Name: 生物医学微流体折射率匹配器件的研制 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-10T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: 学习使用MY133-V2000和PDMS制作微流体器件的方法，通过丙烯酸夹具增强密封性，消除显微镜成像中的折射率失配伪影。该技术适用于生物医学显微分析和定量相位成像研究。

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本工作由犹他大学研究副校长办公室，以及授予亨斯迈癌症研究所和亨斯迈癌症研究所CRR项目的P30 CA042014基金共同资助。

1. 聚二甲基硅氧烷负模的制备
<ol>
	<li>聚二甲基硅氧烷的制备
	<ol>
		<li>称取18 g PDMS硅弹性体和1.8 g固化剂。将固化剂倒入装有弹性体的称量舟中。</li>
		<li>剧烈混合弹性体与固化剂1分钟，然后将混合物放入真空腔中脱气30分钟。</li>
		<li>从真空环境中取出PDMS，用曲奇模具（半径 = 3.8 cm）将15 g PDMS倒在负模上，以防止PDMS从边缘溢出，并将剩余的PDMS混合物盖好保存。</li>
		<li>将含有PDMS的模具放入真空腔中处理10分钟。</li>
		<li>将含有PDMS的模具从真空腔中取出，置于预热至150 °C的加热板上加热60分钟以完成固化，并用铝箔覆盖。</li>
		<li>将剩余的PDMS倒在倒置的玻璃培养皿（直径10 cm）上，使用另一个曲奇模具作为模具，制备一块PDMS垫。将此培养皿放入真空腔中，直至PDMS负模完全固化。</li>
		<li>将带有PDMS的培养皿从真空环境中转移至预热的加热板上，在150 °C下加热60分钟以完成固化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>聚二甲基硅氧烷的等离子体表面处理
	<ol>
		<li>将锋利的剃须刀片插入PDMS与曲奇模具下方，小心地将PDMS从负模上剥离。</li>
		<li>使用锋利的 hobby 刀从较大的PDMS片上切下负模部分；切割时应保留足够的边缘区域，以便在上方粘接另一块PDMS，且不遮挡负模结构。</li>
		<li>将锋利的剃须刀片插入带有负模的已固化PDMS下方，小心地将其从培养皿上剥离。</li>
		<li>使用 hobby 刀从PDMS垫上切下一小块与负模尺寸相同的PDMS；然后，在这块新的PDMS上切出一个矩形开口，确保其尺寸足够大，能够在放置于负模上方时完全包围微通道区域。</li>
		<li>将两块PDMS（负模和带开口的矩形片）放置在平坦的基底上（如玻璃、石英、聚苯乙烯或其他材料制成的载玻片），并将其放入射频（RF）等离子清洗机中。关闭舱门，并通过真空泵抽气密封腔室。使用数字真空压力控制器向腔室内注入空气，直至压力达到400 mTorr。 
		注意：若用于等离子清洗的基底此前未在等离子清洗机中使用过，应在处理负模前单独将其放入清洗机中处理60秒，以防止丙烯酸基底层粘附于基底表面。</li>
		<li>将RF功率调至高挡，观察窗中应出现粉红色的空气等离子体。对两块PDMS进行30秒的等离子处理后，关闭RF电源。缓慢让空气重新进入腔室，以避免湍流扰动腔内物品。</li>
		<li>从等离子清洗机中取出PDMS并放置于实验台面上。然后，小心地将PDMS矩形片翻转并覆盖在负模上，用镊子轻轻按压使其贴合。静置10分钟，使两块PDMS充分粘合。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>聚二甲基硅氧烷负模的氟硅烷表面处理
	<ol>
		<li>使用滴管将2滴三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷（PFOTS）加入一个小的称量舟中，并将其放入玻璃真空腔室。</li>
		<li>将PDMS翻转并放置在一片铝箔上（使微通道负模面朝上），然后放入玻璃真空腔室中。持续抽真空处理24小时。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. MY133 微通道的制备
<ol>
	<li>形成 MY133-V2000 微通道结构
	<ol>
		<li>用 400 µL 的 MY133-V2000 填充 PDMS 负模。 
		注意：负模必须略微过量填充。</li>
		<li>将装有 MY133-V2000 的 PDMS 负模放入真空室中 2 小时，以去除所有气泡。</li>
		<li>将 MY133-V2000 从真空环境中取出，并缓慢将载玻片压在略微过量填充的负模顶部，以形成平整的 MY133-V2000 表面，并防止氧气抑制聚合反应。 
		注意：PDMS 在通道表面会部分抑制聚合反应，从而在后续步骤中实现键合。与石英相比，载玻片的紫外透过率略低（约 35%），有助于防止固化后的装置发生黄变。</li>
		<li>将 MY133-V2000 放入 400 W 的紫外烘箱中，将紫外辐射强度设置为最大值的 50%，照射 300 秒&#160;以固化 MY133-V2000 微通道。 
