Name: 发展和成人的制备果蝇大脑和视网膜实时成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-15T17:55:00.000+00:00
Duration: 16 min 47 s
Description: 学习果蝇大脑和视网膜的解剖制备技术，用于活细胞成像和免疫组织化学研究。本方法展示如何在HL3溶液中保持组织活性，并使用共振扫描共聚焦显微镜进行实时成像，为神经生物学研究提供可靠的实验方案。

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本工作获得了威尔奇基金会（I-1657）和美国国立卫生研究院（RO1EY18884）资助的支持。P.R.H. 是生物医学研究领域的尤金·麦克德莫特学者。

1. 引言
在本视频中，我们将演示如何制备 果蝇 用于活体成像和免疫组织化学的脑组织与视网膜制备，重点关注感光细胞。首先，我们将展示如何 准备 用于脑部解剖。接下来，我们将演示两种常用于免疫组织化学的基礎解剖方法，这两种方法也是活体样本制备的基础。这两种制备方法分别为成年果蝇脑组织和眼组织的解剖。随后，我们将演示用于 活体 对成年及发育中的大脑进行成像，重点介绍其在光感受器活体成像中的应用。最后，我们将描述活体组织成像的方法，并展示一些利用共振共聚焦显微镜进行活体成像的实例。
2. 解剖准备
<ol>
	<li>为了获得良好的解剖效果，你需要使用锋利的镊子。使用磨刀块或极细的砂纸（&gt;1500目），轻轻地将镊子两端来回研磨，直到尖端形成精细的尖点。我们通常使用标准的磨刀石。本文不详细介绍磨刀技术，但需注意，锋利的镊子对于活体解剖至关重要。每次解剖前我们都会重新磨砺镊子。</li>
	<li>对于成年果蝇脑解剖，将果蝇置于CO2麻醉垫上使其麻醉，并筛选出所需基因型的个体。对于蛹期解剖，只需用镊子小心地从培养管中取出一只蛹，注意避免破坏蛹壳。</li>
	<li>用清水润湿一张Kimwipe纸巾。在解剖过程中，你将使用它来清除镊子上的碎屑。将解剖皿放置在体视显微镜的载物台上，并加入HL3溶液1。所有解剖操作均需在HL3溶液中进行，以确保组织在解剖过程中保持活性和健康状态。此外，我们使用的解剖皿底部覆盖有Sylgard材料，以保护镊子在操作中不受损伤。</li>
	<li>如果你计划进行免疫组织化学实验，现在需准备固定液。取180μL HL3溶液加入500μL微量离心管中，再加入20μL 37%甲醛溶液，配制成3.7%的甲醛固定液。</li>
	<li>最后，正确的手部姿势对于高质量的解剖至关重要。良好的手部姿势可使镊子保持稳定，并实现精确而细微的操作。首先，将镊子放在拇指侧面，然后将食指垂直向下，指尖轻压在镊子上方。接着，将镊子侧面靠在中指侧面，并移至解剖皿上方。用拇指和中指接触解剖皿表面，同时将手腕稳定地支撑在显微镜载物台上。这样，在解剖过程中便有三个支撑点牢固接触台面，从而能够对镊子进行极其精细的操控。这一技术初学时可能略感别扭，但通过练习，你将很快掌握脑解剖的技巧。</li>
</ol>
3. 成年大脑
<ol>
	<li>在 CO2 麻醉垫上，将一只成年果蝇腹面朝上放置，头部远离操作者手部方向。用镊子夹住头部下方的胸部。操作正确时，果蝇的足和喙会伸展开来。在体视显微镜下观察，用镊子夹住伸展的喙并移除头部。弃去身体部分，将头部浸入溶液中。重新对浸没的头部进行聚焦。整个解剖过程均需在溶液中进行。至关重要的是，必须始终用镊子夹住头部，否则头部会漂浮且难以找回。若在解剖过程中头部移出焦平面，只需将其移回焦平面即可，无需调整显微镜。这一看似简单的操作起初可能较难掌握，但随着练习，保持头部在焦点内会变得越来越容易。</li>
