Name: 多色 FlpOut 技术在果蝇中的应用研究胶质细胞的高分辨率单细胞形态学 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: 了解多色FlpOut技术在果蝇中可视化单细胞形态学的方法。该技术利用Gal4/UAS系统和热休克诱导FLP重组酶，实现胶质细胞的高分辨率成像，适用于发育生物学和神经科学研究。

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作者感谢Arnim Jenett、Aljoscha Nern以及Rubin实验室的其他成员提供的建议和未发表试剂的共享，感谢Janelia Fly Light项目团队提供了共聚焦图像。作者还感谢Gaul实验室成员对稿件提出的修改意见。

1. 多色 FlpOut（MCFO）实验的果蝇准备
注意：MCFO 技术指的是所谓的 Flp 介导的终止盒切除（FlpOut）方法的一种改良版本。转基因 MCFO 果蝇携带一个热休克启动子（hsp）驱动的 Flp 重组酶以及在 UAS 控制下的不同报告基因。每个报告基因均由一个共同的骨架构成，即肉豆蔻酰化（myr）超折叠绿色荧光蛋白（sfGFP），其中插入了 10 个拷贝的表位标签（例如，HA、FLAG 或 V5）。由此产生的非荧光蛋白被称为&#34;spaghetti monster GFPs&#34;（smGFPs）14，可通过针对不同表位标签的特异性抗体进行检测。
<ol>
	<li>将带有 MCFO 盒式元件和 hsp-Flp（hsp-Flp；10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA、10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG、10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5）的果蝇与适当的胶质细胞 GAL4 驱动品系杂交（见材料表）。
	<ol>
		<li>由于 hsp 在 25 °C 时已有活性，可能导致少数细胞发生重组，从而引起非特异性标记，因此为避免系统渗漏，应在 18 °C 下设置杂交。在 18 °C 下等待约 20 天以获得 F1 代。热激后（见步骤 2），将果蝇维持在 25 °C（图 3）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 热激
注意：根据插入位点的不同，hsp-Flp 的效率可能有所差异；因此，最适热激时间需要进行优化。本方案中使用了 hsp-Flp 插入 X 染色体的 MCFO 果蝇品系（见材料表）。
<ol>
	<li>将步骤1.1中杂交所得子代（F1代果蝇，3-4日龄）转移至含有培养基的新试管中，并将试管置于37 °C水浴中进行热激处理。 
	注意：年轻果蝇（1-2日龄）对热激非常敏感。为降低处理引起的死亡率，建议在果蝇出生后等待1至2天再进行热激。可保留部分F1代果蝇作为未热激的对照组。</li>
	<li>热激过程中，将果蝇保留在含培养基的常规试管中，以减少应激导致的死亡。雌雄果蝇需分开放置在不同试管中。</li>
	<li>确保整个试管完全浸入水中，以实现均匀的热激。对于使用多种GAL4驱动系实现胶质细胞稀疏标记的情况，可采用5-8分钟的热激时间作为合适的起始条件；但具体热激时长需根据不同的驱动系和实验进行优化（可能需要更短或更长的热激时间）。</li>
	<li>热激结束后，将试管水平放置于实验台上数分钟，使果蝇有时间恢复。 
	注意：无需更换试管。</li>
	<li>将果蝇继续在25 °C条件下培养，并在热激后2天或更长时间进行解剖（见步骤3和4），以获得最佳的报告基因表达效果。</li>
</ol>
3. 解剖准备与溶液配制
<ol>
