Name: 三维纸基微流体装置的制造用于免疫分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 33 s
Description: 学习三维纸基微流体装置的制造方法，用于开发即时检测免疫分析。该技术采用多层叠加制造工艺，支持并行制备多个装置，为学术研究提供可靠的微流控平台。

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本工作由塔夫茨大学以及詹姆斯·卡纳吉博士的慷慨捐赠资助。本材料基于美国国家科学基金会研究生研究奖学金计划（资助号：DGE-1325256）支持下开展的工作，该资助授予了 S.C.F.。D.J.W. 获得了美国教育部 GAANN 研究生奖学金的支持。我们感谢杰里米·肖恩霍恩博士（JanaCare）、杰森·罗兰博士（Carbon3D）和瑞秋·德雷尼（布朗大学）在三维纸质微流控装置及免疫分析方法设计开发过程中提供的帮助。

1. 基于纸张的微流控装置层的制备
<ol>
	<li>使用图形设计软件程序制备纸张、尼龙和粘合剂各层的图案。6 每一层可具有不同的图案。 
	注意：图案可包含对齐孔，这些对齐孔对于基于纸张的免疫测定功能并非必需，但有助于三维装置的可重复制造。若装置以单个、条带或整张形式组装，这些孔的位置将有所不同。用于设计图案的软件程序可能因图案化技术的选择（例如，光刻、蜡印或切割）而异。6</li>
	<li>用70%（v/v）乙醇水溶液喷洒工作区域，并用洁净的纸巾擦拭工作区域。</li>
</ol>
2. 试纸层的制备：样本添加、结合物储存、孵育和洗涤层
<ol>
	<li>使用大型台式纸张切割机准备定量滤纸的层片。将一整张纸裁剪为标准纸张尺寸，以便使用固体墨（蜡）打印机进行图案化。例如，一张 460 × 570 mm2 的纸张可裁剪为 4 张美标信纸（8.5 × 11 英寸2）。操作纸张时应始终佩戴洁净手套，以尽量减少污染。</li>
	<li>将裁好的层析纸装入打印机纸盒中。打印预先设计好的图层（见图 1）。 
	注意：可通过自动进纸直接将图案打印到该纸张上。每次仅打印一张纸，以避免卡纸。所有图层均应使用&#34;增强&#34;打印设置。</li>
</ol>
3. 尼龙膜层的制备：捕获层
<ol>
	<li>使用台式纸张裁切机将尼龙膜卷材裁切成片状（7.5 × 10 英寸2）。操作尼龙膜时需格外小心，以保持其完整性并防止撕裂。未使用的材料应储存于干燥柜中，因为尼龙膜对湿气敏感。 
	注意：裁切后的膜片比标准美式信纸窄。由于尼龙膜薄而脆弱，无法直接送入打印机，需使用支撑材料。具体细节如下所述。</li>
	<li>使用蜡质打印机将捕获层图案打印至一张复印纸上，并用胶带将其固定在光源板上，作为尼龙膜定位的参考指南。光源板有助于多层结构的对齐。</li>
	<li>将一张干净的复印纸放置在先前已打印的复印纸上。将这张干净的复印纸用胶带固定在光源板上，但不要将两张纸彼此粘贴在一起。</li>
	<li>将一片裁切好的尼龙膜放置在干净的复印纸上。确保尼龙膜覆盖底层复印纸上已打印的区域。用胶带将尼龙膜的四边固定在干净的复印纸上。 
	注意：务必确保尼龙膜平整光滑，以避免打印过程中出现问题（例如，卡纸或蜡质打印不均）。蜡质可能打印到尼龙膜与复印纸粘贴处的胶带上。若发生此情况，因胶带遮挡导致尼龙膜图案不完整的区域应予以弃用。在后续制备中，可使用更大尺寸的尼龙膜以避免此类打印错误。</li>
	<li>将附有支撑复印纸的尼龙膜片装入手动进纸打印机托盘中。每次仅打印一张尼龙膜片。 
	注意：印迹层无需任何预处理步骤，因其无需图案化。</li>
</ol>
4. 在打印层中创建疏水屏障
<ol>
	<li>将打印好的层固定在亚克力框架上，以便在重力对流烘箱中加热时，层的上下两面受热均匀。在蜡熔化并形成疏水屏障之前，保持尼龙膜粘附在复印纸的支撑纸上。 
	注意：该亚克力框架为定制的激光切割件，由厚度为1/2&#34;的亚克力塑料制成。根据所制备装置的数量不同，使用两种尺寸的框架。较小框架的外缘尺寸为11 5/8&#34; × 2 3/4&#34;，框架内孔尺寸为10 3/8&#34; × 1 3/4&#34;。较大框架的外缘尺寸为11 5/8&#34; × 8 7/8&#34;，框架内孔尺寸为10 1/4&#34; × 7 7/8&#34;。开放的内部空间可确保蜡在整个纸张厚度范围内均匀熔化。</li>
	<li>将层置于150 °C的烘箱中加热30秒，直至蜡完全熔化并渗入纸张厚度。通过翻转纸张并检查设计是否存在缺陷，确认蜡已渗透整个纸张厚度。 
	注意：也可使用强制通风烘箱或加热板来熔化固态蜡墨。熔化时间或温度可能因加热方式不同而有所变化。</li>
	<li>从亚克力框架上取下纸张和尼龙膜，并将尼龙膜从复印纸的支撑纸上剥离。</li>
</ol>
5. 黏附层的制备
<ol>
	<li>使用机器人刀具绘图仪和先前准备的设计文件（步骤 1.1）对双面胶膜进行图案化处理。使用蜡衬纸覆盖并保护任何暴露的胶粘表面。 
	注意：双面胶膜应被切割出孔洞，以允许样品作为连续的流体通路在各层之间流动。蜡衬纸可轻松从胶膜上剥离，并在切割过程中防止胶面受到污染或撕裂。也可使用激光切割机或模切机对胶膜层进行图案化处理。</li>
</ol>
6. 使用粘合剂对装置层进行背衬
<ol>
	<li>用70%（v/v）乙醇水溶液喷洒光源箱，然后用干净的纸巾擦拭。</li>
	<li>将需要背胶的图案化纸张或尼龙膜（印刷面朝下）用胶带固定在光源箱上。</li>
	<li>剥离图案化胶粘片一侧的保护衬层，并将其粘附到纸张或尼龙膜层上。利用光源箱确保图案对齐准确，然后压合。将部分组装好的装置放入保护套中。 
	注意：保护套是一片折叠的覆膜片基材，可防止装置在操作过程中被污染或损坏，确保其不与覆膜机的滚轮直接接触。</li>
	<li>将形成的双层结构通过自动覆膜机，使胶粘剂与纸张完全压合，排除各层间存在的任何气泡。 
	注意：装置各层之间的气泡可能引起泄漏，影响装置的完整性及毛细作用的重复性。</li>
</ol>
7. 装配设备前对共轭层进行免疫测定试剂处理
<ol>
	<li>将结合层粘贴到丙烯酸框架上，使待处理的亲水区域悬空，不与框架接触。</li>
