Name: 多细胞球体的生产和多参数活细胞荧光寿命成像显微镜 （FLIM） (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-09T13:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: 了解多细胞球体制备方法，结合荧光寿命成像显微镜（FLIM）技术进行活细胞代谢分析。本方案展示三维细胞培养模型中细胞代谢与氧分布的多参数成像技术，为减少动物实验提供标准化方法。

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本工作由根特大学特别研究基金（BOF）资助（BOF/STA/202009/003；BOF/IOP/2022/058）、佛兰德研究基金会（FWO，I001922N）以及欧盟fliMAGIN3D-DN地平线欧洲计划—玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里行动—博士项目（No. 101073507）资助。

Multicellular Spheroid Formation for FLIM-Based Metabolic and Hypoxia Analysis

无任何利益冲突需要披露。

多细胞球体正成为研究肿瘤和干细胞生态位微环境、药物发现以及生物制造中“组织构建单元”开发的首选方法。球体内部结构的异质性以及营养和氧气梯度可模拟体内组织的相应特征。 体内 在相对简化且易于操作的条件下对组织和肿瘤进行研究。随着对方法学透明度需求的增加26,28 和标准化71这些方案有望帮助研究人员为活细胞定量荧光寿命成像显微实验选择最佳的类球体形成方法。所介绍的方法利用了细胞染色纳米颗粒传感器以及细胞固有的自发荧光，且可轻松与细胞死亡染色相结合。
最关键的步骤在于类球体形成方案；因此，对于高通量的基于琼脂糖的方法，必须充分平衡琼脂糖模具与培养基。平衡时间不足会导致残留 PBS 中的营养成分被稀释，从而引入类球体异质性的额外因素21,26,72,73。新制备的琼脂糖模具还必须通过肉眼检查是否存在气泡、微裂纹及其他缺陷。
尽管纳米颗粒悬浮液在成像方面效率较高，但在低黏附条件下形成类球体时，可能会出现自聚集现象，并导致形成不规则形状的类球体。这一问题通常可通过在培养基中添加血清，或在类球体形成前对单层细胞进行预染色来缓解。此外，在类球体致密化过程中，加入少量纳米颗粒（例如，初始染色浓度的10%）也有助于对类球体的增殖区域进行染色。最后，重要的是在所有类球体形成方法中均应使用&#34;无尘&#34;无菌移液器吸头。
在成像实验过程中，必须始终考虑光照对细胞活力的潜在影响。因此，了解对每项活细胞成像实验产生负面影响的风险因素至关重要。一般来说，光损伤涉及多种机制：（1）局部温度显著升高，（2）机械应力，以及（3）光化学应力（氧化反应和自由基反应）74。根据成像方式的不同（例如单光子共聚焦成像与多光子成像、连续照明与脉冲照明模式、探测器的灵敏度以及在可调激发波长下光源的功率），细胞和组织类型（例如，不同组织类型中高效吸光色素或其他自发荧光分子的积累差异、三维与二维结构、生长和成像培养基的组成），以及荧光探针的来源（例如其光敏特性），多种风险因素的不同组合可能在成像过程中引发光毒性。此外，即使在光照后未观察到细胞死亡率增加，光强依赖性的线粒体和代谢早期前死亡效应仍可能干扰实验结果的分析与解释55。