	<li>解剖当天，将180 µL S2细胞培养基与20 µL 20%多聚甲醛（PFA）混合，于200 µL PCR管中配制新鲜固定液，得到2% PFA溶液。解剖前及解剖过程中，固定液需置于冰上保存。 
	注意：PFA 具有毒性，必须小心操作。 
	注意：在200 µL PCR管中，将160 µL S2细胞培养基与40 µL 20%多聚甲醛（PFA）混合，以制备4% PFA溶液，而非2%溶液。</li>
	<li>每种基因型使用一个PCR管，每管最多放入8-10个脑组织，以获得最佳染色效果。</li>
	<li>配制成年脑组织洗涤液：含0.5%牛血清白蛋白和0.5% Triton X-100的PBS溶液。 
	注意：根据染色情况，可能需要使用含1% Triton X-100的溶液。提高Triton X-100的浓度可增强抗体向组织内部的渗透，对于染色位于组织深部的区域是必要的例如， 成年个体中的突触区域 果蝇 脑</li>
	<li>配制封闭液：在 PBS 中加入 3% 正常山羊血清、3% 正常驴血清和 0.5% Triton X-100。</li>
	<li>成年脑灌注液和封闭液可在 4 °C 下保存数周。</li>
	<li>将深孔玻片置于冰上，然后向每个孔中加入以下溶液：一孔加入70%乙醇，一孔加入PBS，一孔加入S2细胞培养基。</li>
</ol>
4. 成年小鼠脑组织解剖
<ol>
	<li>将一个直径为 3 cm 的解剖皿置于体视显微镜载物台上，并加入冷的 S2 细胞培养基。所有解剖操作均需在此培养基中进行，以确保组织在解剖过程中保持健康。 
	注意：使用内衬数毫米厚黑色硅胶的解剖皿可提供良好的背景对比度（在图像中），并在解剖过程中妥善保存镊子。</li>
	<li>用 CO2 麻醉所需基因型的果蝇。</li>
	<li>用镊子夹住果蝇的翅膀，先在冷的 70% 乙醇中清洗 30 秒，再在冷的 PBS 中清洗 30 秒。</li>
	<li>将果蝇转移至盛有 S2 细胞培养基的深孔解剖皿中。</li>
	<li>对同基因型的所有果蝇重复上述步骤，并将其保留在冷的 S2 细胞培养基中直至解剖，以维持组织活性。 
	注意：仅麻醉约 30 分钟内可完成解剖的果蝇数量。在 S2 细胞培养基中长时间孵育可能损伤组织。</li>
	<li>用镊子夹住果蝇，在体视显微镜下将其浸入 S2 细胞培养基中。</li>
	<li>将头部与身体分离。弃去身体部分，保留头部浸没在 S2 细胞培养基中。在整个解剖过程中必须始终用镊子夹住头部。若头部开始上浮，则在不损伤组织的情况下重新捕获将变得困难。</li>
	<li>开始解剖时，始终至少用一把镊子固定头部，然后拉出一只眼睛。确保镊子尖端刚好位于视网膜下方，以避免损伤下方组织。拉出另一只眼睛后，继续去除头壳，直至脑组织暴露。</li>
	<li>彻底清除脑组织周围的气管组织和头壳，直至组织外观干净。为获得最佳染色效果，务必清除脑组织周围所有气管组织；此时组织已准备好进行固定和染色。</li>
	<li>在将所有已解剖的脑组织转移至 PFA 溶液前，先将其保留在冷的 S2 细胞培养基中，以便精确控制固定步骤的时间。</li>
</ol>
5. 成年大脑染色
<ol>
	<li>使用 P10 移液器将分离的脑组织转移至室温（RT）的 PFA 溶液中。为避免组织损伤，在解剖后切勿使用镊子转移脑组织。所有步骤均在 200 µL PCR 管中进行，并置于摇床上操作。</li>
	<li>所有步骤中，在使用 P200 移液器弃去旧溶液前，需先让脑组织沉降至管底。尽量移除上清液，避免吸入组织。操作过程中需避免组织暴露于光线下。</li>
	<li>用含 2% PFA 的 S2 细胞培养基 200 µL 固定脑组织 1 小时，或用 4% PFA 固定 30 分钟。为提高实验可重复性，各样本间的固定时间应保持一致。</li>