	<li>开始解剖时，首先撕开喙与复眼之间的结缔组织。在始终用至少一把镊子牢固夹持的同时，撕开复眼组织。务必确保镊子尖端仅位于视网膜或表皮下方浅层，以避免损伤下方的脑组织。左右交替操作，用镊子逐步撕除视网膜，向头部后方推进。撕除视网膜可提高在整个解剖过程中视网膜外层（lamina）保持附着于视叶的可能性。继续绕至头部后方，沿途撕除表皮。撕开另一侧复眼后，开始剥离表皮。只要确保镊子夹持的是表皮组织，就可避免压碎脑组织！基于此原则，持续剥离表皮和视网膜，直至暴露出脑组织。</li>
	<li>一旦脑组织可见，即可开始去除附着在脑上的气管（图 1A）。继续撕除气管和表皮，直至脑组织完全分离。此时，应重新将焦点调整至培养皿底部，以进行后续步骤。需彻底清除残留气管，否则脑组织在过夜抗体孵育过程中可能漂浮。若需对光感受器终末进行成像，建议保留视网膜外层（lamina），但必须去除视网膜，因其含有细胞体及强自发荧光的色素。操作时应小心牵拉毛状且具色素的细胞残余物，避免损伤视网膜外层。此为较精细的操作，需通过练习掌握。</li>
	<li>成年果蝇脑组织可在我们将在第6节中讨论的条件下存活数小时甚至数天。进行免疫组织化学实验时，成年果蝇脑现已准备好用甲醛固定2。使用设定为 5μL 的 P20 移液器将成年果蝇脑转移至预先配制的固定液中。继续解剖成年果蝇脑约 20 分钟，通常可获得 4–10 个脑组织。将脑组织在固定液中继续固定 40 分钟（此时间可根据一抗染色效果优化调整）。移除甲醛溶液后，用含 PBS 和 0.4% TritonX-100 的溶液（以下简称 PBS-Triton）在 400μL 体积中清洗脑组织，每次 5 分钟，共清洗 3 次。彻底洗去固定液后，即可加入一抗溶液。</li>
</ol>
4. 成虫眼睛
<ol>
	<li>按照成年果蝇脑部解剖所述方法开始本解剖操作。将头部浸入溶液并重新对显微镜聚焦后，首先撕开吻部与复眼之间的结缔组织。在吻部上方，将外骨骼与复眼分离。接着，从复眼下方开始，向头部后方逐步分离外骨骼。用一把镊子夹住头后部中央，另一把镊子夹住复眼并向外拉。让复眼自然沉降至培养皿底部（图1B）。此时，视网膜下部的视叶（lamina）通常仍附着在复眼上，可用于对完整光感受器细胞终末进行活体成像。若需继续对光感受器细胞胞体进行活体成像，请转至第4.5节。接下来的三个小节介绍固定复眼的免疫组织化学染色方法。</li>
	<li>进行免疫组织化学染色时，使用设定为5μL的P20移液器将复眼转移至固定液中。继续解剖成年复眼，总时长约为10分钟。随后让复眼在固定液中再固定30分钟。移除固定液，并按照成年果蝇脑部解剖所述方法进行洗涤。</li>
	<li>若最终希望观察复眼的小眼结构，则必须在此时去除视叶（lamina）。将已固定的复眼放回解剖皿中，清除仍附着的任何气管或脂肪细胞。接着，用一把镊子夹住复眼外侧，另一把镊子小心去除视叶。视叶应能完整剥离，从而暴露出下方的光感受器细胞胞体（图1B）。操作时务必仅夹取视叶组织！否则可能导致光感受器从视网膜脱离。</li>
	<li>使用P20移液器将复眼转移至含有400μL PBS-Triton的500μL离心管中。在4°C下轻轻振荡过夜，以去除光感受器中的自发荧光红色色素。次日，可弃去洗涤液，并加入一抗溶液。</li>
	<li>对于成年果蝇复眼的活体成像，我们仅使用围蛹期成虫（pharate adult flies），即羽化前的晚期蛹。在此发育阶段，解剖过程中光感受器细胞胞体会与视叶中的终末自然分离。</li>
	<li>围蛹期蛹体具有清晰可见的翅膀、复眼及通过蛹壳可辨识的外骨骼。选取一个蛹体，剥除其前端蛹壳以暴露头部区域。小心移除包裹发育中果蝇的薄层内膜。用镊子夹住头部基部并轻轻拉出。在保持头部浸没于溶液中的同时，弃去蛹体其余部分。</li>
	<li>后续操作参照上述用于免疫组织化学的复眼解剖方法。然而，在围蛹期成虫阶段，光感受器细胞胞体会更易与视叶分离，从而便于对嵌于视网膜中的细胞胞体进行成像。此外，视叶仍附着于视叶外侧的视叶部分，因此可对远端视叶进行成像。若希望观察近端视叶区域（即可见光感受器终末小体的部位），则应在成年果蝇上进行复眼解剖，因为此时视叶与复眼的连接更为牢固。</li>