	<li>在结合层的亲水区域加入 2.5 µl 浓度为 100 mg/ml 的牛血清白蛋白（BSA）溶液（溶于 1× 磷酸盐缓冲液，PBS），室温下干燥 2 分钟，随后在 65 °C 下干燥 5 分钟。 
	注意：该体积恰好足以润湿纸张的指定区域。BSA 溶液有助于防止胶体纳米颗粒在干燥过程中发生聚集，从而在样品重新润湿纸张和试剂时促进纳米颗粒的释放。</li>
	<li>加入 5 µl 浓度为 5 O.D. 的胶体金纳米颗粒-抗 β-hCG 抗体结合物，重复干燥过程。 
	注意：胶体金纳米颗粒浓度通常以光密度（O.D.）表示，即在波长 λ = 540 nm 处测得的吸光度值。在第 10 节装置组装前，无需对导流垫进行任何处理。</li>
</ol>
8. 装配装置前对侧通道进行免疫测定试剂处理
<ol>
	<li>将侧向通道层粘贴到丙烯酸框架上，使待处理的亲水区域处于悬空状态，不与框架接触。</li>
	<li>加入 10 µl 封闭剂（含 5 mg/ml 脱脂奶粉和 0.1% (v/v) Tween 20 的 1x PBS 溶液）处理侧向通道。干燥过程与结合物层相同（室温下 2 分钟，然后 65 °C 下 5 分钟）。</li>
</ol>
9. 装配设备前对捕获层进行免疫测定试剂处理
<ol>
	<li>将捕获层用胶带固定在丙烯酸框架上，使待处理的亲水区域悬空，不与框架接触。</li>
	<li>在捕获层上加入 5 µL 的 1 mg/ml 抗-α-hCG 抗体，室温下干燥 2 分钟，随后在 65 °C 下干燥 8 分钟。</li>
	<li>加入 2 µL 封闭剂（含 5 mg/ml 脱脂奶粉和 0.1% (v/v) Tween 20 的 1x PBS 溶液），重复对捕获层进行干燥。 
	注意：此用量足以包被纸材，同时避免使用过多封闭剂堵塞尼龙膜的孔隙。</li>
</ol>
10. 三维纸质微流控装置的组装
<ol>
	<li>将洗涤层用胶带固定在光源箱上（印刷面朝上）。如果使用对齐孔，请使用手持打孔器从后续各层中移除对齐孔。</li>
	<li>揭去捕获层背面的保护膜，露出粘合面。以对齐孔为参考，将捕获层对准并置于洗涤层上方，然后将两层压合在一起。避免触碰亲水区域，以尽量减少污染或对装置造成损坏。可使用镊子辅助组装。</li>
	<li>揭去孵育层背面的保护膜，露出粘合面。将孵育层对准并置于捕获层上方，压合两层。以此方式继续添加各层，直至所有功能层完成组装。</li>
	<li>将部分组装好的装置放入保护衬片中，使用覆膜机将各层牢固压合。</li>
	<li>揭去洗涤层背面的保护膜，将印迹层粘附在装置底部。重复步骤10.4的覆膜操作，完成三维纸基微流控装置的组装。使用剪刀从完全组装好的装置条带或整板上裁剪出所需数量的单个装置。 
	注意：整板装置、条带装置或单个装置均可采用类似方法制备。</li>
</ol>
11. 进行基于纸张的免疫测定
<ol>
	<li>向装置顶部的亲水区域加入 20 µl 样品（即样品层</li>
	<li>等待样本完全渗入装置后，加入 15 µl 洗涤缓冲液（含 0.05% v/v Tween 20 的 1× 磷酸盐缓冲液）。待第一份洗涤缓冲液完全渗入装置后，再加入第二份 15 µl 的洗涤缓冲液。 
	注意：当液滴完全渗入装置且纸张表面无弯月面时，表明洗涤缓冲液已完全渗入。当第二份洗涤缓冲液完全进入装置后，检测即完成。</li>
	<li>使用镊子剥离装置的最上层三层，以暴露捕获层，从而显示检测结果。
	<ol>
		<li>通过观察颜色的有无，对检测结果进行定性解读。或者，使用台式扫描仪对读出层成像，并利用图像处理软件或算法对结果进行定量分析，表征检测区域内的信号强度分布。20</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Martinez, A. W., Phillips, S. T., Wiley, B. J., Gupta, M., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLASH%3A+A+rapid+method+for+prototyping+paper-based+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">FLASH: A rapid method for prototyping paper-based microfluidic devices.</a> Lab Chip. 8 (12), 2146-2150 (2008).</li>
<li>Carrilho, E., Martinez, A. W., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ac901071p">Understanding wax printing: a simple micropatterning process for paper-based microfluidic devices.</a> Anal. Chem. 81 (16), 7091-7095 (2009).</li>
<li>Martinez, A. W., Phillips, S. T., Butte, M. J., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned+paper+as+a+platform+for+inexpensive%2C+low-volume%2C+portable+bioassays%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Patterned paper as a platform for inexpensive, low-volume, portable bioassays.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 46 (8), 1318-1320 (2007).</li>