	<li>在 200 µL 成年果蝇脑清洗液中清洗 3 次（每次 15 分钟）后，加入 200 µL 封闭液封闭组织 30 分钟。封闭时间可适当延长。</li>
	<li>将脑组织与用成年果蝇脑清洗液稀释的一抗在 4 °C 下于总体积 200 µL 中孵育过夜。 
	注意：孵育时间可能因所用一抗类型不同而有所调整。某些情况下可能需要更长的孵育时间。
	<ol>
		<li>若需标记三种 MCFO 标记物，请使用抗 HA 抗体（1:500）、抗 FLAG 抗体（DYKDDDDK 表位，1:100）和抗 V5 一抗进行孵育。</li>
		<li>可选用直接偶联荧光染料的一抗替代常规的一抗+二抗组合（例如，抗 V5:DyLight 549，1:200）。此时应将直接偶联抗体视为二抗处理。 
		注意：对每种基因型，应保留部分脑组织作为对照，以验证染色的特异性。跳过一抗孵育步骤，直接进入下一步。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用 200 µL 成年果蝇脑清洗液清洗组织 3 次，每次 1 小时（步骤 3.3），随后在 200 µL 总体积中加入用成年果蝇脑清洗液稀释的荧光标记二抗或直接偶联的一抗，在 4 °C 下孵育过夜，或在室温下孵育 4 小时。 
	注意：合适的抗体示例包括：AlexaFluor 488（1:250）、抗 V5:DyLight 549（1:200）以及 DyLight 647 偶联抗体（1:100）。</li>
	<li>用 200 µL 成年果蝇脑清洗液清洗脑组织 3 次，每次 1 小时，随后在 4 °C 下用 200 µL PBS 进行最终清洗（过夜），或在室温下清洗 1–2 小时。PBS 的最终清洗步骤可彻底去除 Triton X-100 残留，对获得最佳染色效果至关重要。将脑组织置于含抗荧光淬灭剂的封片剂中，加盖玻片封片。</li>
</ol>
6. 用于成像的脑组织切片装片
<ol>
	<li>使用剪刀将成像垫片修剪至合适尺寸。进行高分辨率显微镜观察时，将样本和成像垫片夹在两张玻璃盖玻片之间。 
	注意：成像垫片是一种薄型（厚度0.12 mm）粘性垫片，可剥离并粘贴于玻璃盖玻片或载玻片表面，使样本在无压缩状态下固定。</li>
	<li>用镊子去除一侧粘性保护膜，将垫片粘性面向下贴附于一张玻璃盖玻片（22 mm × 60 mm）表面。在另一张新的玻璃盖玻片上加入10 µL封片剂。</li>
	<li>使用P10移液器将脑组织从200 µL离心管转移至盖玻片上，置于封片剂液滴旁。转移组织时需同时带入少量PBS，以保持脑组织处于溶液环境中。</li>
	<li>用P10移液器将脑组织从PBS中转移至封片剂液滴中，尽量减少PBS的带入量。将样本置于含成像垫片的盖玻片上的封片剂中，使用足量封片剂完全覆盖样本。</li>
	<li>去除垫片上侧的另一层粘性保护膜，在样本上方加盖一张玻璃盖玻片。用镊子尖端在粘合区域轻轻施压，确保密封。立即进行成像，或将载玻片储存于-20 °C环境中以备后续分析。</li>
</ol>
7. 图像采集
<ol>
	<li>使用共聚焦显微镜配备40倍（数值孔径NA = 1.2，水浸）或63倍（数值孔径NA = 1.4，油浸）物镜获取共聚焦荧光图像的Z轴层扫图像序列（xy平面像素尺寸为1,024 × 1,024；相邻共聚焦切片间距为0.5 µm）。调节每个通道的探测器增益和偏移，确保图像中无饱和像素且无零值像素；这可避免信息丢失，并充分利用探测器的全动态范围。 
	注意：由于三维成像耗时较长，可通过在不同位置并行扫描多个样品实现测量自动化。使用水浸物镜时，为防止蒸发，应采用折射率n = 1.33的专用油浸介质。</li>
	<li>使用任何标准图像分析软件对共聚焦图像序列进行最大密度投影处理，并调整通道色调、亮度和对比度（参见材料表）。</li>
</ol>