</ol>
5. 培养眼盘-脑复合体
<ol>
	<li>在20%蛹期发育（P+20%）阶段，发育中的眼盘已成为我们实验室活体成像的首选样本，因为这一单层相对较大的发育细胞可通过共聚焦显微镜轻松观察。3</li>
	<li>选择P+20%的蛹时，应寻找马氏管——即位于蛹壳下方出现的绿色斑点，并避免选择具有“深色躯体”的蛹。4 选定P+20%蛹后，将其浸入解剖皿中的HL3溶液中，小心移除蛹壳前部的一部分，注意不要刺穿内侧的薄层膜结构。用镊子夹住内膜并轻轻撕开。</li>
	<li>仔细检查释放出的内容物，寻找其中非常明显的发育中脑和眼盘组织（图1C）。在此变态阶段，脑与眼盘复合体易于分离。将脑组织移至解剖皿底部，小心地将中央脑与视叶分开。分离所得的视叶/眼盘将用于活体成像。</li>
</ol>
6. 活细胞成像：在显微镜下
<ol>
	<li>如果仅需在一种或两种溶液中进行短时间成像，可将组织置于载玻片上进行观察。此时，首先按照制造商说明，用Sylgard对载玻片表面进行包被处理。在载玻片中央加入20μL HL3溶液。将解剖后的组织连同额外20μL HL3溶液一同转移至载玻片上。组织必须始终避免暴露于空气中。此外，应避免移液操作或溶液表面张力对组织造成任何机械应力或形变。</li>
	<li>进行活体成像时，必须在尽量减少操作和接触的前提下牢固固定组织。我们采用一种可通过微电极施加的水聚合外科胶GluShield来稳定固定脑组织，该技术常规用于电生理实验中的胚胎样本制备5。获取用于电生理记录的玻璃电极，折断其尖端，并利用负压（通过口吸产生）将GluShield胶吸入电极末端。折断电极的长度应仅足以使胶体进入即可。随后施加正压，在HL3液滴下的Sylgard表面点加少量胶液。迅速将组织置于胶滴上，并保持活体成像所需的理想方向。此时可使用水浸物镜进行成像。若需加入膜通透性染料，可在成像过程中将其加入灌流液中。</li>
	<li>我们使用共振扫描共聚焦显微镜，可在降低光漂白的同时实现快速成像6。对于长时间成像，或需要完全更换溶液或多次更换溶液的情况，我们采用灌流室（Harvard IC30共聚焦成像室），并通过蠕动泵将培养液缓慢灌流至活体组织上（图2A）。持续的液体交换和尽量减少GluShield接触，可减轻长时间观察过程中组织出现的压扁现象7。需要注意的是，在发育时间过程的成像中，眼盘-脑复合体必须保持完整，且应尽量减少与胶的接触。</li>
	<li>使用经Sylgard液滴包被并修整至薄而平整的盖玻片。在盖玻片中央加入20μL HL3溶液，并将活体组织粘附于Sylgard表面。制备密封垫圈，确保气泡可通过灌流室而不使活体组织暴露于空气中（图2B）。垫圈厚度应足以避免压碎组织，同时又足够薄以使组织接近共聚焦显微镜物镜；我们在实验中使用250μm厚度的垫圈。组装灌流室时，需始终确保组织完全浸没于液体中。初始灌流速度可设置为约每分钟100μL，使用蠕动泵进行控制。该速度较快，具体需根据定义灌流室高度的垫圈厚度进行调整。若进行数小时尺度的成像，可能需要在培养液中添加20-羟基蜕皮酮和抗生素，但不应加入抗真菌剂，并将灌流速度降至每分钟约10μL。最后，我们将氧气通入供给灌流室的培养基中。</li>
</ol>
7. 代表性结果：
在本视频方案的最后，我们展示了利用第5节所述制备方法对发育中的感光细胞进行活体成像的示例。该制备方法利用果蝇（Drosophila）转基因技术，实现细胞特异性表达荧光报告蛋白。在所示示例中，两个荧光报告蛋白在感光细胞特异性驱动子GMR-Gal48的调控下表达：膜标记蛋白myrRFP和早期内体标记蛋白2xFYVE-GFP9。每1分钟采集一次三维双通道数据集，成像区域为70×70×17.5 μm，体素尺寸为137×137×700 nm（512×512×26）。视频展示了该四维数据集中某一选定层面随时间变化的动态过程，揭示了细胞内早期内体运输及囊泡融合事件的动态行为。固定组织样本（眼和视叶）的代表性图像见图3。