<li>Martinez, A. W., Phillips, S. T., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostics+for+the+developing+world%3A+microfluidic+paper-based+analytical+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Diagnostics for the developing world: microfluidic paper-based analytical devices.</a> Anal. Chem. 82 (1), 2-10 (2010).</li>
<li>Cate, D. M., Adkins, J. A., Mettakoonpitak, J., Henry, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+in+paper-based+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Recent developments in paper-based microfluidic devices.</a> Anal. Chem. 87 (1), 19-41 (2015).</li>
<li>Li, X., Ballerini, D. R., Shen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perspective+on+paper-based+microfluidics%3A+Current+status+and+future+trends%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">A perspective on paper-based microfluidics: Current status and future trends.</a> Biomicrofluidics. 6, 011301(2012).</li>
<li>Lisowski, P., Zarzycki, P. K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3779795/">Microfluidic paper-based analytical devices (µPADs) and micro total analysis systems (µTAS): Development, applications and future trends.</a> Chromatographia. 76, 1201-1214 (2013).</li>
<li>Pollock, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+paper-based+multiplexed+transaminase+test+for+low-cost%2C+point-of-care+liver+function+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">A paper-based multiplexed transaminase test for low-cost, point-of-care liver function testing.</a> Sci. Transl. Med. 4 (152), 152ra129(2012).</li>
<li>Mentele, M. M., Cunningham, J., Koehler, K., Volckens, J., Henry, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+paper-based+analytical+device+for+particulate+metals%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Microfluidic paper-based analytical device for particulate metals.</a> Anal. Chem. 84 (10), 4474-4480 (2012).</li>
<li>Weaver, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paper+analytical+devices+for+fast+field+screening+of+beta+lactam+antibiotics+and+antituberculosis+pharmaceuticals%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Paper analytical devices for fast field screening of beta lactam antibiotics and antituberculosis pharmaceuticals.</a> Anal. Chem. 85 (13), 6453-6460 (2013).</li>
<li>Martinez, A. W., Phillips, S. T., Carrilho, E., Thomas, S. W., Sindi, H., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+telemedicine+for+developing+regions%3A+camera+phones+and+paper-based+microfluidic+devices+for+real-time%2C+off-site+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Simple telemedicine for developing regions: camera phones and paper-based microfluidic devices for real-time, off-site diagnosis.</a> Anal. Chem. 80 (10), 3699-3707 (2008).</li>
