Name: 三维球体制作一个高效，灵活细胞聚集方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: 学习使用甲基纤维素基质快速生成三维细胞球体的方法，适用于多种细胞类型。该技术利用非蛋白质水溶性基质实现细胞聚集，便于球体分离，可用于细胞迁移、侵袭和细胞基质相互作用等研究。

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作者感谢女王大学生物医学影像中心的 M. Gordon 提供的帮助。本研究得到了加拿大癌症研究学会（19439）和加拿大卫生研究院（MOP-142303）（LMM）运营基金、安大略省研究生奖学金以及特里·福克斯癌症研究跨学科培训项目（SMM、EYL）的学生奖学金，以及 Craig Jury 暑期学生奖学金（SMM）的资助。

注意：所有试剂和耗材均列于材料清单中。
1. 通过细胞聚集法生成球状体
<ol>
	<li>甲基纤维素溶液：配制 100 mL 浓度为 100 mg/mL 的甲基纤维素溶液。
	<ol>
		<li>将 50 mL 超纯 H2O 加热至 80 °C，加入 10 g 甲基纤维素粉末，搅拌至颗粒均匀分散。</li>
		<li>用冷的超纯 H2O 定容至最终体积，在 4 °C 下搅拌至溶液澄清、呈淡黄色且无可见固体残留。</li>
		<li>经 0.45 µm 滤膜过滤以去除未溶解的固体。配制好的溶液可分装后于 4 °C 保存，最长可保存 12 个月。 
		注：甲基纤维素是一种无细胞毒性的惰性悬浮剂，可增强细胞间黏附，并抑制贴壁单层细胞的形成。甲基纤维素可溶于水，在类球体形成后可通过洗涤去除。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>类球体形成培养基 
	注：请在使用前立即配制类球体形成培养基，不可储存。
	<ol>
		<li>将甲基纤维素溶液用适当的培养基稀释至 1–5 mg/mL。</li>
		<li>经 0.22 µm 滤膜过滤以灭菌并去除未溶解的固体。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>杜氏磷酸盐缓冲液（PBS）
	<ol>
		<li>稀释至 1x&#160;，使用前经 0.45 µm 滤膜过滤。配制好的溶液可在室温下长期保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞类球体的制备（图 1） 
	注：请提前准备好所有试剂。应避免溶液被灰尘、纤维或其他不溶性颗粒污染，这些污染物会严重影响类球体的形成。培养基及其他溶液应尽可能通过 0.45 µm 滤膜过滤以去除颗粒。在转移溶液时应避免使用带棉塞的移液管，因其可能引入额外纤维。
	<ol>
		<li>在含 10% 血清的适当培养基中培养细胞单层至 70% 汇合度。吸除培养基，并用 1x PBS 洗涤以去除碎片。向 10 cm 细胞培养皿中加入 3 mL 胰蛋白酶-EDTA（0.05% 胰蛋白酶）消化液，在 37 °C、5% CO2 条件下孵育细胞。</li>
		<li>在显微镜下以 10 倍物镜观察细胞，确认其已脱落。加入 7 mL 含血清的培养基以中和消化液。</li>
		<li>将细胞悬液在 500 × g 条件下离心 10 分钟，轻柔地沉淀细胞。</li>
		<li>弃去上清液。使用带滤芯吸头的 P1000 移液器将细胞沉淀重悬于 1 mL 类球体形成培养基中。 
		注：细胞悬液应无团块。
		<ol>
			<li>为充分吹打细胞沉淀，移液时将移液器吸头以轻微倾斜的角度紧贴管底反复吹打，以剪切细胞团块。吹打次数不宜超过 3–5 次，以免损伤细胞。吹打时应缓慢操作，且不要完全排空吸头内容物，以避免产生气泡。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用血细胞计数板计数细胞，并将细胞悬液稀释至 1 × 104 个细胞/mL。 
		注：可通过调整细胞数量优化以生成不同大小的类球体。可使用台盼蓝染色检测重悬细胞的活力。</li>
