三维球体制作一个高效，灵活细胞聚集方法

旁白：该方法的总体目标是通过细胞聚集有效地生成大量稳健的细胞球体，用于各种基于细胞的检测。该技术的主要优点是它使用非蛋白水溶性基质进行细胞聚集和球状体形成，从而可以轻松快速地分离球状体。这种方法可以帮助在细胞生物学中获得关于细胞-细胞和细胞/基质相互作用对三维微环境中组织生长影响的新见解。

旁白 在准备骨料之前，将 50 毫升超纯水加热至 80 摄氏度，并加入 10 克甲基纤维素粉。搅拌悬浮液，直到颗粒均匀分散。然后加入冷的超纯水至最终体积为 100 毫升，并将颗粒在 4 摄氏度下储存过夜，直到溶液变得透明并呈稻草色，没有可见的固体。

将溶液通过 0.45 微米过滤器以去除任何未溶解的碎片，并在适当的培养基中稀释每毫升 1：5 毫克的过滤溶液。然后通过 0.22 微米过滤器过滤添加甲基纤维素的培养基。接下来，在生物安全柜中，用 PBS 洗涤 70% 汇合的传代培养物，并在细胞培养箱中用 3 毫升胰蛋白酶-EDTA 缔合缓冲液连接细胞。

几分钟后，在光学显微镜下以 10 倍放大倍率检查细胞。当细胞从板中浮出时，用 7 mL 添加血清的培养基中和反应。将细胞溶液转移到新鲜的 15 ml 试管中，然后通过离心收集释放的细胞。

除了污染颗粒外，球状体形成不成功的最常见原因是使用次优浓度的甲基纤维素或血清来聚集和生长特定细胞系。旁白 - 使用带有过滤吸头的 P1000 微量移液器，用 1 毫升球状体形成培养基研磨托盘 3 到 5 次，将移液器吸头以微小的角度压在试管底部，同时缓慢移液，不要排出整个吸头内容物以使沉淀变薄。计数后，将细胞悬液稀释至每毫升浓度 10 至 4 个细胞的 1 倍，并用过滤的超纯水冲洗无菌多通道移液器储液槽，以去除任何灰尘和纤维。

将细胞分配到储液槽中，并使用过滤吸头将 100 μL 细胞转移到 96 孔 U 形底细胞驱避板的每个孔中，定期混合细胞悬液，以防止细胞沉淀到储液槽底部。当所有细胞都就位后，将板放入组织培养箱中，并每天检查孔中是否有球状体形成。细胞应在 6 小时内沉降到每个孔的底部，通常在 24 至 48 小时内聚集成球状体。

为了确认成功球体的形成，在光学显微镜下使用 P10 吸头轻轻地将培养基移液到球体上。正确形成的球体将从板上松动并滚动，确认其 3-D 结构。要将球体包埋在胶原蛋白中，请使用反向移液将每孔至少 50 微升中和胶原蛋白均匀地涂在八孔组织培养室载玻片的每个孔的底部。

当所有孔都被覆盖后，将腔室载玻片放入装满超纯水的 35 毫米组织培养皿中，放入 10 厘米的组织培养皿中，并将 10 厘米的组织培养皿在 37 摄氏度下孵育约一小时。当胶原蛋白聚合后，使用 P1000 滤嘴小心地将预制的球体转移到 1.5 mL 微量离心管中。胶原蛋白基层必须孵育直到它们完全聚合，以避免在添加球状体或培养基时干扰胶原蛋白。

旁白 将收获的球体收集在台式微量离心机中，并使用 P200 移液器去除上清液，必要时在干净的纸巾上通过试管倒置吸走任何多余的上清液。使用大口径 P200 移液器吸头，立即将球体重新悬浮在 50 微升中和胶原蛋白中，并小心地将球体胶原蛋白混合物转移到 8 孔组织培养室载玻片的每个孔中。将玻片放回培养箱中，直到胶原蛋白聚合。

大约一小时后，向每个孔中缓慢添加至少 100 微升含有适当目标处理的温热培养基，以进行另一次孵育。然后使用荧光显微镜通过侵入的球体获取光学成像切片。使用该方案，可以从各种细胞系中生成球状体。

在适当的甲基纤维素和血清处理条件下，单个细胞在孔中心沉降并粘附在一起，形成球状体，对孔底的粘附最小。一些细胞系能够在不存在甲基纤维素或甲基纤维素浓度低的情况下粘附在细胞排斥板上，从而形成被细胞单层包围的球状体。通常，较高浓度的甲基纤维素会阻止细胞粘附在孔上。

但是过高浓度的甲基纤维素会降低细胞间的粘附，并阻止细胞沉降到孔底，从而导致形成松散的聚集体和许多卫星球体。胶原包埋的球状体可以用化学引诱剂处理，以诱导单个细胞从球状体向外侵入周围的基质。固定的胶原包埋的球体可以通过明场显微镜成像，以量化侵袭细胞的距离和数量，或者通过免疫荧光显微镜来可视化迁移细胞形成的侵袭结构。

重要的是要留出足够的时间让细胞聚集成结构合理的球状体，这些球状体足够坚固，可以作而不会碎裂，并且可以轻松收集用于后续分析。我们的细胞生长方案可以进一步适用于多种细胞生物学分析。例如，将细胞置于补充有高浓度甲基纤维素的培养基中可用于评估细胞抗性。

看完这个视频，你应该对如何通过聚集生成三维细胞球体有了很好的了解，这将是许多细胞生物学应用的宝贵工具。