<li>Martinez, A. W., Phillips, S. T., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+microfluidic+devices+fabricated+in+layered+paper+and+tape%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional microfluidic devices fabricated in layered paper and tape.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (50), 19606-19611 (2008).</li>
<li>Vella, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ac203434x">Measuring markers of liver function using a micro-patterned paper device designed for blood from a fingerprick.</a> Anal Chem. 84 (6), 2883-2891 (2012).</li>
<li>Nie, Z., Deiss, F., Liu, X., Akbulut, O., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+paper-based+microfluidic+devices+with+commercial+electrochemical+readers%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Integration of paper-based microfluidic devices with commercial electrochemical readers.</a> Lab Chip. 10 (22), 3163-3169 (2010).</li>
<li>Martinez, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+diagnostic+devices+made+from+paper+and+tape%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Programmable diagnostic devices made from paper and tape.</a> Lab Chip. 10 (19), 2499-2504 (2010).</li>
<li>Connelly, J. T., Rolland, J. P., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Paper+machine%22+for+molecular+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">"Paper machine" for molecular diagnostics.</a> Anal. Chem. 87 (15), 7595-7601 (2015).</li>
<li>Schonhorn, J. E., Fernandes, S. C., Rajaratnam, A., Deraney, R. N., Rolland, J. P., Mace, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+device+architecture+for+three-dimensional%2C+patterned+paper+immunoassays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A device architecture for three-dimensional, patterned paper immunoassays.</a> Lab Chip. 14 (24), 4653-4658 (2014).</li>
<li>Fernandes, S. C., Logounov, G. S., Munro, J. B., Mace, C. R. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/Content/ArticleLanding/2016/AY/c6ay01558a#!divAbstract">Comparison of three indirect immunoassay formats on a common paper-based microfluidic device architecture.</a> Anal. Methods. 8 (26), 5204-5211 (2016).</li>
<li>Deraney, R. N., Mace, C. R., Rolland, J. P., Multiplexed Schonhorn, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((patterned-paper+immunoassay+for+detection+of+malaria+and+dengue+fever%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">patterned-paper immunoassay for detection of malaria and dengue fever.</a> Anal. Chem. 88 (12), 6161-6165 (2016).</li>