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</ol>

用于成像的荧光探针
本文描述了利用三类荧光探针研究黑腹果蝇（Drosophila）视觉系统的优点与局限性：（1）外源添加至活体组织样本的探针；（2）可遗传编码的荧光蛋白，适用于活体和固定样本的成像；（3）用于免疫组织化学的荧光染料，添加于固定后的组织样本中。
1. 外源性探针：
Lysotracker Green DND-26 或 Red DND-99（Invitrogen, Inc.）是市售的荧光膜通透性化合物，可在细胞内强酸性区室中富集，最显著的是溶酶体、晚期内体和自噬体。在纳摩尔浓度下（我们通常使用 50 nM），Lysotracker 可在不到一分钟内完全穿透 L3 和 P+20% 眼盘。由于 Lysotracker 会持续积累并产生碱化效应，我们通常在 5 分钟内完成成像。与眼盘不同，Lysotracker 无法在不破坏组织的情况下穿透脑组织。然而，小心撕裂外层膜可使染料在视叶中渗透数个细胞直径的深度。
Lysosensor DND-189（Invitrogen, Inc.）与Lysotracker不同，Lysosensor不会在酸性区室中积累，但在酸性pH条件下荧光增强。Lysosensor的穿透特性与Lysotracker非常相似。我们使用1μM浓度的Lysosensor。
2. 基因编码探针：
在许多活体成像实验中，我们利用二元 Gal4/UAS 表达系统12，表达带有各种荧光分子（如 GFP、TagRFP10 或对 pH 敏感的 pHluorin11）标记的基因。在发育中的感光细胞中表达的 Gal4 品系包括 GMR-Gal4（所有感光细胞）8 和 mDelta0.5-Gal4（发育中的 R4 和 R7）13。目前已存在多个亚型特异性的 Gal4 驱动品系，它们使用不同的视紫红质（Rhodopsin）启动子14。在活体成像中特别有用的荧光探针是光转化蛋白。我们已成功使用 Dendra2，一种由绿色转为红色的单体光转化蛋白15。需要注意的是，Dendra2 的设计是利用 488 nm 氩离子激光进行光转化。然而，在我们现有的实验装置下，无论是在常规还是共振式共聚焦扫描模式中，均无法通过可见蓝光实现有效的光转化。相比之下，使用 405 nm 紫外激光进行光转化则效率较高。
3. 免疫组织化学：
对于固定的成年果蝇眼睛，我们通常选择罗丹明标记的鬼笔环肽（rhodamine phalloidin，Invitrogen, Inc.）或抗Chaoptin抗体（一种光感受器特异性抗体16）来观察微绒毛结构（图1A）。分析视网膜小叶 cartridges 结构的一个有效方法是联合使用抗Chaoptin抗体16、胶质细胞标志物抗ebony抗体17以及抗sec6抗体18（图1B）。如图3所示，这种抗体组合能够区分视网膜小叶中的主要突触前成分（chaoptin）、突触后成分（sec6）以及上皮胶质细胞（ebony）19。
组装灌流室
对于活体成像，我们采用一种灌流室，可在不干扰组织制备的情况下实现溶液的缓慢更换。视频中包含了灌流室组装的演示，示意图见图2。灌流室的组装过程如图2A所示。首先将垫圈覆盖在标本上，然后按照图示继续组装。垫圈的作用是在灌流室底座与盖子之间形成一个空间，该空间用于密封组织并使溶液流过。垫圈内部的空间必须包含进液口（溶液从此处进入）、组织制备区域以及出液口（溶液从此处流出）。垫圈有两个关键特征：第一，垫圈必须足够厚以容纳脑组织，但又足够薄以便使用高分辨率物镜进行成像。理想的垫圈厚度取决于具体实验装置的参数。第二，垫圈上的一个切口形成一个隔间，允许气泡通过而不接触标本（图2B）。