		注意：用于固化装置的峰值波长约为 375 nm，带宽约为 25 nm。固化微通道所用的能量约为 4,500 mJ/cm2，略高于制造商推荐的最小固化能量的两倍。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>构建丙烯酸支架
	<ol>
		<li>使用矢量绘图软件绘制丙烯酸基底层。确保基底层为一个厚度 1.5 mm、长 75 mm、宽 25 mm 的矩形，中心有一个尺寸为 25 mm × 11 mm 的矩形。</li>
		<li>使用矢量绘图软件绘制丙烯酸中层。确保中层为一个厚度 1.5 mm、长 75 mm、宽 25 mm 的矩形，中心有一个 5 mm × 5 mm 的正方形，以及两个直径均为 3 mm 的圆形，两圆之间相距 15 mm。</li>
		<li>使用矢量绘图软件绘制丙烯酸顶层。确保顶层为一个厚度 3 mm、长 30 mm、宽 25 mm 的矩形，中心有一个 5 mm × 5 mm 的正方形，以及两个直径均为 3 mm 的圆形，两圆之间相距 15 mm。</li>
		<li>使用激光切割机切割矢量绘图软件中设计的装置结构。建议使用 100% 功率和 30% 速度的参数设置。运行程序两次，以确保丙烯酸被完全切割。</li>
		<li>使用 M5 规格、螺距 0.80 mm 的丝锥对丙烯酸顶层的孔进行攻丝。</li>
		<li>用丙酮擦拭丙烯酸部件，以去除任何残留的标记或烧灼痕迹。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将 MY133-V2000 键合至丙烯酸支架中
	<ol>
		<li>使用氰基丙烯酸酯快干胶等粘合剂将丙烯酸基底层粘附到玻璃基底上。在丙烯酸边缘放置两小滴胶水，然后使用一次性工具将胶水均匀涂抹。将玻璃基底放置在丙烯酸上，并利用玻璃自身的重量压紧，使胶水干燥。</li>
		<li>使用正向置换移液器在暴露的玻璃表面涂覆 100 µL PDMS；然后将基底层放入真空旋涂仪中，设置转速为 1,500 rpm，持续 2 分钟，使玻璃表面均匀形成一层约 10 µm 厚的 PDMS 薄膜。</li>
		<li>从旋涂仪中取出基底层，并小心使用丙酮和纸巾擦去附着在丙烯酸上的多余 PDMS。注意不要扰动未固化的 PDMS。</li>
		<li>将带有 PDMS 的基底层放入 65 °C 烤箱中烘烤 2 小时，以固化 PDMS。</li>
		<li>将 1 mL PDMS 滴加到载玻片上，再用另一张载玻片将其均匀铺展，直至 PDMS 从边缘轻微溢出。在 150 °C 的加热板上固化 10 分钟。</li>
		<li>将固化的 PDMS 切割成与 MY133-V2000 装置相同尺寸的矩形，然后使用丙烯酸中层作为模具，在 PDMS 上冲出储液池孔，并切割出一个方形观察窗，制成 PDMS 密封垫片。</li>
		<li>将 MY133-V2000 通道面朝上放置在与步骤 1.2.5 中用于等离子处理 PDMS 相同或类似的平坦基底上。将含有固化 PDMS 基底的丙烯酸基底层与 MY133-V2000 通道一同放入 O2 等离子清洗机中。设置真空压力为 200 mTorr，射频（RF）功率调至高，对通道和玻璃基底进行 30 秒的表面处理。</li>
		<li>立即使用镊子将 MY133-V2000 通道面朝下放置在基底层丙烯酸的矩形切口中，使 MY133-V2000 与 PDMS 接触。</li>
		<li>将 PDMS 密封垫片放置在 MY133-V2000 装置上方，使垫片上的孔与装置中的储液池对齐。</li>
		<li>将未完成的装置放置在实验台面上方的抬高平台上，为装置组装提供夹紧表面。</li>
		<li>使用注射器抽取 3 mL 丙烯酸胶水。在基底层上方涂抹适量丙烯酸胶水，形成一层薄而均匀的涂层。尽量使涂层均匀，并防止材料渗入通道内部。</li>
		<li>将丙烯酸中层放置在基底层上方，确保孔与 MY133-V2000 通道的储液池对齐。</li>
		<li>使用 3 个小型夹具将基底层和中层尽可能紧密地夹紧 2 分钟，使丙烯酸&#160;胶水硬化，从而将丙烯酸部件键合在一起。确保在此过程中储液池未被堵塞，以防止空气被困在 MY133-V2000 装置下方。</li>
		<li>松开装置上的压力，并在中层上预计与丙烯酸顶层接触的位置涂抹丙烯酸胶水。</li>
		<li>将丙烯酸顶层放置在中层上，确保孔与储液池对齐，并在实验台上静置 2 分钟，使丙烯酸胶水干燥。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. MY133-V2000 设备的测试与使用
<ol>
	<li>泄漏测试
	<ol>
		<li>通过向其中一个储液孔中加入 10 µL 食用染料或去离子水，测试 MY133-V2000 装置的粘附性和液体流动情况。</li>
		<li>将一根外径为 1/8 英寸的管子插入储液孔，并将另一端连接至真空捕集装置。开启真空泵，使染料或水通过通道，以确认装置制作成功。</li>
		<li>在显微镜下检查，确认通道或储液孔无泄漏后，向储液孔中加入乙醇，并在室温下静置 10 分钟。随后利用真空泵将乙醇抽过通道，以清除其中的染料或水。</li>
		<li>用乙醇喷洒通道，将其放入无菌聚苯乙烯培养皿中，用封口膜严密包裹，并在无菌环境中保存，直至使用。
		 
