三维球体制作一个高效，灵活细胞聚集方法
March 27th, 2017
在这里，我们描述了一种通过细胞聚集形成 3D 细胞球体的快速灵活的方案。这很容易适应多种细胞类型，适用于各种应用，包括细胞迁移、侵袭或失巢凋亡检测，以及用于细胞-基质相互作用的成像和定量。
旁白：该方法的总体目标是通过细胞聚集有效地生成大量稳健的细胞球体，用于各种基于细胞的检测。该技术的主要优点是它使用非蛋白水溶性基质进行细胞聚集和球状体形成，从而可以轻松快速地分离球状体。这种方法可以帮助在细胞生物学中获得关于细胞-细胞和细胞/基质相互作用对三维微环境中组织生长影响的新见解。
旁白 在准备骨料之前，将 50 毫升超纯水加热至 80 摄氏度，并加入 10 克甲基纤维素粉。搅拌悬浮液，直到颗粒均匀分散。然后加入冷的超纯水至最终体积为 100 毫升，并将颗粒在 4 摄氏度下储存过夜，直到溶液变得透明并呈稻草色，没有可见的固体。
将溶液通过 0.45 微米过滤器以去除任何未溶解的碎片，并在适当的培养基中稀释每毫升 1：5 毫克的过滤溶液。然后通过 0.22 微米过滤器过滤添加甲基纤维素的培养基。接下来，在生物安全柜中，用 PBS 洗涤 70% 汇合的传代培养物，并在细胞培养箱中用 3 毫升胰蛋白酶-EDTA 缔合缓冲液连接细胞。
几分钟后，在光学显微镜下以 10 倍放大倍率检查细胞。当细胞从板中浮出时，用 7 mL 添加血清的培养基中和反应。将细胞溶液转移到新鲜的 15 ml 试管中，然后通过离心收集释放的细胞。
除了污染颗粒外，球状体形成不成功的最常见原因是使用次优浓度的甲基纤维素或血清来聚集和生长特定细胞系。旁白 - 使用带有过滤吸头的 P1000 微量移液器，用 1 毫升球状体形成培养基研磨托盘 3 到 5 次，将移液器吸头以微小的角度压在试管底部，同时缓慢移液，不要排出整个吸头内容物以使沉淀变薄。计数后，将细胞悬液稀释至每毫升浓度 10 至 4 个细胞的 1 倍，并用过滤的超纯水冲洗无菌多通道移液器储液槽，以去除任何灰尘和纤维。
将细胞分配到储液槽中，并使用过滤吸头将 100 μL 细胞转移到 96 孔 U 形底细胞驱避板的每个孔中，定期混合细胞悬液，以防止细胞沉淀到储液槽底部。当所有细胞都就位后，将板放入组织培养箱中，并每天检查孔中是否有球状体形成。细胞应在 6 小时内沉降到每个孔的底部，通常在 24 至 48 小时内聚集成球状体。
为了确认成功球体的形成，在光学显微镜下使用 P10 吸头轻轻地将培养基移液到球体上。正确形成的球体将从板上松动并滚动，确认其 3-D 结构。要将球体包埋在胶原蛋白中，请使用反向移液将每孔至少 50 微升中和胶原蛋白均匀地涂在八孔组织培养室载玻片的每个孔的底部。
当所有孔都被覆盖后，将腔室载玻片放入装满超纯水的 35 毫米组织培养皿中，放入 10 厘米的组织培养皿中，并将 10 厘米的组织培养皿在 37 摄氏度下孵育约一小时。当胶原蛋白聚合后，使用 P1000 滤嘴小心地将预制的球体转移到 1.5 mL 微量离心管中。胶原蛋白基层必须孵育直到它们完全聚合，以避免在添加球状体或培养基时干扰胶原蛋白。
旁白 将收获的球体收集在台式微量离心机中，并使用 P200 移液器去除上清液，必要时在干净的纸巾上通过试管倒置吸走任何多余的上清液。使用大口径 P200 移液器吸头，立即将球体重新悬浮在 50 微升中和胶原蛋白中，并小心地将球体胶原蛋白混合物转移到 8 孔组织培养室载玻片的每个孔中。将玻片放回培养箱中，直到胶原蛋白聚合。
大约一小时后，向每个孔中缓慢添加至少 100 微升含有适当目标处理的温热培养基，以进行另一次孵育。然后使用荧光显微镜通过侵入的球体获取光学成像切片。使用该方案，可以从各种细胞系中生成球状体。
在适当的甲基纤维素和血清处理条件下，单个细胞在孔中心沉降并粘附在一起，形成球状体，对孔底的粘附最小。一些细胞系能够在不存在甲基纤维素或甲基纤维素浓度低的情况下粘附在细胞排斥板上，从而形成被细胞单层包围的球状体。通常，较高浓度的甲基纤维素会阻止细胞粘附在孔上。
但是过高浓度的甲基纤维素会降低细胞间的粘附，并阻止细胞沉降到孔底，从而导致形成松散的聚集体和许多卫星球体。胶原包埋的球状体可以用化学引诱剂处理，以诱导单个细胞从球状体向外侵入周围的基质。固定的胶原包埋的球体可以通过明场显微镜成像，以量化侵袭细胞的距离和数量，或者通过免疫荧光显微镜来可视化迁移细胞形成的侵袭结构。
重要的是要留出足够的时间让细胞聚集成结构合理的球状体，这些球状体足够坚固，可以作而不会碎裂，并且可以轻松收集用于后续分析。我们的细胞生长方案可以进一步适用于多种细胞生物学分析。例如，将细胞置于补充有高浓度甲基纤维素的培养基中可用于评估细胞抗性。
看完这个视频，你应该对如何通过聚集生成三维细胞球体有了很好的了解，这将是许多细胞生物学应用的宝贵工具。
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概述
本文介绍了一种通过细胞聚集生成3D细胞球体的快速且灵活的协议。该方法适用于各种细胞类型，并可应用于与细胞迁移、侵袭和细胞-基质相互作用相关的检测。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 3D细胞培养
- 细胞聚集技术
背景
- 理解细胞间和细胞/基质相互作用对于组织生长至关重要。
- 3D细胞球体提供了比2D培养更生理相关的模型。
- 使用非蛋白质基质有助于容易形成球体。
- 该方法允许快速分离球体以用于各种检测。
研究目的
- 开发一种高效生成强健细胞球体的协议。
- 研究微环境对细胞行为的影响。
- 增强对组织生长动力学的理解。
使用的方法
- 制备甲基纤维素溶液以用于细胞聚集。
- 加热和搅拌超纯水和甲基纤维素粉末。
- 储存溶液以在使用前达到清澈。
- 在各种基于细胞的检测中应用该方法。
主要结果
- 成功从不同细胞类型中形成3D细胞球体。
- 证明了使用非蛋白质基质容易分离球体。
- 获得了在3D环境中细胞-基质相互作用的见解。
- 在迁移、侵袭和缺陷细胞死亡检测中的潜在应用。
结论
- 该协议为3D细胞培养提供了一种多功能的方法。
- 它可以适应细胞生物学中的各种研究应用。
- 该方法增强了对复杂细胞相互作用的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Robust 3D spheroid models are essential for bridging the gap between traditional 2D cell culture and the complex in vivo tumor microenvironment, enabling more predictive preclinical evaluation. This flexible aggregation protocol supports high-throughput, reproducible generation of spheroids from diverse cell lines, directly impacting early discovery, target validation, and translational research. Its adaptability and scalability position it as a reusable platform for mechanistic de-risking and quantitative phenotypic screening in oncology and tissue biology pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cell-cell and cell-matrix interactions in a physiologically relevant 3D context.