		<li>将细胞悬液转移至无菌、无尘的多通道移液器储液槽中，使用带滤芯吸头向 96 孔 U 型底防贴壁板的每孔加入 100 µL。
		<ol>
			<li>用经滤膜过滤的超纯 H2O 冲洗储液槽，以去除灰尘和纤维。</li>
			<li>在加样过程中应定期混匀细胞悬液，防止细胞沉降至储液槽底部。为避免产生气泡，混匀和加样时应采用反向移液技术。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将培养板转移至组织培养孵箱（37 °C、5% CO2）中，每日观察类球体形成情况。细胞通常在 6 小时内沉降至各孔底部，并在 24–48 小时内聚集成类球体（图 2）。</li>
		<li>为确认类球体成功形成，可使用 P10 吸头在显微镜下（10 倍物镜）轻柔地在类球体上方吹吸培养基。结构完整的类球体会从孔底松动并滚动，表明其具备三维结构。 
		注：应通过滴定法确定每种细胞系所需的甲基纤维素和血清浓度，以确保每孔形成单一类球体。部分选定细胞系的优化条件见 表 1，所形成的类球体示例见 图 2B。类球体可培养超过上述时间，但随着体积增大，其操作难度会逐渐增加，易发生破碎。若细胞形成单层、卫星状类球体或未能沉降至孔底，则可能需要进一步调整甲基纤维素和血清浓度以优化类球体形成（图 3B）。不得使用含有纤维或灰尘等污染物的类球体（图 3A）。已形成的类球体可用于后续处理，例如加入生长因子、活细胞染料或抑制剂等感兴趣化合物进行分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 球体侵袭实验（图4）
<ol>
	<li>中和胶原蛋白
	<ol>
		<li>操作胶原蛋白时，将所有液体冷却至 4 °C 并置于冰上，以防止发生非预期的聚合。</li>
		<li>在超纯 H2O 中新鲜配制 0.1 M 和 0.01 M 的 NaOH 溶液，以及新鲜的 0.1 M HCl 溶液。所有溶液均需经 0.22 µm 滤器过滤。</li>
		<li>将牛 I 型胶原蛋白（3.1 mg/mL 储备液）、0.01 M NaOH 和 10x PBS 按体积比 8:1:1 混合，并使用冷的 0.1 M NaOH 和 HCl 调节 pH 至 7.4。最终胶原蛋白浓度为 2.5 mg/mL。</li>
		<li>准备足量的中和胶原蛋白，以填充成像容器至 2–3 mm 深度。每个 8 孔组织培养腔室载玻片（见材料清单）的每孔至少需要 100 µL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将类球体包埋于胶原蛋白中（图 4）
	<ol>
		<li>在 8 孔组织培养腔室载玻片的每个孔底部，加入至少 50 µL 中和胶原蛋白进行包被。
		<ol>
			<li>使用反向移液技术以避免在胶原蛋白中产生气泡。用移液枪头将胶原蛋白均匀铺展于孔底表面。 
			注意：此胶原蛋白基底层可使类球体保持悬浮状态，通常厚度为 1–2 mm。基底层有助于减少上层胶原蛋白形成弯月面。若基底层过薄，类球体可能接触腔室载玻片底部并形成单层细胞。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将腔室载玻片和一个盛有超纯 H2O 的 35 mm 组织培养皿一同放入 10 cm 组织培养皿中。于 37 °C 孵育直至胶原蛋白完全聚合，通常需 1 小时。剩余的中和胶原蛋白应保存在冰上。 
		注意：盛水的 35 mm 培养皿可提供湿度，防止干燥。整个实验过程中，腔室载玻片应始终置于该保湿环境中。胶原蛋白基底层也可过夜聚合。较长的孵育时间通常会形成更坚硬的凝胶。</li>
		<li>使用 p1,000 滤芯吸头，从 96 孔 U 形底防粘细胞板中收集预先形成的类球体（步骤 1.4.7），转移至 1.5 mL 扣盖离心管中。移液时动作应缓慢，避免反复或剧烈吹打，以尽量减少对类球体的流体剪切损伤。多个类球体可汇集于同一离心管中，以便转移至 8 孔组织培养腔室载玻片的一个孔内。</li>
		<li>将收集的类球体在台式微量离心机中以 2,000 × g 离心 2–5 秒，随后使用 p200 移液器吸除上清液。避免离心时间过长，否则可能导致类球体破裂或聚集。 