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</ol>

所有作者均无竞争或利益冲突。

本方案描述了一种在高分辨率下研究目标组织内不同类型细胞形态的简便高效方法。通过MCFO技术，联合使用带有不同表位标签的多种报告基因进行多色随机标记（图2）。与Brainbow/Flybow15,16,17等其他方法类似，MCFO通过标记物的共表达增加标记多样性，从而实现细胞边界的可视化，便于开展细胞间相互作用的研究。例如，使用三种报告基因时，可产生七种可能的标记组合。与以往的标记方法相比，MCFO技术对细胞标记密度的控制更为精确且操作简便17：Flybow 1.0果蝇表达一种默认标记，使单细胞标记更加困难；Flybow 2.0果蝇需要表达两种不同的Flp重组酶，导致系统更为复杂。
根据所使用的特定GAL4驱动子，MCFO技术可被调整用于研究任何发育阶段的任何组织。在此，该技术已被应用于高分辨...

胶质细胞是神经系统（NS）中的非神经元细胞群体，长期以来被认为仅为神经元提供静态的结构支持，因此未被深入研究。然而，在人体中，胶质细胞构成了神经系统中绝大多数的细胞（约90%），并可分为多种不同类型，包括星形胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞和施万细胞。在Drosophila中，胶质细胞约占神经系统细胞的10%。引人注目的是，它们的形态和功能与脊椎动物中的胶质细胞 remarkably 相似1,2。其形态包括形成血脑屏障（BBB）的上皮细胞、包裹性细胞以及类似星形胶质细胞的细胞。
果蝇（Drosophila）中枢神经系统（CNS）主要由以下结构组成：包含神经元胞体的皮层区域；含有突触连接的神经毡区域；连接不同神经毡的小型和大型轴突束；以及连接感觉器官和肌肉与中枢神经系统的外周神经（图1）。胶质细胞存在于所有这些解剖结构中：皮层胶质细胞（CG）位于皮层区域；星形胶质样胶质细胞（ALG）和包被胶质细胞（EG）位于神经毡区域；包被胶质细胞也分布于中枢轴突束和外周神经（EGN）；最后是两种片状胶质细胞——围神经胶质细胞（PG）和亚围神经胶质细胞（SPG），它们共同形成连续的层状结构，包裹整个神经系统（图2）。
先前的研究表明，胶质细胞在神经系统发育过程中发挥着重要作用：它们通过响应系统性循环的胰岛素样肽来监测神经元数量，为神经元提供营养支持（例如星形胶质细胞-神经元乳酸穿梭），并通过吞噬作用清除凋亡的神经元3,4,5,6。在成熟的神经系统中，胶质细胞维持血脑屏障（BBB），摄取神经递质并维持离子稳态，作为神经系统中的主要免疫细胞（因为巨噬细胞无法穿越血脑屏障），同时调节突触活动和动物行为6,7,8,9,10,11。
不同胶质细胞亚型是否执行特化功能仍然是一个重要的未解问题。然而，由于缺乏适当的遗传操作工具，对胶质细胞（尤其是成体中的胶质细胞）进行系统性的全基因组分析一直受到阻碍。本文介绍了一种能够高效、简便地表征细胞形态以研究复杂细胞间相互作用的方法。该技术已应用于表征成年黑腹果蝇（Drosophila）大脑中不同胶质细胞亚型的形态，但根据所使用的特定GAL4驱动子，该方法也可被调整用于研究神经元12,13、各类混合分布的细胞，原则上还可用于任何发育阶段的任何组织。

