细胞的浸入式印刷到改性表面采用连续流动Microspotter
2014年4月22日
这种 3D 微流控打印技术将细胞阵列打印到水下表面上。 我们描述了细胞阵列如何在 3D 流动池中以微流体方式输送到浸没表面上。 通过在浸没表面打印，产生了细胞微阵列，允许在多个区域进行药物筛选和细胞毒性评估。
该程序的总体目标是将三个 T 3 成纤维细胞打印到血清包被的表面上。这是通过首先将血清预吸附到组织组织培养物表面来实现的。第二步是使用连续流微量点样器将成纤维细胞悬浮液打印到表面，然后将细胞在 37 摄氏度下孵育 2 小时。
接下来，用碘化丙啶对打印的细胞以及通过标准细胞培养接种的细胞进行染色，并在倒置显微镜下观察以进行比较。最终，荧光显微镜用于评估相关时间点的细胞活力、密度和形态。与针式打印等现有方法相比，这种技术的主要优点是打印头在表面形成密封，允许在浸没在细胞培养基中时打印细胞。
虽然细胞的浸没式打印可用于筛选新的候选药物的安全性和有效性，但通常浸没式打印也可用于其他应用。例如，我们可以针对组织切片分析新的候选药物，或者我们可以将其用作器官系统的模型。例如，肝脏丰盛模型。
通常，刚接触这种方法的人会很挣扎，因为在打印机灌注和细胞打印过程中，空气无法进入管路或会导致细胞死亡。首先，在 37 摄氏度的摇动水浴中解冻 NIH 3 T 3 细胞 2 到 3 分钟。将细胞重悬于 5 mL 完全培养基中，并以 1500 Gs 离心 3 分钟。
去除细胞上清液，而不干扰细胞沉淀。然后将细胞重新悬浮在 5 mL 培养基中，并将 10 μL 细胞悬液转移到 0.5 mL 微量离心管中。接下来，向细胞悬液中加入 10 微升 triam 蓝，并用移液管的尖端搅拌，将 10 微升染色细胞移入血细胞仪室中。
在以 10 倍放大倍数计数细胞之前，对 9 个大方块中 4 个的活细胞进行计数，这些活细胞类似于小白球。仅计数 trippen 蓝染色剂中未呈现深蓝色的活细胞。计算每个大方块的平均细胞数，得到原始细胞悬液中的细胞数乘以每毫升 10， 000 个细胞。
然后以每毫升 100， 000 个细胞的密度接种细胞，每个 T 25 培养瓶中总共接种 5 毫升。在开始实验之前，将细胞培养至 70% 至 80% 的 co 流畅度。要准备打印表面，请使用记号笔在组织培养处理的聚苯乙烯 12 的底部标记打印头大小的矩形。
孔板将 50 微升胎牛血清移液到矩形区域，并将其涂抹在整个区域。使用吸头将孔板放在无菌生物安全罩中过夜，让血清斑点完全干燥。要开始浸没式打印，请用蒸馏水冲洗打印头。
然后用蒸馏水填充 60 毫米的培养皿，并使用气动泵以每分钟 150 微升的速度将打印头对接到通过每条生产线的表面流蒸馏水上两分钟。然后丢弃培养皿中的水，并注入清水。接下来，在水中上下移动打印头 3 次。
将打印头中心对接在预先准备好的 12 孔板中的血清包被点上。然后使用 Prewarm 灌注打印头。每通道 300 μL 的完全培养基。
如果执行多次打印，请在两次打印之间除了用水冲洗外，还要添加漂白剂冲洗。继续以每毫升 50， 000 个细胞的浓度和每分钟 60 微升的速度将悬浮细胞打印到表面上。每通道 100 微升。
细胞打印后，将打印头左侧对接在表面和歧管上，放入细胞培养箱中。设置为 5% 二氧化碳和 37 摄氏度，持续 2 小时。孵育 2 小时后，取下打印头并将盖子放在培养皿上。
取出打印头的时间被视为零小时时间点。为了进行比较，还进行了标准细胞培养。将 1 毫升预热培养基添加到其中一个点样的血清 12 孔板中，然后取 1 毫升剩余的细胞悬液并将其移液到 12 孔板的单个孔中。
这将在培养皿中产生包含 50， 000 个细胞的培养物。将细胞培养板置于 37 摄氏度的培养箱中 2 小时。孵育 2 小时后，开始计时以确保打印样品和接种样品之间的一致性。
这被视为零小时时间点。0、2、24 和 48 小时后，通过用碘化丙啶染色，从两种方法中的每一种方法制备细胞进行成像，碘化丙啶仅掺入死细胞的细胞核中。首先，用 1 毫升含钙和镁的磷酸盐膨化盐水轻轻冲洗细胞 3 次，以去除任何碎屑。
接下来，向每个培养容器中加入 1 毫升预热培养基，然后加入 1 微升碘化丙啶。储备液 将用碘化丙啶染色的细胞在 37 摄氏度下孵育 10 分钟，然后使用倒置显微镜以 10 倍和 40 倍放大倍率对细胞进行成像。最后，将细胞丢弃在适当的生物危害容器中。
将成纤维细胞系 NIH 3 T 3 细胞打印或接种到浸没表面上。打印和接种后，对细胞进行可视化，以评估相关时间点的密度和形态。图像显示，细胞在每个时间点和每个放大倍数下都具有几乎相同的表型。
根据这些数字，确定有效打印量为最小。使用碘化丙啶染色法评估细胞活力，结果显示每个时间点打印细胞的活力与坐着的细胞没有显著差异。将细胞附着到表面的两种方法之间的主要区别在于细胞的密度。
在静置和打印的细胞中，打印细胞密度在两小时时间点下降了 50% 以上。有必要进一步研究以确定这种下降的原因。然而，与种子相比，总体印刷密度比仍然明显更高。
考虑到细胞以与接种相同的密度打印，但面积更小，流动槽中打印的细胞密度在每个时间点的密度大约是接种细胞的 10 倍。在最后的时间点，细胞处于相同的密度，这可能是由于细胞运动和资源消耗的限制。自开发以来，该技术为药物发现领域的研究人员研究药物毒性和疗效对细胞和癌症辅助、心脏病和其他高需求领域的影响铺平了道路。
通过将浸没式细胞打印与其他技术（如粘附、可编程细胞粘附）结合使用，我们可以将该技术的范围扩展到悬浮细胞，以扩大药物发现和开发筛选。观看此视频后，您应该对如何使用我们的浸没式打印技术打印细胞有了深入的了解。
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概述
这项研究提出了一种新颖的3D微流控打印技术，能够将细胞阵列打印到浸没的表面上。这种方法通过在受控微环境中精确递送细胞，促进了药物筛选和细胞毒性评估。
研究的主要组成部分
科学领域
- 微流控
- 细胞生物学
- 药物筛选
背景
- 3D打印技术在生物应用中不断进步。
- 浸没打印允许更好的细胞活力和功能。
- 传统方法可能无法提供相同水平的细胞放置控制。
- 这种技术可以增强对药物对细胞影响的评估。
研究目的
- 开发一种将成纤维细胞打印到血清涂层表面的方法。
- 比较打印细胞与标准培养方法的活力和形态。
- 利用荧光显微镜对细胞特征进行详细分析。
使用的方法
- 血清在组织培养表面的预先吸附。
- 用于细胞打印的连续流微点打印机。
- 在37摄氏度下孵育打印的细胞。
- 用碘化丙啶染色以便在倒置显微镜下观察。
主要结果
- 成功将成纤维细胞打印到浸没的表面。
- 比较打印细胞和标准培养细胞的活力和形态。
- 荧光显微镜揭示了关于细胞密度和健康状况的重要见解。
- 该技术相对于传统的针式打印方法具有优势。
结论
- 3D微流控打印方法有效用于创建细胞阵列。
- 这种方法可以改进药物筛选过程。
- 进一步的研究可能扩展到各种生物学领域的应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Submerged microfluidic cell printing enables physiologically relevant cell phenotype maintenance and precise spatial organization for drug screening applications. This technology addresses key limitations of conventional printing methods by allowing automated, multiplexed deposition of cells onto submerged surfaces without disturbing material properties. The approach supports predictive cytotoxicity and efficacy assessment across therapeutic areas including oncology, metabolic disease, and immunology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through controlled cell array patterning on submerged surfaces.