		注意：在吸除大部分上清液后，可将离心管小心倒置在干净的纸巾上，以吸走残留液体。切勿让类球体干燥。</li>
		<li>使用宽孔 p200 吸头，将类球体轻柔地重悬于 50 µL 中和胶原蛋白中。在将任何类球体转移至腔室载玻片前，应对每管收集的类球体分别进行此操作。已重悬于中和胶原蛋白中的类球体应保持在冰上，直至准备转移至腔室载玻片。</li>
		<li>从培养箱中取出腔室载玻片，小心地将类球体-胶原蛋白混合物滴加至胶原蛋白基底层上方。于 37 °C 和 5% CO2 条件下孵育，直至胶原蛋白完全聚合。
		<ol>
			<li>不要将移液枪中全部液体一次性排出，以避免产生气泡。逐滴加入可降低扰动胶原蛋白基底层的风险。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>缓慢向腔室载玻片的每个孔中加入至少 100 µL 预热的含所需趋化因子、抑制剂或其他处理因素的培养基。若液体加入过于剧烈，可能撕裂含类球体的胶原蛋白层。可通过沿孔壁缓慢滴加培养基以避免扰动胶原蛋白层。</li>
		<li>将腔室载玻片置于 37 °C 和 5% CO2 条件下孵育，以允许细胞侵袭。可通过明场或荧光成像观察细胞向周围胶原蛋白中的侵袭情况，并利用落射荧光、共聚焦或光片显微镜等多种方法进行定量分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 侵袭的定量分析：明场显微镜观察
<ol>
	<li>在设定的时间间隔，使用明场显微镜以 10 倍放大倍数对包埋于胶原中的球状体进行成像（步骤 2.2.8）。 
	注意：对于长期活细胞实验，可在成像过程中使用加热显微镜载物台和 CO2 控制培养室，以维持球状体在 37 °C 和 5% CO2 的条件下。</li>
	<li>使用 ImageJ 等软件定量分析侵袭性，测量每个时间点侵入周围胶原的细胞数量及平均侵袭距离。</li>
</ol>
4. 侵袭的定量分析：使用活细胞染料进行荧光显微镜检测
<ol>
	<li>在完成步骤 2.2.8 后，根据制造商说明书，向腔室载玻片中的培养基添加适当的荧光染料，如 DAPI、Calcein AM 或适用于该细胞系的其他细胞示踪化合物。 
	注意：对于侵袭性的定量分析，类球体内部染色的均一性并非必需。若需染料更深地渗透，可能需要更长的孵育时间（&#62;3 小时）。</li>
	<li>去除染料，加入 500 µL 温热的 1× PBS。在 37 °C 孵育 10 分钟以去除多余的染料。至少重复此步骤两次。</li>
	<li>使用荧光显微镜对侵袭性类球体进行光学切片成像。 
	注意：在重复成像过程中，应尽量减少激光照射时间，以降低光毒性和光漂白效应。</li>
	<li>使用 ImageJ 等软件生成 Z 投影图像，可用于定量分析类球体的总面积、侵袭细胞数量以及细胞侵入胶原基质的距离。</li>
	<li>例如，在定量侵袭程度时，可调整图像阈值以排除背景信号，仅突出显示类球体及侵袭细胞，并测量其总面积。通过从该总面积中减去原始类球体的面积，即可量化侵袭性。</li>
</ol>
5. 侵袭的定量分析：免疫荧光
注意：所有溶液和缓冲液在使用前应通过 0.45 µm 滤膜过滤，以去除可能对染色产生不利影响的碎片。
<ol>
	<li>配制 PBS+ 洗涤缓冲液。配制1x PBS并加入CaCl2 和 MgCl2 至终浓度为 0.1 mM。加入 CaCl 后，缓冲液不可进行高压灭菌。2 和 MgCl2 加入后，溶液可经滤膜除菌，并在室温下保存。</li>
	<li>配制中性缓冲福尔马林（NBF）固定液。向0.6 g多聚甲醛中加入5滴1 M NaOH，用PBS定容至20 mL。+ 60 °C孵育至多聚甲醛完全溶解（约1小时）。冷却至室温，用1 M HCl调节pH至7.4。 
	注意：NBF 固定液应在使用前立即配制。</li>
	<li>配制牛血清白蛋白（BSA）封闭缓冲液。将 BSA 溶解于 PBS 中+ 3% w/v。溶液可过滤除菌，4 °C 保存数天，但建议新鲜配制。切勿加热。</li>
	<li>配制通透缓冲液。将Triton X-100用PBS稀释至0.2%（v/v）。+. 