<li>Abramoff, M., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="https://imagescience.org/meijering/publications/download/bio2004.pdf">Image processing with ImageJ.</a> Biophotonics Int. 11 (7), 36-42 (2004).</li>
<li>Derda, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multizone+paper+platform+for+3D+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Multizone paper platform for 3D cell cultures.</a> PLoS ONE. 6 (5), e18940(2011).</li>
<li>Mace, C. R., Deraney, R. N. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s10404-013-1314-6">Manufacturing prototypes for paper-based diagnostic devices.</a> Microfluid. Nanofluidics. 16 (5), 801-809 (2014).</li>
<li>Liu, H., Crooks, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+paper+microfluidic+devices+assembled+using+the+principles+of+origami%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional paper microfluidic devices assembled using the principles of origami.</a> J. Am. Chem. Soc. 133 (44), 17564-17566 (2011).</li>
<li>Kalish, B., Tsutsui, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Adhesive+patterning+to+construct+3D+paper+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Using Adhesive patterning to construct 3D paper microfluidic devices.</a> J. Vis. Exp. (110), e53805(2016).</li>
<li>Scida, K., Cunningham, J. C., Renault, C., Richards, I., Crooks, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple%2C+sensitive%2C+and+quantitative+electrochemical+detection+method+for+paper+analytical+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Simple, sensitive, and quantitative electrochemical detection method for paper analytical devices.</a> Anal. Chem. 86 (13), 6501-6507 (2014).</li>
<li>Lewis, G. G., DiTucci, M. J., Baker, M. S., Phillips, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+method+for+prototyping+three-dimensional%2C+paper-based+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">High throughput method for prototyping three-dimensional, paper-based microfluidic devices.</a> Lab Chip. 12 (15), 2630-2633 (2012).</li>
<li>Kalish, B., Tsutsui, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned+adhesive+enables+construction+of+nonplanar+three-dimensional+paper+microfluidic+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Patterned adhesive enables construction of nonplanar three-dimensional paper microfluidic circuits.</a> Lab Chip. 14 (22), 4354-4361 (2014).</li>
<li>Camplisson, C. K., Schilling, K. M., Pedrotti, W. L., Stone, H. A., Martinez, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-ply+channels+for+faster+wicking+in+paper-based+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Two-ply channels for faster wicking in paper-based microfluidic devices.</a> Lab Chip. 15 (23), 4461-4466 (2015).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