为排除光毒性对实验结果的影响，研究人员应通过与未处理对照组比较，或使用细胞死亡探针评估光照后细胞死亡率的增加，来常规监测细胞活力及细胞形态的变化。若进行代谢实验，应在预实验中相应优化成像参数，以评估并最小化成像过程对所测代谢参数的影响。对于氧敏感探针，由于所谓的“光诱导 O2 消耗”效应，过量光照可通过 O2-敏感染料的磷光寿命和强度突然增加（相应表现为参考染料与 O2-敏感染料的强度比的变化）而被轻易追踪53,75。这可通过使用例如以下已发表方案25，对不同光强参数下的延时实验进行动力学曲线分析来轻松实现。近期研究显示，脉冲照明（例如在 TCSPC-F(P)LIM 显微镜中使用）与稳态照明测量相比，对活性氧（ROS）产生和探针光漂白的影响极小76,77，这进一步凸显了 TCSPC-FLIM 相较于传统基于强度的成像方法的额外优势。
所介绍的类球体形成方法的主要局限性在于其在直接和长期监测应用方面。由于琼脂糖层较厚，琼脂糖模具需要使用长工作距离物镜（或额外的正置显微镜或荧光体视显微镜）；此外，5D Spheriplate 材料可能会干扰红色荧光通道的检测（O2 探针）。高通量方法生成的类球体尺寸受限于微孔直径，且需频繁更换培养基以避免营养耗竭和酸化。鉴于上述各项限制，我们建议在需要高通量的实验（例如三维生物打印应用）中使用3D培养皿（MicroTissue），而在低黏附性方法中采用 &#34;中通量&#34; 基础研究，同样需要较少的细胞数量。
如果倒置显微镜配备了近红外（NIR）敏感相机、基于发光二极管（LED）的激发光源以及合适的物镜，则可在其上以较低成本进行比率式氧合监测和传统的基于活细胞荧光染料的显微成像实验25。对于更合适的光学切片和荧光寿命成像（FLIM），建议使用现成的商用共聚焦显微镜系统（如本文所述）。尽管我们也描述了一种检测NAD(P)H自发荧光的方法，该方法需要成本较高的双光子FLIM显微镜，但目前已有多种不同的方法适用于共聚焦FLIM系统，理想配置应包括白光激光器和混合探测器或单光子雪崩二极管（SPAD）探测器。这些方法包括细胞代谢评估、FRET-FLIM生物传感器蛋白、细胞与组织力学成像、特定细胞和组织类型的自发荧光，以及通过FLIM-FRET可视化受体-药物相互作用31。
供应商提供的FLIM采集与分析软件可能影响实验的成功，因为并非总能将仪器响应函数（IRF）或图像导出为与下游开源分析兼容的格式。数据后处理是FLIM分析流程中的重要环节，但目前尚未实现普遍的标准化或广泛接受。与相量法相比，曲线拟合需要更多的光子数量和更强的计算能力。FLIMfit45（支持全局及逐像素拟合）和Flimview78是常用于曲线拟合分析的开源软件，而PAM79、FLUTE64和AlliGator80则用于相量分析。FLIMJ46是一个实用的ImageJ插件，可支持上述两种分析方法。总体而言，这些工具有助于优化后处理流程，使其更加快速、灵活且易于使用。

