经元簇。成对的前内侧簇可以在前部图像中看到，成对的后内侧簇和成对的后外侧簇可以在大脑的后侧看到。这些神经元的定量显示，三日龄雄性 w1118 品系果蝇通常在整个大脑的 PPM 簇中有 27 个 DA 神经元，每个半球的 PPL 簇中有 16 个，每个半球的 PAL 簇中有 5 个。

在每个 PAM 中平均观察到 97 个 DA 神经元clusters. 3D PAL 和 PAM 簇的重建还表明，与其他簇（如 PAL）中的 DA 神经元相比，PAM 簇中的 DA 神经元体积相对较小，TH 染色较弱。越来越多的研究集中在成苍蝇大脑上，用于剖析支撑高级大脑功能的分子途径和神经元回路，以及模拟人类脑部疾病。

在这种基于大脑的研究中，有必要有效地制备具有保存完好的形态的大脑样本。这在基于大脑的大规模筛查中可能尤为重要。我第一次想到这种方法是在努力用镊子夹住苍蝇时。

与大多数果蝇研究人员使用的带有锋利尖端的镊子不同，Shebna 尝试了钝端镊子，发现它更容易解剖大脑。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在不到 10 秒的时间内完成。有一次，我在短短一天内就为一项实验解剖了大约 100 个六种不同基因型的大脑。

虽然这种解剖程序看起来很简单，但首先用可有可无的果蝇练习很重要。研究者也可能难以在不破坏果蝇大脑的情况下定位镊子。解剖的大脑可用于其他研究，如 RNA、原位杂交以及从脑组织中提取蛋白质和 RNA 样本。

看完这个视频后，你应该能够解剖形态保存完好的果蝇大脑。我们预测可以开发改进以使此过程更简单、更快速。这将在未来可能会在大规模研究中实现自动化。

不要忘记，使用多聚甲醛和锋利的解剖钳可能很危险。处理固定液时采取预防措施，例如戴手套，解剖完成后立即盖上镊子，然后再将其放在一边。