显微镜成像
我们使用63倍（数值孔径1.3）的甘油浸没物镜用于灌流腔室，或直接在载玻片的培养基中使用63倍水浸物镜。甘油物镜比油镜具有更大的工作距离。我们采用共振扫描共聚焦显微镜，其扫描速度远高于传统扫描器（分别为8000 Hz与1400 Hz）。共振扫描可在更快速的帧率下实现随时间变化的三维记录。此外，更快的扫描速度显著降低了激光光毒性6，这对于活体组织的重复扫描是一个重要优势。必须在激光强度与光电倍增管（PMT）电压（增益）之间取得平衡，以在最小化噪声和光漂白的同时最大化信号。另一个重要考虑因素是，激光对特定区域的作用程度取决于分辨率和缩放倍数。例如，在256×256分辨率、2倍缩放与512×512分辨率、1倍缩放下，目标区域的扫描密度相同，但最大可能的活体成像速度在256×256、2倍缩放下快4倍。为了记录快速移动的细胞内区室的活动，我们已成功使用以下参数进行成像：每个z层堆栈采集5帧，每10秒获取一个z层堆栈，扫描速度为8000 Hz，并采用2次线平均。对于持续数小时的长时间成像实验，我们通常将帧率降低至每几分钟一帧，并选择更大的成像区域，因为样品在此类长时间实验中更可能发生位移。
Drosophila 视觉系统解剖结构
图3展示了成年果蝇（Drosophila）的眼部解剖结构（图3A）、成年脑组织（图3B）以及20%–25%蛹期眼盘/脑复合体（图3C）。图3A显示了附带和不附带视神经叶（lamina）及脂肪细胞的成年眼结构。在成年眼组织解剖过程中，位于眼睛中央、嵌在感光细胞体所形成的凹槽中的视神经叶（左侧），必须在不破坏下方细胞体的前提下被去除（右侧）。对于成年脑组织的解剖，应能够分辨出感光细胞体、视神经叶、视叶、中枢脑以及气管（图3B）。在此解剖过程中，需去除感光细胞和气管，同时保留视神经叶与视叶相连。为了便于识别20%–25%蛹期的眼盘/脑复合体，图3C提供了一张活体图像。
<img src="/files/ftp_upload/1936/1936fig1.jpg" alt="显示大脑、视叶和细胞体的神经解剖图；视网膜和感光细胞的解剖。" data-altupdatedat="1754907495000" data-alt="图1"> 图1. （A）成体脑。（B）成体眼。（C）20%-25% 蛹期眼盘/脑复合体。
<img src="/files/ftp_upload/1936/1936fig2.jpg" alt="微流控装置示意图，显示样本流、物镜、入口、出口、泵、垫圈和基座。" data-altupdatedat="1754907495000" data-alt="图 2"> 图 2. （A）灌流室组装示意图，以及（B）垫圈相对于样本的位置。
<img src="/files/ftp_upload/1936/1936fig3.jpg" alt="荧光显微镜图像；细胞结构，绿色/红色标记，实验比较。" data-altupdatedat="1754907495000" data-alt="图3"> 图3. （A）使用抗chaoptin对成体小眼面染色。（B）使用抗chaoptin（绿色，感光细胞）、抗ebony（红色，胶质细胞）和sec6（蓝色，中间神经元）对成体视叶染色。

<table><tbody><tr><td>Sylgard 184</td><td>道康宁</td><td>103251252</td><td></td></tr><tr><td>GluShield</td><td>GluStitch, Inc.