发展和成人的制备果蝇大脑和视网膜实时成像

视频中，我将演示如何为实时成像和免疫组化准备大脑和视网膜的 oph，重点是感光细胞。首先，我将向您展示如何准备脑夹层。然后，我将演示三种不同的解剖，即成人大脑、成人视网膜和发育中的眼睛。

对于其中每一种，组织都可以固定以进行免疫组织化学或成像生命。最后，我将介绍我们如何对生命组织进行成像，并展示一些使用共振扫描共聚焦显微镜进行实时成像的示例。所以让我们开始吧。

对于善良的切片，您需要锋利的镊子。使用磨刀块或非常细的砂纸，轻轻地将镊子在每一侧来回传递，直到两端相遇。在精细的地方，我们使用标准的磨刀石。

我不会在这里介绍磨刀技术，但我会说锋利的镊子对于活体解剖是必不可少的。我们每天都会磨镊子进行成人脑解剖。将果蝇放在 CO2 垫上麻醉它们并分选出所需的基因型。

对于瞳孔解剖，只需把手伸进小瓶中，用镊子小心地取出瞳孔，小心避免打破瞳孔盒。蘸起 kim 湿巾并用水润湿。您将在解剖过程中使用它来清除镊子上的碎屑。

将解剖皿放在立体镜的载物台上，并用 HL 3 溶液填充。所有解剖都将在 HL 3 中进行，以确保组织在解剖过程中保持活力和健康。此外，我喜欢使用底部覆盖有 Syl 防护罩的解剖皿，以便在解剖过程中保护我的镊子。

现在，准备固定溶液。如果您打算进行免疫组化。将 180 μL HL 3 放入 500 μL 微量离心管中。

加入 20 微升 37% 甲醛，得到 3.7% 的甲醛溶液。最后，正确的手部位置对于良好的解剖和良好的手部位置很重要。您的镊子将保持稳定并能够控制细微的运动。

首先，将镊子放在拇指的一侧，然后将食指笔直向下，使指尖放在顶部。现在将镊子的一侧放在中指的一侧，然后移动到解剖皿上。用拇指和中指与盘子进行物理接触，同时将拇指和中指放在盘子上。

将手腕放在显微镜载物台上。这边。在解剖过程中，您将三个点牢牢地固定在表面上，现在只需对镊子进行非常细微的作即可。

在 CO2 垫上。将成年果蝇的腹侧朝上，使头部远离您的手。抓住头部下方的胸部。

如果作得当，在立体镜下观察时，腿和前叉会伸出，用镊子抓住伸出的长鼻以取出头部，丢弃身体并将头部浸入水中。重新聚焦在浸没的头部上。整个解剖将在溶液下进行。

用镊子抓住头部非常重要。否则，头部将漂浮。请记住，浮头总是很难找回。

如果在解剖过程中头部移出焦距，只需将其移回焦平面即可，无需调整显微镜。这项看似简单的任务一开始可能很困难，但随着时间的推移，保持头脑专注会变得更容易。首先撕裂 probus 和眼睛之间的结缔组织，开始解剖。

撕开眼睛，同时始终用至少一个镊子牢牢握住。确保镊子的脚趾仅在视网膜或角质层下方。为避免损伤下面的大脑，左右交替。

用镊子撕掉朝向后脑勺工作的视网膜。撕掉视网膜会增加椎板保持附着在视叶上的机会。在整个解剖过程中，继续围绕后脑勺，沿途撕裂角质层，撕裂另一只眼睛并开始拉开角质层。

只要你抓住角质层，你就知道你没有压垮大脑。考虑到这一点，继续将角质层和视网膜拉开，直到露出大脑。一旦大脑可见，您就可以开始移除附着在大脑上的气管，继续拉动它、气管和角质层，直到大脑被隔离。

此时，您应该重新聚焦到培养皿的底部，以进行感光器末端成像的剩余步骤。保留层是可取的，但您需要去除包含细胞体和强烈自发荧光色素的视网膜。为此，请小心地拉动浓密的细胞体残留物，而不会损坏椎板。

这是一项更精细的技能，需要练习。取出剩余的气管 因为您的大脑可能会在过夜抗体洗涤期间漂浮，所以使用我将在第 7 节中讨论的条件，成人大脑可以存活数小时甚至过夜。对于免疫组化，成人大脑现在已经准备好被固定和甲醛。

使用设置为 5 μL 的 P 20 移液器将成人大脑移动到您已经准备好的固定溶液中。继续解剖成人大脑 20 分钟，应该会产生 4 到 10 个大脑。离开大脑并再固定 40 分钟。

但是，此持续时间可能会有所不同。为了获得最佳的一抗染色效果，去除甲醛溶液，用 400 微升含有 PBS 和 0.4%TRITTON X 100 的溶液洗涤大脑 3 次，每次 5 分钟，以下简称 PBS Triton。完全洗掉固定溶液后，您可以添加一抗溶液。

按照成人大脑的说明开始解剖 浸入头部并重新聚焦显微镜后，首先撕裂 probus 和 probus 上方的眼睛之间的结缔组织。将角质层与眼睛分开。现在用一把镊子将角质层与眼睛下侧分开，朝向后脑勺工作。