	注意：透化缓冲液应在使用前立即配制。</li>
	<li>可选地，配制MOWIOL封片剂。将2.4 g MOWIOL、6 g甘油和6 mL超纯H2O. 在室温下于旋转仪中混合3小时。加入12 mL 0.2 M Tris-Cl（pH 8.5）。在50 °C下孵育并混匀10分钟。
	<ol>
		<li>在5,000 × g离心15分钟，沉淀不溶物。加入抗淬灭剂，如2.5% DABCO。分装为500 µL，于-20 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>类球体的免疫荧光染色（图5） 
	注意：使用移液器缓慢向腔室载玻片中添加或移除液体。避免使用抽吸装置，以免破坏胶原层。
	<ol>
		<li>按照第1至第2节所述，制备类球体并将其包埋于含胶原的腔室载玻片中。 
		注意：通过使用较薄的层或较小体积的胶原蛋白，可将胶原蛋白自发荧光降至最低。</li>
		<li>尽可能从每个培养腔室玻片中移除培养基。</li>
		<li>用500 µL PBS短暂冲洗胶原层+ 洗去残留培养基的洗涤缓冲液。</li>
		<li>加入 500 µL 新鲜 PBS+ 每孔加入洗涤缓冲液，在37 °C孵育5分钟以洗涤类球体，重复两次。</li>
		<li>更换 PBS+ 用500 µL NBF固定缓冲液洗涤。室温孵育20 - 25分钟。</li>
		<li>去除NBF固定液，加入500 µL PBS洗涤+ 洗涤缓冲液。用新鲜的PBS洗涤5分钟。+ 至少用洗涤缓冲液洗涤 3 次。 
		注意：固定后的球状体可在新鲜 PBS 中于 4 °C 保存+ 洗涤缓冲液可使用数天。储存期间可在洗涤缓冲液中添加0.01%叠氮化钠，以抑制微生物生长。</li>
		<li>更换 PBS+ 用500 µL通透缓冲液洗涤缓冲液。室温孵育10-15分钟。</li>
		<li>用500 µL BSA封闭缓冲液替换通透缓冲液，室温孵育1 h。
		<ol>
			<li>可选步骤：移除 BSA 封闭缓冲液。使用手术刀或剪刀，从胶原层中切下类球体及其周围 3 mm × 3 mm 的区域。使用宽口的 p1000 枪头，用新鲜的 BSA 封闭缓冲液轻轻冲洗，使切下的胶原组织块脱落。将胶原组织块转移至 1.5 mL 离心管中。</li>
			<li>在 2,000 × g 条件下离心 2 分钟，弃上清液。可将离心管小心倒置在干净的纸巾上，以吸除多余液体。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>加入一抗至球状体中，在室温下孵育1小时。加入足量的一抗，确保整个胶原层完全浸没。上述可选步骤（5.6.8.1–5.6.8.2）通常允许使用较少体积的抗体。</li>
		<li>将腔室载玻片浸入含有至少10 mL PBS的容器中+ 用洗涤缓冲液洗涤10分钟，重复至少两次。
		<ol>
			<li>可选步骤：如果此前已将类球体从胶原层中切除（步骤 5.6.8.1），则加入至少 1 mL PBS+ 向1.5 mL离心管中加入洗涤缓冲液并轻轻振荡，室温孵育至少10分钟。</li>
			<li>尽可能去除 PBS+ 尽可能吸出洗涤缓冲液，并用 PBS 重复洗涤+ 用洗涤缓冲液至少洗涤两次。在2,000 x g离心数分钟，使胶原块沉淀。 
			注意：将腔室载玻片浸入洗涤缓冲液前，需先用70%乙醇擦拭其外表面以清洁。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用适当的二抗重复步骤 5.6.9-5.6.10。 
