多色 FlpOut 技术在研究胶质细胞高分辨率单细胞形态及细胞间相互作用中的应用 果蝇

该技术的总体目标是可视化复杂解剖组织中的单细胞形态，从而简化对果蝇中细胞间相互作用的研究。该方法有助于回答有关果蝇复杂形态及细胞间相互作用的关键科学问题。该技术的主要优势在于，可适用于在任何组织类型及任何发育阶段对单细胞形态进行研究。

演示该实验步骤的是我们实验室的技术员 Anja Kieser。MCFO 技术对标准的 FlpOut 技术进行了如下改进：热激诱导的 FLP 重组酶和不同的报告基因仍由 UAS 元件控制，但每个报告基因均具有一个共同的骨架，即肉豆蔻酰化超折叠 GFP，在其序列中插入了多个拷贝的表位标签。

这些产生的非荧光蛋白被命名为意大利面怪物GFP，并可通过抗体进行鉴定。根据切除次数的不同，会表达出不同组合的表位。由于HSP启动子在25摄氏度时具有轻微活性，因此应在该启动子完全失活的18摄氏度下进行杂交实验。

然后，等待约20天以获得F1代。将F1代的雌性和雄性分别收集到不同的培养瓶中。进行热激处理时，首先在它们3至4日龄时转移到新鲜培养基的培养瓶中。

年轻的果蝇可能对热激过于敏感。接下来，将小瓶转移至37摄氏度的水浴中，充分浸没以确保热激均匀。

为了稀疏标记胶质细胞，起始热激时间为5到8分钟，随后进行优化。最佳热激时间应能实现目标细胞的稀疏标记，具体时长取决于所使用的特定GAL4驱动子。热激完成后，将试管水平放置于实验台上数分钟，使其冷却。

现在，将果蝇置于相同的试管中，并在25摄氏度条件下继续培养。两天后，报告基因的表达将达到最佳状态，此时可对果蝇进行解剖。准备过程中，将三个深凹载玻片置于冰上。

用70%乙醇填充一个孔，用PBS填充一个孔，用S2细胞培养基填充一个孔。然后，将一个三厘米的解剖皿内衬黑色硅胶，并加入冷的S2细胞培养基。整个解剖过程均在S2细胞培养基中进行，以保持组织健康。现在，用二氧化碳麻醉果蝇。

然后，使用镊子或羽毛将果蝇放入冷的70%乙醇中约30秒，接着放入冷的PBS中约30秒，再将其转移至冷的S2培养基中。对所有待解剖的果蝇进行上述洗涤步骤。通常，每种基因型最多10只果蝇即已足够。现在，需在30分钟内解剖出所有脑组织。

首先，将头部与身体其余部分分离，并丢弃身体。在整个解剖过程中，用非惯用手始终固定住头部，否则将很难再次抓稳。接着，仅抓住视网膜下方的组织，将一侧眼球拉出。

然后取下另一只眼睛，从而暴露脑组织及周围结构。接着，清除脑组织周围的所有气管组织和残留的角质层，直至脑组织看起来干净。为了获得最佳的染色效果，必须彻底清除所有气管组织。

以上步骤即为固定脑组织所需的全部准备。在解剖其余脑组织时，将已解剖好的脑组织置于冷的S2溶液中。为获得最佳染色效果，每个微量离心管中建议放置不超过10个脑组织。使用P10移液器吸头将分离的脑组织转移至含有固定液的200微升微量离心管中。

切勿使用镊子接触脑组织。将组织置于避光条件下孵育。在溶液转移过程中避免吸走脑组织。

为了去除固定剂，使用洗涤液进行三次或更多次洗涤，每次15分钟。然后用封闭液封闭组织30分钟或更长时间。接下来，将封闭液替换为用洗涤液稀释的一抗，并在4摄氏度下孵育脑组织过夜。

为去除一抗，使用洗涤液进行三次每次一小时的洗涤。接着，将荧光标记的二抗加入洗涤液中，于4°C孵育脑组织过夜，或在室温下孵育四小时。为彻底洗去未结合的抗体，先使用洗涤液进行三次每次一小时的洗涤，随后用PBS进行一次较长时间的洗涤。

然后封片脑组织。准备两片带有成像间隔垫的盖玻片，在间隔垫内以及额外的盖玻片上各加入10 µL含抗荧光淬灭剂的封片介质。

接下来，使用 P10 移液器将脑组织转移到盖玻片上，连同部分 PBS 缓冲液一起置于介质旁边。注意不要让组织干燥。然后，用移液器小心地将脑组织移入封片介质中，最后将其转移至间隔层内的介质中，并用镊子进行排列。

然后，移除间隔片上的粘性衬垫，并贴上盖玻片。用镊子轻轻施压固定盖玻片，立即进行成像，或在零下20摄氏度下保存载玻片以备后续分析。通过所述方法，三种不同的膜标记报告基因均被两侧带有FRT位点的转录终止子所沉默。

当动物受到热激时，FLP 重组酶得以表达，并随机切除终止子，从而导致不同组合的报告基因表达。总体而言，不同的报告基因组合可产生七种不同的颜色，因此可对多个单细胞形态进行单独可视化和研究。本研究使用 EG-GAL4 和 ALG-GAL4 测试了多种热激时间。

单细胞标记在脑部的触角叶区域进行分析。EG-GAL4 驱动子在包被胶质细胞中表达，这些细胞全部包被在触角叶表面。相比之下，由 ALG-GAL4 靶向的星形胶质样胶质细胞则主要覆盖触角叶中彼此非重叠的区域。

观看本视频后，您应能够充分理解如何对溶液中的单个细胞进行标记。为了利用果蝇并原则上在可应用GAL4-UAS二元系统的模式生物中理解其复杂且具有解剖学意义的关系。初次尝试该实验流程时，重要的是首先优化热激时间，并尽可能严格遵循染色方案的各个步骤，以获得最佳实验结果。