<table><tbody><tr><td>水浴锅</td><td>Grant</td><td>GD100</td><td></td></tr><tr><td>PCR管</td><td>Sarstedt</td><td>72.737.002</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>Dumont</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>解剖皿 30 mm × 12 mm</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70543-30</td><td>玻璃解剖皿</td></tr><tr><td>Pyrex 3孔玻璃点滴板</td><td>Corning</td><td>7223-34</td><td>玻璃解剖板</td></tr><tr><td>Sylgard 黑色</td><td>SYLGARD, Sigma-Aldrich</td><td>805998</td><td>自制，含木炭</td></tr><tr><td>ExpressFive S2细胞培养基</td><td>Invitrogen</td><td>10486-025</td><td></td></tr><tr><td>20% PFA</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15713</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Roth</td><td>3051.3</td><td></td></tr><tr><td>正常山羊血清</td><td>Jackson Laboratories</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>正常驴血清</td><td>Jackson Laboratories</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>兔抗HA标签抗体</td><td>Cell Signaling</td><td>C29F4</td><td>一抗，稀释比例1:500</td></tr><tr><td>大鼠抗FLAG标签抗体</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-06712</td><td>一抗，稀释比例1:100</td></tr><tr><td>小鼠抗V5标签:DyLight 549</td><td>AdSerotec</td><td>0411</td><td>偶联抗体，稀释比例1:200</td></tr><tr><td>驴抗兔AlexaFluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11034</td><td>二抗，稀释比例1:250</td></tr><tr><td>驴抗大鼠DyLight 647</td><td>Jackson Laboratories</td><td>712-605-153</td><td>二抗，稀释比例1:100</td></tr><tr><td>Vecta Shield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>SlowFate Gold</td><td>Invitrogen</td><td>S36937</td><td></td></tr><tr><td>Secure Seal间隔垫片</td><td>Grace Biolabs</td><td></td><td>联系公司订购</td></tr><tr><td>显微镜盖玻片 22 × 60 mm</td><td>Marienfeld</td><td>101152</td><td></td></tr><tr><td>显微镜盖玻片 22 × 22 mm</td><td>Roth</td><td>H874</td><td></td></tr><tr><td>立体显微镜，Leica MZ6</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>共聚焦激光扫描显微镜 LSM710</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immersol</td><td>Zeiss</td><td>518 F</td><td>荧光显微镜用浸油，无卤素</td></tr><tr><td>Immersol</td><td>Zeiss</td><td>W 2010</td><td>水浸物镜用浸液，无卤素</td></tr><tr><td>R56F03-GAL4 (EG)</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>39157</td><td>GAL4驱动系</td></tr><tr><td>R86E01-GAL4 (ALG)</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>45914</td><td>GAL4驱动系</td></tr><tr><td>hspFlpPestOpt; UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>64085</td><td>UAS报告基因系（https://bdscweb.webtest.iu.edu/stock/misc/mcfo.php）</td></tr><tr><td>Fiji (Image J)</td><td></td><td></td><td>图像分析软件</td></tr><tr><td>Multi Time Macro</td><td>Zeiss</td><td></td><td>自动扫描软件</td></tr></tbody></table>

多色 flpout 技术在研究胶质细胞高分辨率单细胞形态及细胞间相互作用中的应用 果蝇

Application of MultiColor FlpOut Technique to Study High Resolution Single Cell Morphologies and Cell Interactions of Glia in Drosophila