		注意：此时必须以无菌操作方式处理该装置，以防污染。使用前应先用乙醇对容器外部进行消毒，并将其移入生物安全柜后再打开容器。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在 MY133-V2000 装置中接种 MCF7 细胞
	<ol>
		<li>在含有完全培养基的 10 cm 培养皿中培养 MCF7 细胞，培养基成分为添加了 10% 胎牛血清、青霉素-链霉素、谷氨酰胺和非必需氨基酸的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），并在细胞培养箱中维持 37 °C、含 5% CO2 和 20% O2 的湿润环境。在将细胞接种至微通道前，使其生长至约 80% 汇合度。</li>
		<li>首先，用 70% 乙醇喷洒含有微通道的聚苯乙烯培养皿，然后将其移入生物安全柜，在打开保护通道免受实验室环境影响的封口膜前进行操作。</li>
		<li>将人血浆来源的纤连蛋白用杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）稀释至 10 µg/mL，通过向通道内注入 20 µL 该溶液，并在 20 °C 下孵育 45 分钟，使其固定于微通道表面。</li>
		<li>向通道中注入 20 µL 细胞培养基以洗去纤连蛋白溶液，并在 20 °C 下孵育 10 分钟。</li>
		<li>用 10 mL DPBS 洗涤细胞，加入 1 mL 1x 胰蛋白酶进行消化，在 37 °C 下孵育 7 分钟，随后加入 9 mL 完全培养基中和胰蛋白酶活性。</li>
		<li>向通道中注入 20 µL 细胞悬液，并在 37 °C 下孵育 45 至 120 分钟，使细胞在成像前充分贴附于基底。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