		注意：如果类球体在成像容器中直接染色，则继续进行步骤 5.6.13。</li>
		<li>可选步骤：如果类球体先前已从胶原层中切除（步骤 5.6.8.1），则使用 70% 乙醇清洁载玻片和适用于共聚焦显微镜的盖玻片。
		<ol>
			<li>尽可能去除胶原蛋白块中的洗涤缓冲液，并重悬于超纯H2O. 在封片前立即执行此步骤。切勿将染色后的组织块长时间浸泡在水中。</li>
			<li>使用尖头镊子夹住胶原块边缘，转移至玻片上。</li>
			<li>用镊子固定胶原蛋白，再用干净的棉签吸去胶原蛋白块上多余的液体，注意不要直接接触胶原蛋白。 
			注意：如果胶原蛋白粘附在棉签上，可使用镊子轻轻移除，或将其浸入水中去除。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用反向移液技术，将100 µL MOWIOL封片剂滴加到胶原块上，然后将盖玻片覆盖在样品上。
		<ol>
			<li>使用棉签或纸巾从盖玻片下方吸除多余的MOWIOL封片剂和水分。</li>
			<li>让MOWIOL封片剂在4 °C下过夜硬化。用指甲油密封盖玻片边缘。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用共聚焦显微镜或荧光显微镜对染色的球状体进行成像，以观察目的蛋白的定位及侵袭性结构的形成情况， 等等。 (图5B、图5C). 
		注意：染色后的球状体应避光保存，以防止光漂白。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 悬浮凋亡检测
注意：该类球体形成方案可轻松适用于多种细胞类型，用于量化非贴壁依赖性生长及抗失巢凋亡能力。
<ol>
	<li>用于失巢凋亡检测的细胞接种（图6）
	<ol>
		<li>按照第1.4节中的类球体生成说明操作，但使用至少30 mg/mL的甲基纤维素配制类球体形成培养基。 
		注意：加热后，30 mg/mL的甲基纤维素应形成较稠的凝胶，以维持细胞悬浮状态。</li>
		<li>将细胞孵育数天至数周，定期在显微镜下以10倍放大倍数观察。抵抗失巢凋亡的细胞应能增殖并形成克隆。</li>
		<li>通过测量每个孔中形成的克隆数量和大小来定量失巢凋亡。 
		注意：一旦形成克隆，可进行洗涤以去除甲基纤维素，并用于基于类球体的检测，方法如前所述。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们提出一种快速且灵活的方法，用于生成三维细胞球体，以模拟组织结构的架构 体内 利用廉价且广泛易得的试剂处理组织。本方案利用了MC的非细胞毒性及促进黏附的特性8,9 以介导细胞聚集并最大限度减少单层细胞的形成。与来源于动物的蛋白质基质不同，MC具有惰性，不含生长因子，且可通过洗涤轻松去除，从而在无需残留基质的情况下分离出类球体，用于多种应用。本方案通过快速聚集数量一致的细胞生成大小均一的类球体，便于对在不同实验条件下培养的类球体进行直接比较。该方法可适用于共培养体系，以模拟 体内 通过组合固定数量的多种肿瘤相关细胞类型来研究肿瘤生长例如 成纤维细胞、白细胞、基质细胞）以更准确地模拟肿瘤微环境。
使用高浓度甲基纤维素（MC）接种细胞对本方案进行修改后，可用于监测能够在悬浮状态下增殖的细胞的非贴壁依赖性生长，并可作为脱离凋亡（anoikis）检测方法（第6节），用于识别或定量细胞转化。本方案生成的球形细胞聚集体适用于...