细胞呈现出不同的形态以及复杂的解剖学关系。细胞如何与邻近细胞相互作用？这些相互作用在不同细胞类型之间，甚至在同一类型内部是否存在差异？它们遵循哪些空间规律？目前，由于缺乏对活体（in vivo）中单个细胞进行高分辨率标记的有效工具，上述基本问题的研究一直受到限制。本文提供了一种利用多色 FlpOut（MCFO）技术靶向标记单个细胞的详细实验方案。该方法基于三个带有不同标签（HA、FLAG 和 V5）的报告基因，这些基因受 UAS 调控，并被位于两个 FRT 位点之间的转录终止序列（FRT-stop-FRT）所沉默。通过短暂的热激处理，诱导热激启动子驱动的 Flp 重组酶表达，该酶可随机地在单个细胞中切除 FRT-stop-FRT 序列；而报告基因的表达仅发生在同时表达 GAL4 驱动子的细胞中。由此可在特定细胞类型中产生多种颜色标记的细胞阵列，从而实现对单个细胞形态的高分辨率可视化。例如，可将 MCFO 技术与特异性的胶质细胞 GAL4 驱动子结合，用于观察成年黑腹果蝇（Drosophila）大脑中不同胶质细胞亚型的形态结构。

本部分展示了利用 MCFO 技术在成年个体中可获得的结果示例 果蝇 脑 图3 展示了该方法的示意图。在UAS调控下，三种带有不同膜标记的报告基因（myr-smGFP-HA、myr-smGFP-FLAG和myr-smGFP-V5）被两侧带有FRT位点的转录终止序列（FRT-stop-FRT）所抑制而保持沉默。通过热激诱导Flp重组酶的表达，可随机地在单个细胞中切除FRT-stop-FRT片段，从而导致由所使用的GAL4驱动子特异性标记的某一细胞类型中出现多种不同标记的细胞。
总体而言，可以实现七种颜色。 图4 和 图5 显示EG和ALG细胞的单细胞形态 果蝇 触角叶（AL）。延长热激时间可增加标记细胞的数量，...