- Operational Value: Supports biological de-risking by maintaining native cell phenotypes during printing and culture.
- Predictive Value: Facilitates functional target validation by preserving cell morphology and viability comparable to standard culture.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream drug screening workflows with consistent cell density and distribution.
- Operational Value: Delivers assay standardization and reproducibility through sealed microfluidic printing that prevents air entrapment and cell death.
- Scalability Value: Enables multiplexed array production for high-throughput compound evaluation in cancer, diabetes, inflammation, and cardiovascular disease models.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Provides disease-relevant systems for monitoring cellular responses to drug candidates without surface disturbance artifacts.
- Continuity Value: Bridges discovery and preclinical validation by maintaining cell functionality from printing through 48-hour assessment periods.
- Risk Mitigation: Supports mechanism-based de-risking by allowing direct comparison of printed versus seeded cell responses to compounds.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling precise cell deposition for assay development, supporting lead identification through quantitative viability and morphology assessment, and informing preclinical decisions via density-based phenotypic analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via controlled cell array formation that clarifies spatial organization effects on drug response.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible submerged printing that ensures consistent cell-sealing interactions critical for compound screening.
- Analytics: Enables quantitative comparison of cell viability, density, and morphology via propidium iodide staining and fluorescence microscopy readouts.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by maintaining cell phenotypes over 48 hours, supporting risk-adjusted advancement decisions.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform technology adaptable to multiple cell types and therapeutic areas beyond fibroblast models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through preservation of physiologically relevant cell states post-printing.
- Operational Value: Standardization and scalability via automated microfluidic sealing that eliminates variability from manual printing techniques.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions through reliable cytotoxicity assessment that reduces late-stage biological risk in drug development.
- Portfolio Impact: Risk-based prioritization enabled by quantitative density and viability metrics that inform resource allocation across projects.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic system operation and sterile cell handling techniques.
- Dependent on pneumatic pump infrastructure and biocompatible printhead materials for consistent sealing.
- Necessitates cross-team standardization of serum pre-adsorption protocols and incubation conditions for reproducibility.
- Involves adaptation considerations when extending to suspension cells or tissue slice models as noted in source material.
- Practical limitation: Air entrapment during priming or printing can cause cell death, requiring meticulous fluid handling.