使用传统的二维（2D）细胞培养方法评估肿瘤细胞行为在生物学上具有相关性挑战，部分原因是这些方法无法充分反映细胞所处的微环境 体内. 将细胞外基质组分引入培养的替代方法（例如，Boyden小室实验）在生理学上更能代表 体内 组织微环境。然而，这些方法仅限于评估单个细胞的行为，无法重现复杂的 体内 细胞-基质和细胞-细胞相互作用的多种组合，这些相互作用促进组织或肿瘤生长1,2,3.
多细胞球体的使用是一种较新的方法，能够更准确地再现致密的组织结构 体内 细胞生长1,4类球体可用于研究正常细胞的细胞-基质相互作用，也可作为肿瘤类似物，用于模拟肿瘤进展的特征，如转移性生长或药物耐药性4.
类球体可通过单细胞在基质中增殖形成5，或通过促进多个细胞聚集形成单个细胞团簇而更快地生成（例如，悬滴法、离心法）6,7。现有的细胞聚集技术可能需要昂贵的材料或专用设备。此外，这些类球体在大小和形态上差异较大，且难以大量制备，使得不同生长条件或处理之间的比较变得困难。最后，通过这些方法生成的类球体在后续应用于其他实验时，可能难以从其嵌入的蛋白性细胞外基质中有效分离出来。
本文介绍一种稳健且易于修改的细胞聚集方法，利用市售的U型底细胞排斥板和惰性促黏附基质甲基纤维素，快速形成大小均一的细胞球。一旦形成，这些多细胞球体可轻松分离，用于多种应用。该方案还可轻松调整，通过细胞增殖生成球体，可用于评估其他细胞过程。本文以细胞侵袭实验（通过免疫荧光染色定量）和失巢凋亡实验为例，展示了这两种不同球体形成方案的应用。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;缓冲液&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x 磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21114</td><td>用于 PBS&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; 洗涤缓冲液；加入氯化钙后，不得对 PBS&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; 洗涤缓冲液进行高压灭菌</td></tr><tr><td>氯化镁溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028</td><td>用于 PBS&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; 洗涤缓冲液；加入氯化镁后，不得对 PBS&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; 洗涤缓冲液进行高压灭菌</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;用于类球体形成&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 孔 U 型底防细胞黏附板</td><td>Greiner Bio-One</td><td>650970</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5546</td><td>用于 SH-SY5Y、PANC-1、TPC-1 细胞系的培养</td></tr><tr><td>F12K 培养基</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2112722</td><td>用于 TT 细胞系的培养</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1051</td><td>使用前需过滤以去除颗粒污染物</td></tr><tr><td>甲基纤维素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7027</td><td>以水配制至 100 mg/mL</td></tr><tr><td>罗斯威尔公园纪念研究所培养基（Roswell Park Memorial Institute Medium）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td>用于 HCT-116、BxPC-3 细胞系的培养</td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12605028</td><td>解离缓冲液</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;用于侵袭实验&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>牛 I 型胶原蛋白</td><td>Corning Incorporated</td><td>354231</td><td>储存浓度为 3.1 mg/mL；使用时需保持在冰上</td></tr><tr><td>无酚红低糖 DMEM 