细胞表现出不同的形态，并与其邻近细胞建立多种相互作用。本方案描述了如何利用成熟的Gal4/UAS表达系统揭示单个细胞的形态，并研究细胞间的相互作用。

多色 FlpOut 技术在研究胶质细胞高分辨率单细胞形态及细胞间相互作用中的应用 果蝇

细胞表现出不同的形态和复杂的解剖关系。细胞如何与邻近细胞相互作用？这些相互作用在不同……之间是否存在差异？

该技术的总体目标是可视化复杂解剖组织中的单细胞形态，从而简化对果蝇中细胞间相互作用的研究。该方法有助于利用果蝇回答有关复杂形态及细胞间相互作用的关键科学问题。该技术的主要优势在于，可适用于任何组织类型及任何发育阶段的单细胞形态学研究。演示该实验操作的是本实验室的技术员 Anja Kieser。MCFO 技术对标准的 FlpOut 技术进行了如下改进：热激诱导的 FLP 重组酶和不同的报告基因均受 UAS 调控，但每个报告基因均具有一个共同的骨架，即肉豆蔻酰化超折叠 GFP（myristoylated superfolder GFP），并在其中插入了多个拷贝的表位标签。这些产生的非荧光蛋白被命名为意大利面怪物GFP（spaghetti monster GFPs），可通过抗体进行鉴定。根据切除次数的不同，会表达出不同组合的表位。由于HSP启动子在25摄氏度时具有轻微活性，因此应在该启动子完全失活的18摄氏度下进行杂交实验。然后，等待约20天以获得F1代。将F1代的雌性和雄性分别收集到不同的培养瓶中。进行热激处理时，首先在它们3至4日龄时转移至新鲜培养基的培养瓶中。年轻的果蝇可能对热激过于敏感。接下来，将小瓶转移至37摄氏度的水浴中，充分浸没以确保热激均匀。为了稀疏标记胶质细胞，首先进行5到8分钟的热激，然后进行优化。最佳热激时间取决于所使用的特定GAL4驱动子，应能使目标细胞及其相关结构实现稀疏标记。热激后，将试管水平放置在实验台上数分钟，使其冷却。现在，将果蝇转移到相同的试管中，并在25摄氏度条件下继续培养。两天后，报告基因的表达将达到最佳状态，此时可对果蝇进行解剖。为准备解剖，将三个深孔载玻片置于冰上预冷。用70%乙醇填充一个孔，用PBS填充一个孔，用S2细胞培养基填充一个孔。然后，将一个三厘米的解剖皿内衬黑色硅胶并加入冷的S2细胞培养基。整个解剖过程均在S2细胞培养基中进行，以保持组织的健康状态。现在，用二氧化碳麻醉果蝇。然后，使用镊子或羽毛将果蝇放入冷的70%乙醇中约30秒，接着放入冷的PBS中约30秒，再转移至冷的S2培养基中。对所有待解剖的果蝇进行上述洗涤步骤。通常，每种基因型最多10只果蝇即足够。现在，需在30分钟内解剖出所有脑组织。首先，将头部与身体其余部分分离，并丢弃身体。在整个解剖过程中，用非惯用手始终固定住头部，否则将很难再次抓稳。接着，仅抓住视网膜下方的组织，将一侧眼球拉出。然后取下另一只眼睛，从而暴露大脑及周围组织。接着，清除大脑周围所有的气管组织和残留的角质层，直至脑组织清晰可见。为了获得最佳的染色效果，必须彻底清除所有气管组织。以上步骤即为固定脑组织所需的全部准备。继续解剖所有脑组织，同时将已解剖的脑组织置于冰预冷的 S2 溶液中。为获得最佳染色效果，建议每个微量离心管中最多准备 10 个脑组织。使用 P10 移液器吸头将分离的脑组织转移至含有固定液的 200 微升微量离心管中。切勿使用镊子触碰脑组织。将组织置于避光条件下孵育。在溶液转移过程中避免吸走脑组织。为了去除固定剂，使用洗涤液进行三次或更多次、每次15分钟的洗涤。然后用封闭液封闭组织30分钟或更长时间。接着，将封闭液替换为用洗涤液稀释的一抗，并在4摄氏度下孵育脑组织过夜。为去除一抗，使用洗涤液进行三次每次一小时的洗涤。接着，将荧光标记的二抗加入洗涤液中，于4°C孵育脑组织过夜，或在室温下孵育4小时。为彻底洗去未结合的抗体，先用洗涤液进行三次每次一小时的洗涤，再用PBS进行一次较长时间的洗涤。然后封片脑组织。准备两张带有成像间隔片的盖玻片，在间隔片和额外的盖玻片上各加入10微升含抗荧光淬灭剂的封片介质。接下来，使用 P10 移液器将脑组织转移至盖玻片上，连同少量 PBS 一起放置在封片剂旁边。注意不要让组织干燥。然后，用移液器小心地将脑组织移入封片剂中，最后将其转移至间隔层内的封片剂中，并用镊子进行排列。然后，移除间隔片上的粘性衬垫，并贴上盖玻片。用镊子轻轻施压固定盖玻片，立即进行成像，或在-20摄氏度下保存载玻片以备后续分析。通过所述方法，三种不同的膜标记报告基因均被两侧带有FRT位点的转录终止子所沉默。当动物受到热激时，FLP 重组酶得以表达，并随机移除终止子，从而导致不同组合的报告基因表达。总体而言，不同的报告基因组合可呈现七种不同的颜色，因此可对多个单细胞形态进行单独可视化和研究。本研究使用 EG-GAL4 和 ALG-GAL4 测试了多种热激时间。单细胞标记在脑部的触角叶区域进行分析。EG-GAL4 驱动子在包被胶质细胞中表达，这些细胞全部包被在触角叶表面。相比之下，由 ALG-GAL4 靶向的星形胶质样胶质细胞则主要覆盖触角叶中彼此非重叠的区域。观看本视频后，您应能够充分理解如何对溶液中的单个细胞进行标记。为了利用果蝇并原则上在可应用GAL4-UAS二元系统的模式生物中理解细胞之间复杂的解剖学关系，首次尝试该实验操作时，重要的是首先优化热激时间，并尽可能严格遵循染色方案的各个步骤，以获得最佳实验结果。