确定一种可重复的制造策略是检测方法开发中的关键环节。22 我们采用逐层叠加的顺序方法来制造基于纸张的三维微流控装置。与那些通过折叠或折纸技术从单张纸制备多层装置的方法相比23,24，增材制造具有多项优势：（i）可在不改变各层打印、对准或组装方法的前提下，将多种材料整合到单一装置结构中。（ii）可在组装过程中集成图案化压敏胶膜。这些胶膜用于固定相邻层，并且根据胶粘剂强度的不同，可实现可逆粘接，从而便于剥离并观察内部层结构。此外，胶粘剂为三维装置提供了结构完整性，因而无需使用粘合剂25、夹具或机械加工外壳。23（iii）单张美标A4色谱纸可容纳大量重复样本阵列，显著提高实验室规模制造的通量（图5）。当需要评估多种实验条件并进行技术重复时，这一优势尤为显著。通过该方法，可同时制备70个三维纸基微流控装置。（iv）类似的多层覆膜技术已广泛应用于医疗领域多...

纸张具有多种配方或等级，来源广泛，可通过功能化处理调节其性能，并能通过毛细作用或芯吸作用自主运输液体。若使用疏水性物质（例如，光刻胶1 或石蜡2）对纸张进行图案化处理，则可在纸层内实现对液体芯吸过程的空间控制。例如，施加的水相样品可被引导进入多个不同区域，与预先固定在纸张中的化学或生物化学试剂发生反应。这些基于纸张的微流控装置已被证明是开发便携式、低成本分析检测方法的有效平台3,4,5,6,7。基于纸张的微流控装置的应用包括现场即时诊断8、环境污染物监测9、假药识别10，以及在资源有限环境中实现分散化医疗（或&#34;远程医疗&#34;）11。
多层图案化纸张可组装成一体化装置，其中相邻层（即 上层或下层）的亲水区域相互连接，形成连续的流体网络，其入口和出口可相互耦合或保持独立。12 每一层均可包含独特的图案，从而实现在单一装置上对试剂和多种检测进行空间分离。所形成的三维微流控装置不仅能够通过毛细作用输送液体以实现分析检测（例如 肝功能检测13 和小分子的电化学检测14），还可支持多种传统微流控技术中常见的复杂功能（例如 阀门15 和简单机械结构16）。重要的是，由于纸张依靠毛细作用输送液体，这些装置几乎无需用户额外操作即可运行。
由于试剂可以储存在基于纸张的三维结构装置中，复杂的实验流程可简化为仅需向装置中加入一次水溶液样本。最近，我们介绍了一种通用的三维装置结构，该结构可通过蜡印技术制备具有图案化的层，用于开发基于纸张的免疫分析方法17,18。这些研究重点探讨了装置设计的若干方面——包括所用堆叠层数、层的组成以及三维微流控网络的图案——如何影响免疫分析的整体性能。最终，我们利用这些设计原则实现了多重免疫分析的快速开发19。在本论文中，我们以先前开发的人绒毛膜促性腺激素（hCG；妊娠激素）免疫分析方法17为例，说明我们在三维纸基免疫分析装置的组装与制造方面所发展的策略。因此，本文重点介绍装置的组装与操作，而非分析方法的开发过程。
在夹心免疫测定法中（该方法用于检测hCG），一种针对激素某一亚基的特异性捕获抗体被包被在固相载体上，随后进行封闭以减少样本或后续试剂的非特异性吸附。这种载体通常为聚苯乙烯微孔板（例如，用于酶联免疫吸附测定，即ELISA）。然后将样本加入微孔中，并孵育一段时间。经过充分洗涤后，加入针对hCG另一亚基的特异性抗体并进行孵育。该检测抗体可偶联胶体颗粒、酶或荧光团，以产生可测量的信号。在读取检测结果前（例如，使用酶标仪），需再次对微孔进行洗涤。尽管商业试剂盒依赖于这种耗时的多步骤流程，但这些步骤可在基于纸张的微流控装置中快速完成，且用户几乎无需干预。
用于hCG免疫测定的装置包含六个功能层，自上而下分别为样品添加层、结合物储存层、孵育层、捕获层、洗涤层和吸水层（图1）。样品添加层由定性滤纸制成，用于引入液体样品，并保护结合物层中的试剂免受环境污染物或使用者意外接触的影响。结合物层（定性滤纸）含有产生颜色的试剂（例如，胶体金标记抗体），用于免疫测定反应。孵育层（定性滤纸）允许样品在滤纸平面内横向移动，以便在到达下一层（即捕获层）前促进待测物与试剂之间的结合。捕获层（尼龙膜）含有固定在材料上的、针对待测物的特异性配体。测定完成后，该层将暴露出来，以便观察形成的免疫复合物。洗涤层（定性滤纸）将包括游离结合物试剂在内的过量液体从捕获层表面引向吸水层（厚层析纸）。六层结构通过五层图案化双面胶粘剂固定在一起：其中四层为永久性胶粘剂，用于维持装置组装后的完整性；另一层为可移除胶粘剂，便于剥离装置以检查捕获层上的免疫测定结果。
在本论文中，我们仅使用人绒毛膜促性腺激素（hCG）的阴性对照和阳性对照样本（分别为 0 mIU/mL 和 81 mIU/mL），以提供基于纸张的免疫分析方法的代表性结果，从而能够专门讨论器件的制备方法与其性能之间的关系。除了展示如何成功制造器件外，我们还强调了若干可能导致器件失效或检测结果不可重复的制造错误。本文详述的实验方案与讨论将为研究人员提供有关纸基免疫分析器件设计与制备的宝贵见解。尽管我们的演示重点是免疫分析，但我们预期本文所提供的指导原则对于三维纸基微流控器件的制造也具有广泛的参考价值。

<table><tbody><tr><td>Illustrator CC</td><td>Adobe</td><td></td><td>用于设计纸张和粘合剂层的图案</td></tr><tr><td>Xerox ColorQube 8580 打印机</td><td>Amazon</td><td>B00R92C9DI</td><td>用于将蜡图案打印到纸张和尼龙层上</td></tr><tr><td>Isotemp 通用加热干燥箱</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-103-0509</td><td>用于将蜡熔入纸张</td></tr><tr><td>Artograph LightTracer</td><td>Amazon</td><td>B000KNHRH6</td><td>用于辅助各层的对齐</td></tr><tr><td>Apache AL13P 覆膜机</td><td>Amazon</td><td>B00AXHSZU2</td><td>用于将各层压合在一起</td></tr><tr><td>Graphtec