培养基&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11054-20</td><td>与含酚红的培养基相比，背景荧光更低</td></tr><tr><td>胶质细胞源性神经营养因子</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td>趋化因子</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;用于免疫荧光显微镜&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>#1.5 盖玻片</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72225-01</td><td>用于固定切除的类球体</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 标记鬼笔环肽</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12379</td><td>用于以 1:200 比例染色肌动蛋白</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Bioshop Canada Incorporated</td><td>ALB001</td><td>用于 BSA 封闭缓冲液</td></tr><tr><td>Dabco 33-LV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>290734</td><td>抗荧光淬灭剂</td></tr><tr><td>甘油&amp;nbsp;</td><td>Bioshop Canada Incorporated</td><td>GLY001</td><td>用于 MOWIOL 封片剂</td></tr><tr><td>ImageJ 软件</td><td>Freeware, NIH</td><td>-</td><td>用于图像分析&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>载玻片</td><td>VWR International</td><td>48312-024</td><td>用于固定切除的类球体</td></tr><tr><td>MOWIOL 4-88</td><td>EMD-Millipore</td><td>475904</td><td>用于 MOWIOL 封片剂</td></tr><tr><td>多聚甲醛&amp;nbsp;</td><td>EMD-Millipore</td><td>PX0055-3</td><td>用于固定缓冲液</td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>Bioshop Canada Incorporated</td><td>TRX777</td><td>用于通透缓冲液</td></tr></tbody></table>

一种高效且灵活的细胞聚集法用于三维球状体的制备

An Efficient and Flexible Cell Aggregation Method for 3D Spheroid Production

单层细胞培养无法充分模拟 体内 组织的行为涉及复杂的细胞间及细胞与基质间的相互作用。三维（3D）细胞培养技术是为克服贴壁细胞培养的局限性而开发的近期创新方法。尽管已有多种用于构建组织类似物的技术 体外 已开发出多种方法，但这些方法通常较为复杂，建立成本高昂，需要专用设备，且通常仅适用于特定类型的细胞。本文介绍一种快速且灵活的方案，可用于将细胞聚集成大小均一的多细胞三维球体，适用于多种肿瘤细胞系和正常细胞系的培养。我们通过调节血清和甲基纤维素（MC）的浓度，以促进非贴壁依赖性的球体形成，并高度可重复地防止细胞单层结构的产生。通过调整球体形成培养基中MC或血清的浓度，可为不同细胞系优化最佳培养条件。所生成的三维球体可收集用于多种应用，包括细胞信号通路或基因表达研究、候选药物筛选，以及肿瘤细胞侵袭与迁移等细胞过程的研究。该方案还可轻松改造用于从单个细胞生成克隆性球体，并可用于评估非贴壁依赖性生长及抗失巢凋亡特性。总体而言，本方案提供了一种易于调整的方法，用于生成和利用三维细胞球体，以模拟组织的三维微环境并重现相关生物学过程 体内 正常细胞与肿瘤细胞的生长

我们介绍一种灵活且高效的方法，利用抗细胞黏附培养板及添加了MC的类球体形成培养基，来生成离散的类球体。在适宜的MC浓度和血清条件下，单个细胞会沉降至孔中央并相互黏附，形成类球体，同时几乎不黏附于孔底表面。通过本方案，已从多种细胞系成功生成类球体（图 2B）。需要针对每种细胞系进行基质胶（MC）和血清浓度的滴定，以确定最佳条件，使仅形成一个结构稳定、足以在操作过程中不发生碎裂的类球体。理想情况下，类球体的直径应介于200至 500 µm 直径一致，由紧密贴附的细胞组成，细胞碎片极少。类球体在轻柔操作下可保持完整无损，因而能够被收集并用于多种检测。
类球体的形成可能受到细菌或其他微生物污染的影响（图 3A），从而导致死细胞聚集成团。当存在灰尘或其他纤维状污染物时，会形成多个或形状不规则的细胞簇，这些细胞簇仅轻微聚集，在操作过程中容易解体。类球体的形成也受到类球体形成培养基中甲基纤维素（MC...