抓住后脑勺的中心进行解剖。用其他镊子压碎大脑是可以的。抓住眼睛并分开。

让眼睛落在盘子的底部。椎板可能仍会附着在眼睛上，可用于对完全完整的感光细胞的感光器末端进行实时成像。接下来的三个部分解释了如何为眼睛进行免疫组化做准备。

对于免疫组化，将眼睛移至固定溶液。使用设置为 5 微升的 P 20 管 Petman，继续解剖成人的眼睛，总共 10 分钟。离开眼睛并再固定 30 分钟。

取出固定溶液并按照成人脑解剖中的说明进行洗涤。如果您最终希望对眼睛的材料结构进行成像，则必须将其删除。现在将固定的眼睛放回解剖皿中，并去除可能仍附着的任何气管或脂肪细胞。

然后，用一把镊子握住眼睛的外侧，用另一把镊子去除眼板。它应该成块脱落，露出下面的细胞体。小心只抓住薄板 否则，您可能会从视网膜上分离细胞体。

使用 P 20 管 Eman，将眼睛移至 500 微升试管中的 400 微升 PBS Triton 中。在 4 度下轻轻摇动它们过夜，以在第二天从光感受器中去除自发荧光红色素。您可以丢弃洗涤液并添加 primary 任何人，以对没有椎板的成人眼睛进行实时成像。

我们只使用雪貂成年果蝇，它们是在 elo 之前不久的晚期 puy。在这个阶段，在解剖铁素过程中，感光细胞体与椎板中的末端分离。成年 puy 具有清晰的翅膀、眼睛和角质层，可通过瞳孔盒看到。

选择一只蛹并将其浸入 HL 3 中。去除瞳孔的前部以露出头部区域。小心地去除另外包裹发育中的果蝇的薄内膜。

用镊子抓住头部的底部并拉动。丢弃剩余的蛹，同时保持头部浸没。按照 fer 率成人阶段免疫组化眼解剖中的说明进行。

然而，感光细胞体将更容易从叶片中分离，从而使您能够对依偎在视网膜中的细胞体进行成像。此外，椎板仍然附着在视叶上，因此您可以对远端椎板进行成像。如果您想对可以看到感光器末端盒的近端叶片进行成像，那么对叶片更紧密附着在眼睛上的成年苍蝇进行眼解剖。

瞳孔发育 20% 的发育中的眼盘已成为我们实验室实时成像的最爱。因为这种相对较大的发育细胞的单层很容易使用共聚焦显微镜观察到。要选择 20% 的蛹，请寻找 Ian 小管，即出现在瞳孔下方的绿色斑点，并避免在 20% 瞳孔发育后形成深色身体的蛹。

选择蛹后，将其浸入解剖皿中的 HL 3 中，并小心地取出瞳孔袋的前部。小心不要穿透薄薄的内膜。用镊子抓住内膜并拉开。

仔细搜索发布的内容，找到发育中的大脑和眼盘，它们非常突出。将大脑隔离在解剖皿的底部。小心地将中枢脑与视叶分开。

视叶 I 椎间盘复合体将用于实时成像。如果您希望仅用一种或两种溶液进行短时间成像，您可以在载玻片上对您的组织进行成像。在这种情况下，首先按照制造商的说明在表面涂上 syl guard 来准备载玻片。

放置 20 微升 HL 3。在载玻片的中间，将另外 20 微升 HL 3 的解剖组织运送到载玻片上。组织绝不能暴露在空气中。

此外，必须避免移液器作造成的任何压力或应变。对于实时成像，必须牢固地固定组织。获得一个玻璃电极，就像那些拉出来进行电生理记录的电极一样。

折断尖端，并使用嘴产生的负气压用胶水针迹填充末端，仅折断足够胶水可能进入的电极。现在用正压在一滴 HL 3 下的门槛护罩上涂抹少量胶水。现在，快速将组织放在胶水上，保持实时成像所需的方向。

水浸透镜现在可用于成像。如果要添加膜渗透性染料，可以将其添加到浴中。在进行长时间成像或完全或多次更换溶液的成像时，我们使用连接到蠕动泵的灌注室，蠕动泵缓慢地渗透活组织的培养液。

使用涂有一滴 syl guard 的盖玻片，该保护罩被剃光，以使其薄而平。将 20 微升 HL 3 分配到盖子的中心。将活组织滑入并粘在门槛护罩上。

生成一个垫圈，允许气泡穿过腔室，而不会将活组织暴露在空气中。垫圈应足够厚以避免压碎组织，但又应足够薄以使组织靠近共聚焦显微镜镜头。组装 profusion 室，小心地始终保持组织完全浸没。

因此，溶液更换可以以高达每分钟 100 微升的速度进行。对于小时级的成像，您可能需要添加 20 羟基戴森和抗生素，但不需要添加抗真菌剂，并以每分钟 10 微升左右的慢得多的速度进行大量成像。此外，我们将氧气注入为蠕动泵供应的培养基中。

现在您拥有成功解剖果蝇大脑和视网膜所需的所有技能。此外，您还可以对活体发育中的眼盘或成体光感受器进行成像。因此，感谢您的观看，祝您的实验好运。