CE6000 切割绘图仪</td><td>Graphtec America</td><td>CE6000-40</td><td>用于制作粘合膜的图案</td></tr><tr><td>Swingline 纸张裁切机</td><td>Amazon</td><td>B0006VNY4C</td><td>用于裁切纸张或器件</td></tr><tr><td>Epson Perfection V500 照片扫描仪</td><td>Amazon</td><td>B000VG4AY0</td><td>用于扫描读出层的图像</td></tr><tr><td>经济型钳式打孔器</td><td>McMaster-Carr</td><td>3488A9</td><td>用于去除对齐孔&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Whatman 色谱纸，4号</td><td>Sigma Aldrich</td><td>WHA1004917</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 色谱纸（厚型）&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-714-4</td><td>用作吸附层</td></tr><tr><td>Immunodyne ABC（0.45 &amp;micro;m 孔径）</td><td>Pall Corporation</td><td>NBCHI3R</td><td>用作捕获层材料</td></tr><tr><td>可移除/永久性双面胶带衬纸</td><td>FLEXcon</td><td>DF021621</td><td>便于剥离操作</td></tr><tr><td>永久性双面胶带衬纸</td><td>FLEXcon</td><td>DF051521</td><td></td></tr><tr><td>蜡质衬纸</td><td>FLEXcon</td><td>FLEXMARK 80 D/F PFW LINER</td><td>辅助粘合剂图案化</td></tr><tr><td>丙烯酸板</td><td>McMaster-Carr</td><td>8560K266&amp;nbsp;</td><td>用于制作框架</td></tr><tr><td>自粘性保护片</td><td>Fellowes</td><td>CRC52215</td><td>用作保护滑片</td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>VWR</td><td>89125-172</td><td>用于消毒工作区域</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>AMRESCO</td><td>0332</td><td></td></tr><tr><td>Sekisui Diagnostics OSOM hCG 尿液对照品</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-071-066</td><td>用作阳性和阴性样本</td></tr><tr><td>抗-&amp;beta;-hCG 单克隆抗体胶体金结合物（克隆1）</td><td>Arista Biologicals&amp;nbsp;</td><td>CGBCG-0701</td><td>用于处理结合层</td></tr><tr><td>山羊抗-&amp;alpha;-hCG 抗体</td><td>Arista Biologicals&amp;nbsp;</td><td>ABACG-0500</td><td>用于处理捕获层</td></tr><tr><td>10X 磷酸盐缓冲液</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3991</td><td></td></tr><tr><td>Oxoid 脱脂奶粉</td><td>Thermo Scientific</td><td>OXLP0031B</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>AMRESCO</td><td>M147</td><td></td></tr></tbody></table>

用于免疫分析的三维纸质微流控装置的制备

Fabrication of Three-dimensional Paper-based Microfluidic Devices for Immunoassays

由于毛细作用，纸张能够自主输送液体。通过在纸张上构建疏水性屏障图案，可在纸层内控制并引导液体的传输。此外，将多层带有图案的纸张堆叠起来，可形成复杂的三维微流控网络，从而支持分析和生物分析检测方法的开发。基于纸张的微流控装置成本低廉、便于携带、操作简便，且无需外部设备即可运行。因此，这类装置作为即时诊断（point-of-care diagnostics）平台具有广阔的应用前景。为了准确评估基于纸张的装置的实用性及其分析性能，必须建立适当的方法，以确保其制造过程具有可重复性，并能够适应实验室环境下的规模化需求。本文描述了一种用于制备适用于纸基免疫分析的通用装置结构的方法。我们采用一种增材制造技术（多层覆膜）来制备包含多层图案化纸张和图案化粘合剂的装置。除了展示如何正确使用这些三维纸基微流控装置进行人绒毛膜促性腺激素（hCG）免疫分析外，本文还讨论了制造过程中可能导致装置失效的常见错误。我们预期，这种纸基装置的制造方法将在针对资源有限环境设计的分析应用开发中发挥广泛的用途。