MY133-V2000 可作为传统软光刻 fabrication 材料（如 PDMS）的替代材料。先前的研究表明，具有高折射率的材料（如 PDMS）由于 fabrication 材料与通道内水溶液之间的折射率不匹配，会在通道壁附近引入显著的成像伪影13。MY133-V2000 能够使微流控器件的折射率与生物医学应用中常用的水溶液相匹配。这在将微流控技术与先进显微镜技术结合时减少了成像伪影，相较于传统微流控 fabrication 材料具有明显优势。该系统实现的微流控通道内伪影减少，使得荧光和定量相位显微镜（图3）信号能够被更精确地量化，即使在靠近微通道结构的区域也能实现13。
作为一种含氟聚合物，MY133-V2000 通常在微通道结构与其他材料之间表现出较低的粘附性，这与传统制造材料相比构成了主要限制。为克服这一挑战，需同时采用化学表面处理（O2等离子体）以及通过将装置和PDMS垫圈夹在基底与一块丙烯酸树...

微流控技术的发展催生了多种新型生物医学技术，这些技术利用了微观尺度流动所特有的物理特性1,2。其中包括基于微流控平台的诊断技术，可用于定量检测具有临床意义的生物标志物，如细胞刚度3、表面标志物4和生长特性5。通过操控单个细胞，微流控装置还可用于测量生物标志物的异质性，例如作为恶性肿瘤的指示指标6。将微流控应用与显微镜技术相结合，进一步提升了这些平台的实用性，使其能够同时测量多种生物标志物7。
QPM 是一种显微技术，通过测量光穿过透明样品并与其中物质相互作用时产生的相位变化，来获取样品信息。利用折射率与生物量密度之间的已知关系，可通过 QPM 测量结果计算单个细胞的质量。8,9先前的研究表明，定量相位显微镜（QPM）能够测量细胞生长等具有临床意义的参数10,11 以及细胞力学特性 通过 无序强度12当与微流控技术结合时，定量相位显微镜有望在高度可控的环境中测量细胞行为 体外将定量相位显微成像与微流控技术结合面临的主要挑战之一是，用于构建微流控通道的大多数聚合物具有较高的折射率 通过 软光刻13.
微流控技术与各种显微镜技术结合面临的一个重要挑战是，器件材料的折射率与水的折射率之间存在不匹配14,15。解决这一问题的方法之一是使用低折射率聚合物，例如 CYTOP16 或 MY133-V200013。后者是一种含氟的紫外光（UV）可固化丙烯酸酯聚合物，其折射率与水相近（n = 1.33），且与软光刻技术兼容，因而能够无缝整合到许多成熟的微流控器件制备流程中。这使得 MY133-V2000 不仅适用于微流控器件的制造，还可方便地与定量相位显微（QPM）及其他显微技术联用，实现对细胞在群体水平和单细胞水平上的行为进行测量。由于光通过水与 MY133 界面时几乎不产生相位偏移，MY133-V2000 能有效消除因相位解包裹所导致的伪影。
尽管消除了折射率不匹配的问题，但由氟化聚合物（如 MY133-V2000）制备的器件仍面临一个主要挑战，即其对玻璃或 PDMS 等其他材料的粘附性较低。本研究展示了采用软光刻技术制备 MY133-V2000 微流控器件的方法。通过使用 O2 等离子体处理微通道和 PDMS 基底的表面，并结合自行设计的丙烯酸固定装置，可确保器件牢固粘附于基底上，形成密封的通道。该器件适用于细胞培养和定量相位显微（QPM）技术，可用于测量通道内细胞的质量，在活细胞生长监测和细胞内生物量转运研究方面具有重要意义，这些应用在临床诊断医学和药物发现中具有重要价值。