- Supports functional validation of targets by modeling anchorage-independent growth and anoikis resistance.
- Facilitates mechanistic de-risking by recapitulating tumor-like microenvironments.
- Provides a platform for hypothesis-driven studies of invasion and migration pathways.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, size-consistent spheroids suitable for quantitative drug screening assays.
- Improves assay reproducibility and scalability across multiple cell types and conditions.
- Enables preparation of validated 3D systems for downstream imaging and molecular analyses.
- Supports reliable evaluation of compound effects on invasion, migration, and viability endpoints.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro models with disease-relevant 3D biology for translational biomarker studies.
- Facilitates continuity from discovery through preclinical validation by supporting invasion and migration assays in a 3D matrix.
- Enables risk-adjusted advancement decisions by providing predictive data on tumor-like behaviors.
- Supports mechanistic studies of resistance and metastatic potential in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
This aggregation method integrates seamlessly from early discovery through lead identification and preclinical research, supporting both mechanistic and phenotypic workflows.
- Discovery Biology: Provides a platform for hypothesis testing of cell behavior in 3D, clarifying pathway dependencies and biological risk.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for compound evaluation in standardized 3D systems.
- Analytics: Enables measurement of invasion, migration, and viability with imaging and molecular readouts.
- Translational Research: Bridges in vitro and in vivo relevance by modeling tumor microenvironments and resistance mechanisms.
- Enterprise Reuse: Offers a flexible, modifiable protocol adaptable across cell lines and assay formats for portfolio-wide application.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target and pathway studies.
- Operational Value: Standardizes 3D culture workflows, improving reproducibility and scalability for screening and mechanistic assays.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust, disease-relevant data early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of candidates with validated 3D phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in 3D cell culture and handling of methylcellulose-based matrices.
- Needs access to cell-repellent plates, imaging platforms, and standard tissue culture infrastructure.
- Demands cross-team standardization of spheroid size, matrix composition, and assay timing for reproducibility.
- Adaptable to a wide range of tumor and normal cell lines with optimization of serum and methylcellulose concentrations.
- Limitations include cell line-specific aggregation behaviors and the need for careful matrix optimization to avoid loose aggregates or monolayer formation.