</td><td>GB055QO</td><td></td></tr><tr><td>20-羟基蜕皮酮</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5142-10mg</td><td>5 mg/ml，溶于乙醇</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;果蝇大脑与视觉系统的活体成像制备方法&quot;&gt;特殊设备：&lt;/p&gt;&lt;ol&gt;&lt;li&gt;解剖显微镜：Leica Mz12.5 配数字相机&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Leica TCS SP5 共聚焦串联扫描显微镜，用于常规与共振扫描活体成像&lt;br/&gt; 成像显微镜，包括蓝色（488 nm）、绿色（561 nm）、橙色（594 nm）和远红光（633 nm）激光器，以及特殊的63倍、1.4数值孔径甘油浸没镜头和63倍、1.3数值孔径水浸没镜头。&lt;/li&gt;&lt;li&gt;哈佛仪器共聚焦成像室 RC-30 及蠕动泵型号 720&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Sutter 玻璃微电极拉制仪 P-97&lt;/li&gt;&lt;li&gt;软件：Amira 5.2，Visage Imaging&lt;/li&gt;&lt;/ol&gt;</td></tr></tbody></table>

发育期与成年个体的制备 果蝇 用于活体成像的大脑与视网膜

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

TheDrosophila大脑和视觉系统被广泛用作研究神经元发育、功能及退变的模型系统。本文展示了三种大脑和视觉系统的制备方法，涵盖了从发育期蛹中正在形成的视盘-脑复合体，到成年果蝇中分离的单个眼睛和大脑的完整范围。所有实验方案均针对组织活体培养进行了优化。此外，在适用的情况下，我们也提供了固定组织免疫组织化学的实验条件。最后，我们展示了利用灌流腔室结合常规及共振式4D共聚焦显微镜对这些样本进行活体成像的实验条件。综上所述，这些实验方案为在不同时间尺度上的活体成像研究奠定了基础，时间范围从以分钟为单位的细胞内功能检测，到以数小时为单位的发育或退行性过程观察。

本方案描述了三种黑腹果蝇（Drosophila）样品制备方法：1）成年果蝇脑组织解剖，2）成年果蝇视网膜解剖，以及3）发育中眼盘-脑复合体解剖。重点介绍了适用于活体成像的特殊制备技术和条件，尽管所有样品制备方法也可用于固定组织的免疫组织化学染色。

果蝇大脑和视觉系统被广泛用作研究神经元发育、功能及退变的模型系统。本文展示了三种……

在本视频中，我将演示如何制备用于活体成像和免疫组织化学的脑和视网膜样本，并重点关注感光细胞。首先，我将向您展示如何准备脑解剖操作。随后，我将演示三种不同的解剖方法：成年脑、成年视网膜以及发育中眼球的解剖。对于每种情况，组织均可用于免疫组织化学的固定处理，或进行活体成像。最后，我将介绍我们如何对活体组织进行成像，并展示一些使用共振扫描共聚焦显微镜进行活体成像的实例。那么，让我们开始吧。进行精细操作时，您需要使用尖头镊子。使用磨刀块或极细的砂纸，轻轻地将镊子两端来回研磨，直至尖端完全对齐。对于更精细的尖端处理，我们采用标准的磨刀石。此处不介绍磨针技术，但需要强调的是，锋利的镊子对于活体解剖至关重要。我们每天都会为成年果蝇脑解剖准备磨好的镊子。将果蝇置于 CO2 垫上进行麻醉，并分选出所需基因型的个体。进行瞳孔解剖时，只需将镊子伸入小瓶中，小心夹取一个瞳孔，注意避免损坏瞳孔囊。将一张Kimwipe纸揉成团，并用水润湿，解剖过程中可用它来清除镊子上的碎屑。将解剖皿置于体视显微镜的载物台上，并加入 HL3 溶液。所有解剖操作均需在 HL3 溶液中进行，以确保组织在解剖过程中保持存活和健康状态。此外，我喜欢使用底部覆盖有 Sylgard 材料的解剖皿，以保护解剖镊在操作过程中不受损伤。现在，准备固定液。如果计划进行免疫组织化学实验，将180 µL的HL-3加入500 µL的微量离心管中。加入20微升37%甲醛，以获得3.7%甲醛溶液。