<table><tbody><tr><td>MY133-V2000</td><td>MY Polymers</td><td>MY133-V2000</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Premium 显微镜载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-4</td><td></td></tr><tr><td>.118&quot;(3.0mm) x 12&quot; x 12&quot; 丙烯酸板</td><td>United States Plastic Corp</td><td>44290</td><td></td></tr><tr><td>.060&quot;(1.5mm) x 12&quot; x 12&quot; 丙烯酸板</td><td>United States Plastic Corp</td><td>44200</td><td></td></tr><tr><td>SCIGRIP 3 快速固化丙烯酸胶</td><td>United States Plastic Corp</td><td>45735</td><td></td></tr><tr><td>标准铝箔（0.6 mm 厚）</td><td>VWR</td><td>89107-726</td><td></td></tr><tr><td>Kim Wipes 擦拭纸</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>Insta-Cure+ 超强胶水</td><td>Bob Smith Industries</td><td>BSI-109</td><td></td></tr><tr><td>1/8&quot; PVC 管</td><td>McMaster Carr</td><td>5231K55</td><td></td></tr><tr><td>McCormick 食用色素</td><td>Target</td><td>13353207</td><td></td></tr><tr><td>X-Acto #1 精密刀</td><td>X-Acto</td><td>X3201</td><td></td></tr><tr><td>X-Acto #18 重型木凿刀片</td><td>X-Acto</td><td>X218</td><td></td></tr><tr><td>VWR 剃刀刀片</td><td>VWR</td><td>55411-055</td><td></td></tr><tr><td>表面处理细胞培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>FBO12922</td><td></td></tr><tr><td>人血浆纤连蛋白</td><td>Sigma-Aldritch</td><td>F0895-1MG</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA 10x</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-400-054</td><td></td></tr><tr><td>Corning 磷酸盐缓冲液（Dulbecco's PBS）</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT21030CM</td><td></td></tr><tr><td>Gibco 青霉素-链霉素</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-140-148</td><td></td></tr><tr><td>HyClone 非必需氨基酸 100x</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3023801</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-12</td><td></td></tr><tr><td>Corning 含 L-谷氨酰胺和葡萄糖的 DMEM 培养基</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT10013CV</td><td></td></tr><tr><td>三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷</td><td>Sigma-Aldritch</td><td>448931</td><td>与水剧烈反应</td></tr><tr><td>乙醇，200 证明，Decon Labs</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-223</td><td></td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Fisher Scientific</td><td>A18P-4</td><td></td></tr><tr><td>Bel-Art 42025 塑料干燥器</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-06514-30</td><td></td></tr><tr><td>Epilog Fusion 激光切割机，120 W</td><td>Epilog Laser</td><td>Epilog Fusion M2 32 Laser</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp 搅拌加热板</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP88850200</td><td></td></tr><tr><td>Ateco 14111 1.5 英寸不锈钢切割器</td><td>Ateco</td><td>14111</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex 玻璃细胞培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-747B</td><td></td></tr><tr><td>射频等离子清洗机</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-32G</td><td>使用氧气气体</td></tr><tr><td>Black Hole Laboratories Digivac</td><td>Black Hole Laboratories</td><td>Model 215</td><td></td></tr><tr><td>Intelli-Ray 紫外线烘箱</td><td>Uvitron</td><td>UVO338</td><td></td></tr><tr><td>紧凑型旋涂仪</td><td>MTI Corporation</td><td>VTC-100A</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Brand Isotemp 烘箱</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-103-0510</td><td>强制空气对流</td></tr><tr><td>Gilson 正向置换移液器 P1000</td><td>Fisher Scientific</td><td>FD10006G</td><td></td></tr><tr><td>HeraCell VIOS 160i</td><td>Fisher Scientific</td><td>13 998 212PM</td><td></td></tr></tbody></table>

用于生物医学微流控的折射率匹配器件的制备

Fabrication of Refractive-index-matched Devices for Biomedical Microfluidics

微流控装置的使用已成为生物医学应用中的一项关键工具。当与现代显微技术相结合时，这些装置可作为多功能平台的一部分，实现同步互补测量。将这两种技术结合所面临的主要挑战在于，传统上用于制造微流控装置的材料与生物医学中常用的水溶液之间存在折射率不匹配的问题。这种不匹配会在通道或装置边缘附近产生光学伪影。一种解决方案是采用折射率接近水（n = 1.33）的氟化聚合物（如 MY133-V2000）来降低装置制造材料的折射率。本文展示了利用软光刻技术制备 MY133-V2000 微流控装置的方法，并结合使用 O2 等离子体处理和丙烯酸固定夹具，以增强 MY133-V2000 制成的装置与聚二甲基硅氧烷（PDMS）基底之间的粘附性。随后，通过将装置充满细胞培养基并在其中孵育 24 小时，验证该装置在典型成像实验过程中维持细胞培养条件的能力。最后，采用定量相位显微镜（QPM）测量微通道中活贴壁细胞内的质量分布。由此证明，相较于传统的软光刻材料（如 PDMS），使用 MY133-V2000 等低折射率聚合物制造装置可显著提高测量精度。总体而言，该微流控装置制备方法可轻松整合到现有的软光刻工作流程中，以减少光学伪影并提升测量精确度。