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Research

科研

JoVE Journal

Behavior

行为

多色 FlpOut 技术在果蝇中的应用研究胶质细胞的高分辨率单细胞形态学

我们利用共聚焦显微镜结合荧光染料，在一种新型的活体果蝇幼虫“内向外”组织制备中，描述了胶质细胞-神经肌肉突触的结构特征。我们使用标记荧光的抗辣根过氧化物酶（HRP）一抗对活神经元末梢进行标记，同时利用荧光葡聚糖对突触周围间隙进行可视化观察。...

实时成像 黑腹果蝇 荧光染料标记的胶质细胞-神经肌肉接头

本文介绍了一种利用活体显微分析结合GFP标记的胶质细胞，研究胶质细胞迁移进入发育中黑腹果蝇（Drosophila）眼部的实验方案。...

活体成像观察果蝇复眼原基盘中胶质细胞的迁移

活体成像 黑腹果蝇 胚胎血细胞迁移

单个Drosophila小眼的解剖与成像

本视频展示了对转基因果蝇大脑进行免疫荧光染色，以实现胶质细胞的单细胞成像。该果蝇大脑在胶质细胞特异性重组酶系统的调控下，表达与不同抗原表位组合融合的膜靶向蛋白。分离并固定的脑组织经针对这些抗原表位的一抗孵育后，再使用荧光染料偶联的二抗进行染色。该标记方法可实现对不同脑区中多种胶质细胞亚群的同时成像。...

果蝇大脑的免疫荧光染色用于胶质细胞的单细胞成像

我们介绍一种用于标记黑腹果蝇（Drosophila）胚胎中枢神经系统（CNS）中单个神经元的技术，该技术可通过透射光显微镜或共聚焦显微镜对神经元形态进行分析。...

果蝇（Drosophila melanogaster）中枢神经系统中单个细胞的标记

本方案详细描述了一种用于完整幼虫大脑中活细胞成像的简化方法。活细胞成像技术对于研究不对称神经干细胞分裂以及其他神经发生和发育过程具有重要价值，能够持续揭示以往被忽视的机制。...

活体成像 黑腹果蝇 幼虫神经母细胞

本方案描述了成年个体的解剖与免疫染色方法 黑腹果蝇 脑组织。具体而言，本方案重点介绍了使用 果蝇...

成年黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）大脑中蘑菇体与光感受器神经元的解剖及免疫荧光染色

在早期 果蝇 胚胎中许多细胞器具有运动性。原则上，可对它们进行活体成像 通过 特异性荧光探针，但卵壳阻碍了其对胚胎的直接应用。本方案描述了如何将此类探针引入胚胎 通过 显微注射，然后分析细胞器的大规模运动 通过...

可视化细胞骨架依赖性脂质囊泡在 Drosophila 胚胎中的运输

本文介绍了利用eGFP荧光在黑腹果蝇（Drosophila）复眼中对光感受器膜蛋白进行定位以及评估视网膜变性的非侵入性方法。...

使用 eGFP 标记蛋白在 Drosophila 感光细胞中研究膜蛋白转运

扩增辅助迭代荧光原位杂交（EASI-FISH）是一种强大的技术，结合了扩增显微镜与荧光原位杂交（FISH），用于在厚组织中检测多个基因的表达。本方案概述了该方法的最新进展及其在完整Drosophila中枢神经系统标记中的应用。...

完整组织中基因表达的多重检测 果蝇 利用扩增辅助迭代荧光技术研究大脑 原位 杂交

了解多色FlpOut技术在果蝇中可视化单细胞形态学的方法。该技术利用Gal4/UAS系统和热休克诱导FLP重组酶，实现胶质细胞的高分辨率成像，适用于发育生物学和神经科学研究。

多色 FlpOut 技术在研究胶质细胞高分辨率单细胞形态及细胞间相互作用中的应用果蝇

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