最后，正确的手部位置对于良好的解剖操作至关重要，保持良好的手部姿势可使镊子稳定并能够进行受控的细微操作。首先，将镊子放在拇指的一侧，然后将食指伸直向下，使指尖接触并压在镊子上方。接着，将镊子的一侧靠在中指的侧面，并移动至解剖皿。用拇指和中指接触解剖皿，同时将拇指和中指稳定地支撑在解剖皿边缘。将手腕固定在显微镜载物台上。像这样。在解剖过程中，您有三个支点牢固地接触表面，从而能够对镊子进行极其细微的操作。在 CO2 垫上。将一只成年果蝇腹面朝上放置，头部朝向远离您手的方向。抓住其头部正下方的胸部。若操作得当，在体视显微镜下观察时，果蝇腿部和喙会伸展出来。用镊子夹住伸展出的喙以取下头部，弃去身体部分，将头部浸入溶液中。重新对浸没的头部进行调焦。整个解剖过程均在溶液下进行。始终用镊子夹住头部非常重要，否则头部会漂浮。请记住，漂浮的头部总是难以找回。如果在解剖过程中头部移出焦点，只需将其移回焦平面即可，无需调整显微镜。这一看似简单的操作起初可能较难掌握，但随着练习，保持头部处于焦点将变得越来越容易。开始解剖时，首先撕开吻部与眼睛之间的结缔组织。操作时始终用至少一把镊子牢固夹住眼睛，同时撕开眼组织。确保镊子尖端仅位于视网膜或角质层下方浅层，避免损伤下方脑组织，操作过程中应左右交替进行。使用镊子从头部后方开始撕除视网膜。撕除视网膜有助于提高视叶与视神经节保持连接的可能性。在整个解剖过程中，继续沿头部后方操作，沿途撕除几丁质外骨骼，穿过另一只眼睛，并开始剥离外骨骼。只要夹住的是几丁质外骨骼，就说明没有压碎脑组织。基于这一原则，继续拉扯几丁质外骨骼和视网膜，直至暴露出脑组织。一旦脑组织可见，即可开始清除附着在脑上的气管，持续牵拉气管和几丁质外骨骼，直至将脑组织完全分离出来。此时，您应重新将焦点对准培养皿底部，以完成后续的感光细胞终末成像步骤。应尽量保留视网膜外丛状层（lamina），但需要去除含有细胞核且具有强烈自发荧光色素的视网膜组织。操作时，应小心牵拉残留的丛状细胞体部分，避免损伤视网膜外丛状层。这是一项更精细的技术，需要反复练习。去除剩余的气管，因为否则在过夜抗体孵育过程中脑组织可能会漂浮起来。通过我将在第七部分讨论的条件，成年动物脑组织可以存活数小时，甚至过夜。对于免疫组织化学实验，成年动物脑组织现已准备好进行固定和甲醛处理。使用已调至5微升的P20移液器，将成年果蝇脑转移至预先配制好的固定液中。继续解剖成年果蝇脑组织20分钟，此过程通常可获得4到10个脑组织。将脑组织在固定液中继续固定40分钟。然而，此持续时间可能有所不同。为了获得最佳的一抗染色效果，需移除甲醛溶液，并用含有 PBS 和 0.4% TRITON X-100 的溶液（以下简称 PBS Triton）对脑组织清洗三次，每次五分钟，每次使用 400 微升。在彻底洗去固定液后，可加入一抗溶液。按照成年脑解剖所述方法开始操作。将头部浸入溶液并重新对显微镜聚焦后，首先撕开位于吻部上方眼睛与吻部之间的结缔组织。将外骨骼与眼睛分离。然后用一把镊子从眼睛下方开始，朝头部后方方向，将外骨骼与眼睛下表面分离。进行此解剖时，抓住头部后方的中央部位。用另一把镊子压碎脑组织是可以的。抓住眼睛并将其拉开。让眼睛沉降至培养皿底部。视网膜神经上皮层可能仍附着于眼球，可用于对完整感光细胞的感光细胞终末进行活体成像。接下来的三个部分将介绍如何为免疫组织化学实验准备眼球。进行免疫组织化学时，将眼球转移至固定液中。使用P 20微量移液器（设定为5微升），继续解剖成年眼球，总共解剖10分钟。随后将眼球静置，额外固定30分钟。移除固定液，并按照成年果蝇脑解剖所述方法进行洗涤。如果最终需要观察眼球的组织结构，则必须将其取出。现在将固定的视眼放回解剖皿中，并去除仍可能附着的任何气管或脂肪细胞。然后用一把镊子夹住眼球外侧，用另一把镊子去除视网膜下层。应整块剥离，以暴露下方的细胞体。务必仅夹取视网膜下层，否则可能将细胞体从视网膜上分离。