获得可重复的三维纸基微流控装置检测性能依赖于一种能够确保装置间一致性的制造方法。为实现这一目标，我们确定了若干制造工艺和材料选择因素，并在此以纸基免疫分析的演示为例进行讨论。我们采用蜡印法在纸基微流控装置内形成疏水屏障（图 2A).2 该方法的理想之处在于仅需使用广泛可得的办公设备，操作步骤极少，且无需使用任何化学试剂例如，光刻胶）可能会干扰蛋白质吸附或改变纸纤维的润湿性。此外，蜡印技术可形成尺寸可重复的微流通道，这对于确保检测方法具有可重复的性能和反应时间至关重要。在形成疏水屏障后，通过粘合层压膜将各层粘合，以促进三维装置的组装图2B）。在将粘合膜添加到某一层的背面后，可施加免疫测定所需的任何试剂图2C）。该步骤在学术实验室的制备工艺中具有实用价值，因为可同时平行制备多个装置。在将装置的所有层依次堆叠并热压粘合后，即完成免疫分析装置的组装过程。图 2D）。我们加入样本以开...

我们详细介绍了一种用于构建基于纸张的三维微流控装置的方法，该装置可用于免疫测定的开发。我们的装置组装方法属于一种多层增材制造技术。我们展示了夹心免疫测定法，以提供此类基于纸张的装置的代表性结果。

纸张通过毛细作用自主输送液体。通过在纸张上构建疏水屏障图案，可实现对液体传输的控制，并……

本方案的总体目标是展示我们用于制备三维纸质器件的流程，该器件被用作开发即时检测免疫分析方法的平台。该方法提供了一种基于纸张的微流控平台，并具备可靠的制造工艺，使得研究人员可将时间和精力集中于分析方法的开发，而非器件设计。本技术的主要优势在于，能够并行制备大量器件，满足学术研究项目所需的数量要求。通常，新用户在使用该方法时会遇到困难，因为在制备器件时需要考虑诸多变量，例如各层之间的精确对齐。操作失误可能导致器件功能异常。对该方法进行可视化演示至关重要，因为仅凭文献中提供的文字细节，难以准确想象和完成组装过程。首先，将滤纸原纸裁剪成标准纸张尺寸，以方便使用蜡质打印机进行图案化处理。将裁剪好的纸张放入打印机纸盒中，然后打印预先设计好的图层。接下来，使用台式纸张裁切机将尼龙膜原片裁剪成片状，操作时需格外小心，以保持尼龙膜的完整性并防止撕裂。未使用的材料应储存于干燥柜中，因为尼龙膜对湿气敏感。使用蜡笔打印机将捕获层图案打印到一张复印纸上，并用胶带将其固定在光源箱上，作为尼龙膜定位的参考指南。随后，将一张干净的复印纸覆盖在先前已打印的复印纸上。用胶带将干净的复印纸固定在光源箱上，但不要将两张复印纸粘在一起。接着，将一张裁剪好的尼龙膜放置在干净的复印纸上，确保膜完全覆盖底层复印纸的打印区域。用胶带将尼龙膜的四边固定在一张干净的复印纸上。将附着在复印纸上的尼龙膜放入手动进纸打印机托盘中，每次打印一张尼龙膜。将打印好的纸层粘贴到亚克力框架上，以便在重力对流烘箱中加热时，纸层上下两面受热均匀。接着，将纸层放入烘箱中，在150摄氏度下加热30秒，直至石蜡熔化并渗透至纸张厚度。从烘箱中取出纸张后，将其翻转，检查设计是否存在缺陷，以确认石蜡已完全渗透纸张厚度。从丙烯酸框架上取下纸张和尼龙膜。然后使用切纸机将尼龙膜从复印纸的支撑纸上分离。使用机器人刀具绘图仪，根据预先准备好的设计文件对双面自粘膜进行裁切成型。随后，将需要背胶的图案纸张（印刷面朝下）用胶带固定在光源箱上。从图案胶片上剥离一侧的保护衬纸。将胶片与纸张层压在一起。然后将部分组装好的装置放入保护套中。接着，将由此形成的双层组件通过自动覆膜机，使粘合剂和纸张完全压合，去除各粘连层之间可能存在的任何气泡。将一张结合层用胶带固定在丙烯酸框架上，使待处理的亲水区域保持悬空，不与框架接触。向结合层的亲水区域加入 2.5 µL BSA 和一倍 X PBS。室温下静置干燥 2 分钟后，于 65 °C 干燥 5 分钟。随后，加入 5 µL 浓度为 5 OD 的胶体金纳米颗粒-抗 β-hCG 抗体结合物，然后重复干燥步骤。将侧向通道层粘贴到丙烯酸框架上，使待处理的亲水区域悬空，且不与框架接触。加入10微升封闭剂以处理侧向通道，然后重复使用与共轭层相同的干燥过程。接着，将捕获层粘贴到丙烯酸框架上，使待处理的亲水区域悬空，且不与框架接触。取5 µL抗-α-hCG抗体处理捕获层。室温下静置干燥2分钟后，于65 °C下干燥8分钟。加入2 µL封闭剂，然后重复与捕获层相同的干燥步骤。将洗涤层用胶带固定在光源箱上，印刷面朝上。如果使用了对齐孔，则使用手持打孔器从后续层上去除对齐孔。撕去捕获层背面的保护膜，以露出粘合剂。利用对齐孔将捕获层置于洗涤层上方进行对齐，然后将两层压合在一起，避免触碰亲水区域，以尽量减少污染或对装置造成损坏。随后，移除孵育层背面的保护膜以暴露粘合剂。将孵育层对齐置于捕获层上方，并将其压合在一起。以这种方式继续添加各层，直至所有活性层均组装完毕。现在，将部分组装好的装置放入保护套中，并使用覆膜机将各层牢固地压合在一起。移除洗涤层背面的保护膜，并将印迹层贴附在装置底部。完成三维纸基微流控装置的压膜组装后，使用剪刀从完全组装好的装置板上裁下所需数量的装置。向装置顶部的亲水区域加入20微升人绒毛膜促性腺激素（hCG）缓冲液的阳性对照样品。待样品完全通过芯吸作用进入装置后，加入15微升洗涤缓冲液。当第一份洗涤缓冲液完全渗入装置后，加入第二份15 µL的洗涤缓冲液。为显示检测结果，使用镊子剥离装置的上层三层材料，暴露出捕获层。蜡印法可用于在基于纸张的微流控装置中形成疏水屏障，并生成具有可重复尺寸的流体通道，这对于实现检测结果的可重复性以及反应时间的一致性至关重要。通过平行进行35次阳性检测和35次阴性检测，验证了基于纸张的hCG免疫测定法的性能。使用阴性样本进行检测时，每组数据的变异系数为1%；使用阳性样本时，变异系数为3%。孵育通道和捕获区所组成的各层之间若发生错位，可能导致阳性信号呈现不规则的图案，从而引起对定性信号的误判。如果蜡未被充分打印或未完全熔融穿透纸张的整个厚度，则所形成的疏水屏障完整性可能受损，导致装置内发生泄漏。实验耗时超过预期可能表明装置制备过程中存在故障。基于纸张的微流控装置为研究人员提供了一个多功能平台，可用于开发低成本、适用于现场检测的分析方法。尽管存在多种应用，但我们在此演示的方法能够构建一种通用的设备结构，用于进行免疫测定，而免疫测定在医疗保健中至关重要。在实施该过程时，必须注意在制造过程中以及在使用昂贵的生化试剂处理各层之前，检查是否存在缺陷。一旦掌握，该方法从打印各层到组装经处理的各层，可在两小时内完成一张功能性免疫测定芯片的制备。观看本视频后，您应能充分理解如何制备三维纸质微流控装置，并能够自如地将该平台改造用于其他感兴趣的检测类型。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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