三维纸基微流体装置的制造用于免疫分析

该协议的总体目标是展示我们制造三维纸质设备的过程，我们将其用作开发即时免疫测定的平台。这种方法提供了一个具有可靠制造工艺的基于纸张的微流体平台，因此可以将时间和精力用于开发检测而不是设计设备。我们技术的主要优点是它允许并行制备许多设备，并且其数量符合学术研究项目的需求。

通常，新用户会很难使用这种方法，因为在制造设备时需要考虑许多变量，例如层的正确对齐。错误会导致设备出现故障。这种方法的视觉演示至关重要，因为仅使用手稿中提供的细节可能很难设想组装。

首先，通过将一张纸切割成标准纸张尺寸来准备定性滤纸层，以便于使用蜡质打印机进行图案化。将单页纸装入打印机纸盒。然后打印以前设计的图层。

接下来，使用台式切纸机将一排尼龙膜切成片状，在处理尼龙膜时要非常小心，以保持其完整性并防止撕裂。将任何未使用的材料存放在干燥柜中，因为尼龙膜对湿气敏感。使用蜡质打印机，将捕获层图案打印到一张复印纸上，然后将其粘在灯箱上，作为尼龙膜定位的指南。

然后，将一张干净的复印纸放在之前打印的复印纸上。将干净的纸张粘在灯箱上，但不要将两张纸粘在一起。现在，将一张剪下的尼龙膜放在干净的复印纸上，确保该膜覆盖复印纸底层的打印区域。

将尼龙膜的所有四个侧面都贴在干净的复印纸上。将一张由贴在其上的复印纸支撑的尼龙膜装入手动进纸打印机托盘。然后一次打印一张尼龙膜。

将打印层粘在亚克力框架上，以便在放入重力对流烤箱时均匀加热层的上方和下方。现在，将这些层放入 150 摄氏度的烤箱中 30 秒，直到蜡融化到纸张的厚度中。从烤箱中取出纸张后，将纸张翻转过来并检查设计中的缺陷，以确认蜡已渗透到纸张的厚度中。

从亚克力框架上取下纸和尼龙膜。然后使用切纸机从复印纸的支撑页上取下尼龙膜。使用机器人刀式绘图仪和预先准备好的设计文件对双面胶膜进行图案化。

然后，将需要用胶粘剂背衬的纸图案层贴在灯箱上，打印面朝下。从粘合剂的图案片上撕下保护衬垫的一侧。将胶粘剂的图案片和纸层压在一起。

然后将部分组装的设备放入保护片中。接下来，将得到的两层组件通过自动层压机，将胶粘剂和纸张完全压在一起，去除相邻层中的任何气袋。将共轭层粘在亚克力框架上，使要处理的亲水区悬浮起来，不与框架接触。

将 2.5 微升 BSA 和 1 X PBS 添加到偶联层的亲水区。让样品在室温下干燥 2 分钟后，在 65 摄氏度下干燥 5 分钟。在此之后，加入 5 微升与抗 β hCG 抗体偶联的 5 OD 胶体金纳米颗粒，然后重复干燥过程。

将横向通道层粘在亚克力框架上，使要处理的亲水区悬浮起来，不与框架接触。加入 10 微升封闭剂处理侧通道，然后重复用于共轭层的相同干燥过程。接下来，将捕获层粘在亚克力框架上，使要处理的亲水区域悬浮起来，不与框架接触。

用 5 μL 抗 α hCG 抗体处理捕获层。让样品在室温下干燥 2 分钟后，在 65 摄氏度下干燥 8 分钟。加入两微升封闭剂，然后重复与捕获层相同的干燥过程。

将洗涤层贴在灯箱上，打印面朝上。如果使用对齐孔，请使用手持式打孔工具将其从后续层中删除。撕掉捕获层背面的保护膜，露出胶粘剂。

以对齐孔为导向，将捕获层对准洗涤层上方，然后将两层压在一起，避免接触亲水区，以尽量减少污染或对设备的损坏。然后，撕掉孵育层背面的保护膜，露出粘合剂。将孵育层对齐捕获层上方并将它们压在一起。

继续以这种方式添加层，直到组装完所有活动层。现在，将部分组装的设备放入保护片中，并使用层压机将各层牢固地固定在一起。撕掉洗涤层背面的保护膜，并将印迹层贴在设备底部。

层压后完成三维纸基微流控装置的组装，使用剪刀从完全组装的装置片材上切割所需数量的装置。将 20 微升 hCG 缓冲液的阳性对照样品添加到设备顶部的亲水区。样品完全吸入设备后，加入 15 μL 洗涤缓冲液。

在第一等分试样的洗涤缓冲液完全渗入装置中后，加入第二份 15 μL 等分试样的洗涤缓冲液。为了揭示检测结果，使用镊子剥开设备的三个顶层以露出捕获层。蜡质打印方法可用于在纸基微流体设备内形成疏水屏障，并产生具有可重复尺寸的流体路径，这对于具有可重复性能和持续时间的分析至关重要。

通过并行进行 35 次阳性和 35 次阴性测定来证明基于 hCG 纸的免疫测定的性能。对于使用阴性样本进行的分析，每个数据集的变异系数确定为 1%，对于使用阳性样本进行的分析，变异系数为 3%。包含孵育通道和捕获区的层之间的错位会导致正信号中出现不规则模式，这可能导致对定性信号的误解。

如果蜡没有打印出足够的量或不允许在纸张厚度上完全熔化，则所得疏水屏障的完整性可能会受到影响，并导致设备内部泄漏。完成检测所需的时间超过预期可能表明设备制造出现故障。纸质微流控设备为研究人员提供了一个多功能平台，用于开发低成本的即时分析测试。

虽然存在许多应用，但我们在这里演示的方法会产生一种通用的设备架构来执行免疫分析，这在医疗保健中至关重要。在尝试此程序时，重要的是要记住在制造过程中以及在使用昂贵的生化试剂处理层之前检查是否有缺陷。一旦掌握，这种方法，从打印层到组装处理层，可用于在两个小时内制备一张功能免疫测定表。

观看此视频后，您应该对如何制造 3D 纸质设备有很好的了解，并能够根据其他感兴趣的分析类型定制该平台。