本文介绍了一种通过细胞聚集快速形成三维细胞球体的灵活实验方案。该方法可轻松适用于多种细胞类型，适用于细胞迁移、侵袭或失巢凋亡检测，以及细胞-基质相互作用的成像与定量分析等多种应用。

单层细胞培养无法充分模拟组织在体内的行为，因为组织在体内涉及复杂的细胞间及细胞与基质间的相互作用。

旁白 本方法的总体目标是通过细胞聚集高效地大量生成稳定的细胞球体，用于多种基于细胞的检测。该技术的主要优势在于使用了一种非蛋白性的水溶性基质来促进细胞聚集和球体形成，从而实现细胞球体的简便快速分离。该方法有助于深入理解细胞生物学中细胞-细胞及细胞/基质相互作用在三维微环境中对组织生长的影响。旁白 在制备凝胶前，将50毫升超纯水加热至80摄氏度，加入10克甲基纤维素粉末。搅拌悬浮液，直至颗粒均匀分散。然后加入冷的超纯水，定容至100毫升，并在4摄氏度下静置过夜，直至溶液变为澄清的淡黄色，且无可见固体颗粒。将溶液通过0.45微米滤膜过滤，以去除任何未溶解的碎片，并用适当的培养基将过滤后的溶液稀释至1:5毫克/毫升。然后将添加了甲基纤维素的培养基通过0.22微米滤器过滤。接下来，在生物安全柜中，用PBS洗涤70%融合度的传代培养细胞，并在细胞培养箱中加入3毫升胰蛋白酶-EDTA消化缓冲液使细胞脱落。几分钟后，在10倍放大倍数的光学显微镜下观察细胞。当细胞从培养板上脱落时，加入七毫升含血清的培养基以中和反应。将细胞悬液转移至一个新的15毫升离心管中，然后通过离心收集解离的细胞。除了污染物颗粒外，导致类球体形成失败的最常见原因是甲基纤维素或血清的浓度未达到针对特定细胞系聚集和生长的最佳水平。旁白：使用带滤芯吸头的P1000移液器，将一毫升类球体形成培养基缓慢吹打沉淀物3至5次，移液器吸头以轻微倾斜的角度紧贴试管底部，吹打过程中缓慢操作，不要将吸头内的全部液体完全排出，以剪切沉淀物。计数后，将细胞悬液稀释至每毫升含1×10⁴个细胞的浓度，并用过滤后的超纯水冲洗无菌多通道移液器储液槽，以去除任何灰尘和纤维。将细胞分装至储液槽中，使用带滤芯的吸头将100微升细胞悬液转移至96孔U型底防粘附板的每个孔中，转移过程中需定期混匀细胞悬液，以防止细胞沉降至储液槽底部。所有细胞接种完成后，将培养板置于组织培养孵箱中，并每日观察各孔内球状体形成情况。细胞通常在6小时内沉降至各孔底部，并在24至48小时内聚集成球状体。为确认成功形成类球体，使用P10枪头在光学显微镜下轻轻将培养基吹打至类球体表面。正确形成的类球体会从培养板上松动并滚动，从而证实其三维结构。为将类球体包埋于胶原蛋白中，采用反向移液法，将每孔至少50 µL的中和胶原蛋白溶液均匀涂布于八孔组织培养腔室载玻片的每个孔底部。当所有孔均已被覆盖后，将腔室载玻片放入盛有超纯水的35毫米组织培养皿中，再置于10厘米组织培养皿内，在37摄氏度下孵育约1小时。当胶原蛋白聚合完成后，使用P1000滤芯吸头小心地将预先形成的球状体转移至1.5毫升微量离心管中。必须将胶原基底层孵育至完全聚合，以避免在添加球状体或培养基时扰动胶原结构。讲解员 将收获的类球体在台式微量离心机中收集，使用P200移液器去除上清液，必要时将离心管倒置在干净的纸巾上，吸除

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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