使用 P20 移液器，将眼组织转移至含有 400 µL PBS-Triton 的 500 µL 离心管中。在 4°C 下轻轻振荡孵育过夜，以在次日去除感光细胞中的自发荧光红色色素。可弃去洗涤液，并为无需视顶叶的成年果蝇眼组织活体成像添加一抗。我们仅使用雪貂成年果蝇，即即将羽化的晚期蛹。在此阶段，光感受器细胞体在雪貂解剖过程中与视叶中的终末分离。成年蛹具有清晰可辨的翅膀、眼睛和角质层，可通过蛹壳观察到。选择一只蛹，并将其浸入HL3中。移除蛹壳的前部，以暴露头部区域。小心地去除包裹发育中果蝇的薄内膜。用镊子夹住头部基部并拉出。丢弃蛹的其余部分，同时保持头部浸没在溶液中。随后按照成虫复眼阶段免疫组织化学染色的眼部解剖步骤进行操作。然而，感光细胞的细胞体将更容易从视网膜下层（lamina）脱离，从而便于您对嵌在视网膜中的细胞体进行成像。此外，视网膜下层仍与视叶保持连接，因此可以对远端视网膜下层进行成像。如果您希望观察到可见感光细胞终末小体的近端视网膜下层，则应在成年果蝇上进行眼部解剖，因为此时视网膜下层与眼部的连接更为牢固。在20%蛹期发育阶段，正在发育的眼盘已成为我们实验室活体成像的首选样本。由于这一单层相对较大的发育中细胞使用共聚焦显微镜易于观察。为挑选20%蛹期个体，应寻找精小管——即出现在角膜囊下方的绿色斑点，并避免选择身体已变暗的蛹，因为体色变深发生在20%蛹期发育之后。选择一只蛹后，将其浸入解剖皿中的 HL-3 溶液中，小心移除瞳孔囊的前部，注意不要刺破薄薄的内层膜。用镊子夹住内层膜并轻轻拉开。仔细检查释放出的组织内容，寻找发育中的脑和眼盘，这些结构非常明显。将脑组织分离至解剖皿底部。小心地将中央脑与视叶分开。将使用视叶 I 碟复合体进行活体成像。如果您仅需在一种或两种溶液中进行短时间成像，可将组织置于载玻片上进行成像。在此情况下，请先按照制造商的说明，用 Sylgard 对载玻片表面进行包被处理，以制备载玻片。取20微升HL-3，置于载玻片中央。将已解剖的组织连同额外的20微升HL-3液体转移至载玻片上。组织切片切勿暴露于空气中。此外，必须避免因移液操作带来的任何应力或应变。进行活体成像时，必须将组织牢固固定。获取一根玻璃电极，类似于用于电生理记录时拉制的电极。折断尖端，并通过口腔产生的负压将胶水吸入末端，仅折断足够长度的电极，以便胶水能够进入。接着使用正压，将少量胶水涂在HL3液滴下的挡板处。然后迅速将组织放置在胶水上，并保持活体成像所需的方位。现在可以使用水浸物镜进行成像。如果需要添加膜通透性染料，可将其加入灌流液中。在进行长时间成像或需要完全更换或多次更换溶液时，我们使用灌流室，该灌流室连接至蠕动泵，可缓慢地将培养液持续灌流过活体组织。使用盖玻片，其表面涂有一滴 Sylgard 并经修整以使其变薄且平整。取 20 µL HL-3 液滴加于盖玻片中央，将活体组织粘附于盖玻片上。制备一种垫片，允许气泡通过腔室，同时避免活体组织暴露于空气中。该垫片应足够厚以防止压碎组织，但又足够薄，使组织能够靠近共聚焦显微镜的物镜。组装灌流腔室时，需始终确保组织完全浸没在液体中。因此，溶液更换的速率最高可达每分钟100微升。对于持续数小时尺度的成像实验，可能需要添加20-羟基蜕皮酮（20-hydroxy ecdysone）和抗生素，但不添加抗真菌剂，并以约每分钟10微升的较慢速度进行灌注。此外，我们向供应蠕动泵的培养基中通入氧气气泡。现在您已掌握成功分离果蝇大脑和视网膜所需的全部技能。此外，您还可以对活体发育中的眼盘或成体感光细胞进行成像。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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发育期与成年个体的制备果蝇用于活体成像的大脑与视网膜

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