本方案描述了MY133-V2000的制备方法，这是一种折射率与水相近的氟化聚合物。该方案的一个关键特征是通过氧等离子体处理以及在丙烯酸材料制成的支架内构建器件，从而克服氟化聚合物通常缺乏粘附性的问题，以提供将通道密封至PDMS基底所需的额外机械力（图1）。最终器件的低折射率可在宏观尺度上清晰观察到（图2）。由该材料制成的通道边缘在空气中可清晰辨识（图2A），但由于其折射率与水极为接近，浸入水中后则难以分辨（图2B）。这为器件制备完成后快速检验材料的光学特性提供了依据。一个成功制备的器件如图2C所示，其中可见MY133-V2000微通道被丙烯酸材料封装，从而提供密封微通道所需的额...

本方案描述了使用MY133-V2000制备微流控装置的方法，以消除由于微通道结构与水溶液之间折射率不匹配而常在微通道中产生的伪影。本方案采用丙烯酸支架压缩封装后的装置，从而在化学和机械层面增强粘附性。

微流控装置的使用已成为生物医学应用中的一项关键工具。当与现代显微镜技术相结合时，这些装置……

该方法可通过实现微通道结构与通道内水相介质之间的折射率匹配，有助于解决显微成像与微流控技术结合中的一个重要挑战。该技术的主要优势在于其与常用于制造微流控器件的加工方法相兼容。本方法的另一个关键优势在于实现了由低粘附性材料制成的微通道的封合，而低粘附性是折射率匹配性能优良的聚合物材料中普遍存在的问题。该方法的可视化演示至关重要，因为密封通道的步骤可能难以准确掌握。例如，在夹紧过程中必须确保储液池无任何阻塞。请按照文本方案中的描述，首先开始制备聚二甲基硅氧烷（PDMS）负模。然后，向PDMS阴模中注入400微升MY-133-V-2000，注入量应略多于阴模容量。将装有MY-133-V-2000的PDMS阴模放入真空室中抽真空两小时，以去除所有气泡。从真空室中取出 MY-133-V-2000 后，将一块载玻片压在略微过量填充的负模顶部，以形成平整的 MY-133-V-2000 表面，并防止氧气抑制聚合反应。接着，将 MY-133-V-2000 放入 400 瓦的紫外光烘箱中。将紫外光强度设置为最大强度的 50%，照射 300 秒，以固化微通道。此功率约为每平方厘米4.5焦耳，大约是制造商推荐的最低固化功率的两倍。按照文本方案中所述切割亚克力材料后，在亚克力边缘滴加两小滴胶水，然后使用一次性工具将胶水均匀涂布。将玻璃基板放置在亚克力上，利用玻璃自身的重量将其固定，并让胶水自然干燥。使用正向置换移液器将100微升PDMS涂覆在暴露的玻璃表面。然后，将基底层放入真空旋涂仪中，以1500 RPM的转速旋转两分钟，使玻璃表面均匀形成一层约10微米厚的PDMS薄膜。从旋涂仪中取出基底层，并用丙酮和纸巾小心擦去涂覆在亚克力材料上的多余PDMS。注意不要扰动未固化的PDMS。现在，将带有PDMS的基底层放入65摄氏度的烘箱中烘烤两小时，以固化PDMS。用移液器吸取1毫升PDMS滴加到载玻片上，然后用另一张载玻片将PDMS均匀铺展，直至其从边缘开始渗出。在热板上于150摄氏度条件下固化10分钟。将固化的PDMS切割成与MY-133-V-2000装置相同尺寸的矩形。然后，以亚克力中间层作为模具，在PDMS上打孔以形成储液池，并切割出一个方形观察窗，制备PDMS垫圈。现在，将固化后的 MY-133-V-2000 从紫外烘箱中取出，将通道从负模上剥离，并将其放置在平坦的基底上，通道面朝上。将含有固化 PDMS 的底层从 65 摄氏度的烘箱中取出，并放置在基底上。然后，将带有 MY-133-V-2000 通道和底层的基底放入氧气等离子体清洗仪中。 将真空压力设为200毫托，射频功率调至高。对微通道和玻璃基底进行30秒的表面处理。开启等离子清洗机后，氧气等离子体应呈现蓝色辉光。30 秒后，将微通道和基底层从等离子清洗机中取出。使用镊子立即将 MY-133-V-2000 的通道面朝下放入基底层亚克力板的矩形切口内，使其与 PDMS 接触。随后，将 PDMS 密封垫放置在 MY-133-V-2000 装置的上方，使密封垫上的孔与装置中的储液孔对齐。使用这种PDMS垫圈至关重要，因为PDMS比MY-133-V-2000更具弹性，因此可实现更大的压缩量。这使得作用力能够从丙烯酸材料传递至微通道，而不会损坏玻璃。此时，应将未完成的器件放置在工作台上方的抬高平台上，以为器件组装提供一个夹紧表面。然后，使用注射器抽取三毫升丙烯酸水泥。将足量的丙烯酸水泥分布在基底层上方，形成一层薄薄的涂层。尽量使涂层均匀，并防止材料渗入通道中。现在，将中间层的亚克力部件放置在底层亚克力部件之上。确保孔位与 MY-133-V-2000 通道的储液区对齐。将中间层尽可能紧密地夹紧到底层上，并保持两分钟，使胶水固化，从而将两块亚克力粘合在一起。在此步骤中，确保储液池未被堵塞，以防止空气被困在 MY-133-V-2000 装置下方。若储液池被堵塞，MY-133-V-2000 与基底之间的空气将无法排出而持续滞留，这会导致最终装置出现泄漏。因此，此步骤中必须确保孔洞不被堵塞。待水泥凝固后，撤去装置上的压力。将丙烯酸水泥置于中间层上，位置对应于丙烯酸顶层预期接触的区域。现在，将亚克力材料的顶层放置在亚克力中层上，确保孔与储液孔对齐。静置于实验台两分钟，使亚克力胶水干燥。通过向其中一个储液孔中加入10 µL食用染料或去离子水，测试MY-133-V-2000装置的粘合性和液体流动情况。将一根管子插入相对的储液池中，并将另一端连接至真空捕集装置。打开真空泵，使染料或水溶液流经通道，以确认成功制备了装置。在显微镜下检查，确保通道或储液池无泄漏。使用真空装置将两个储液槽中的染料移除。然后用乙醇冲洗储液槽，并将乙醇放入其中一个储液槽中。使用真空将乙醇抽滤。让乙醇在室温下静置10分钟。用乙醇彻底喷洒通道，并将其放入无菌的聚苯乙烯培养皿中。用封口膜紧密包裹，并存放至需要时使用。此处显示的热图代表微通道中附着的FOD标记MCF-7细胞的质量。在微通道壁附近可见少量伪影。在此测量图像中，可见单个贴壁的MCF-7细胞位于微通道边缘靠近壁面处。壁面附近无伪影干扰，使得即使细胞紧邻通道壁时，仍可获得精确的定量测量结果。最后一幅图显示了一对靠近微通道壁的MCF-7细胞。利用定量相位显微镜，可以精确测量每个像素处这些细胞的质量。在执行本方案时，需注意在丙烯酸树脂固化过程中夹紧装置时不要堵塞储液池。若堵塞孔洞，会导致空气滞留在 MY-133-V-2000 与基底之间。这将导致流动过程中通道发生泄漏。使用 MY-133-V-2000 作为微流控器件的制备材料，相较于传统材料具有显著优势，可大幅减少微通道壁附近的伪影。这使得能够在微通道结构附近进行定量测量。采用本方案制备的装置适用于任何常用的显微镜技术。本方案基于细胞病理学，因此可与其他先进的微流控技术兼容，例如用于研究细胞行为的细胞分选器或浓度梯度发生器。总体而言，该技术为研究人员提供了一种基于显微镜的生物医学微流控检测新工具。它在微通道中对定量测量提供的额外精度，在药物发现和单细胞分析等多个领域具有重要应用。

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生物医学微流体折射率匹配器件的研制

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