多细胞球体是一类通过细胞自聚集形成的三维组织模型，具有球形结构。它们被广泛用于模拟细胞间以及细胞与基质间的相互作用 体外 并在多种癌细胞和干细胞来源的结构中重建三维环境。为减少细胞贴壁并促进细胞聚集，采用了多种技术，包括利用表面张力的悬滴法1；防止细胞贴附的方法，如超低吸附培养板、微模具和微孔板2,3基于声波的方法4；流致聚集方法（旋转瓶、生物反应器和微流控装置）5磁性颗粒辅助形成6 以及促进聚集的合成基质和基于细胞外基质的基质与支架的应用7,8,9.
在癌症研究以及新药疗法的开发与验证中，类球体因其能够重现营养物质、代谢废物和O2在空间上的扩散限制性梯度而成为一种理想的模型，这种梯度常导致坏死核心的形成，类似于实体瘤的特征10,11。这些更可靠且复杂的体外（in vitro）模型根据动物实验的3R原则（替代、减少和优化），挑战了对动物模型广泛使用的必要性（美国食品药品监督管理局[FDA]现代化法案2.012）。除了癌症研究外，类球体还广泛应用于干细胞研究。例如，多能干细胞具有形成拟胚体（EB）的能力，可用于将诱导性多能干细胞（iPSCs）分化为难以直接从患者体内获取的特定细胞类型，如神经前体细胞13或卵巢颗粒细胞13,14。此外，拟胚体的形成通常是构建更复杂的类器官模型的第一步，例如神经类器官15、视网膜类器官16、心脏类器官17、肝脏类器官18、胃类器官19和肠道类器官20。在选择适合实验的类球体形成方法时，应考虑尺寸、可重复性、通量以及后续应用等因素。
与二维培养相比，三维培养的复杂性增加可能导致更高的变异性。营养成分21、培养基蒸发22、黏度23、pH 控制24、类球体形成方法，甚至培养时间25,26等因素均可能导致获得的类球体在形态、大小、活性以及化疗耐药性方面存在差异27,28。近期研究表明，类球体内的氧浓度梯度并非始终静态，其受形成方法、类球体大小及细胞外黏度的影响，进而影响类球体的异质性29。为提高类球体研究的可重复性和数据可及性，已开发了MISpheroID知识库26，明确将细胞系、培养基、形成方法和类球体大小列为获得可重复结果所需的最低信息。因此，本文对多种高通量方法（SphericalPlate 5D、实验室自制微模具和Microtissue模具）以及低吸附方法（即Biofloat和Lipidure包被的96孔板，包括无支架和有支架体系）进行了详细比较（图1和表1），比较内容包括孔径尺寸（用于估算类球体的最大尺寸）、耗材使用情况、制备时间，以及是否可在不将类球体转移至显微镜培养皿的情况下进行实时监测。后者支持长期研究，而采用高通量方法生成的类球体通常仅适用于终点实验。除5DspheriPlate的网格结构外，所有方法均不会引入不必要的自发荧光，因而可直接用于显微成像。
<img alt="用于细胞培养的不同类型培养板中微孔尺寸的类球体形成示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66845/66845fig01.jpg" data-altupdatedat="1762425657000" data-alt="图1"> 
图1：类球体形成方法说明。 高通量方法包括 SphericalPlate 5D，其培养板中集成了专利微孔结构；而实验室自制的微模具和 MicroTissue 模具则通过印模在琼脂糖（蓝色）中制造多个微孔。低吸附培养板，如 Lipidure（Amsbio）和 Biofloat（Sarstedt），采用非黏附性涂层以抑制细胞与表面的黏附，促进细胞自聚集。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66845/66845fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>5D SpheriPlate</td>
			<td>自制微模具</td>
			<td>微组织</td>
			<td>低吸附方法</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>每孔类球体数量</td>
			<td>750</td>
			<td>1589</td>
			<td>81</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>孔直径</td>
			<td>90 µm</td>
			<td>400 µm</td>
			<td>800 µm</td>
			<td>1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>培养体积</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>5 mL</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>200 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>其他耗材</td>
			<td>/</td>
			<td>7 mL 3% 琼脂糖</td>
			<td>500 µL 2% 琼脂糖</td>
			<td>/ *</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>准备时间</td>
			<td>10 分钟</td>
			<td>2 小时 + 3 天培养基适应</td>
			<td>0.5 小时 + 15 分钟培养基适应</td>
			<td>10–30 分钟 + 1 小时干燥</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>可监测性</td>
			<td>是</td>
			<td>否**</td>
			<td>是</td>
			<td>是</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>自发荧光</td>
			<td>是</td>
			<td>否</td>
			<td>否</td>
			<td>否</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>可重复使用</td>
			<td>否</td>
			<td>是</td>
			<td>是</td>
			<td>否**</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">成本</td>
			<td rowspan="2">€€</td>
			<td rowspan="2">€</td>
			<td rowspan="2">€€€€</td>
			<td>€€€€：包被材料和Matrigel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>€€：商用96孔板</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">*某些细胞系需要添加细胞外基质（如2%–5% Matrigel）以形成致密的类球体。</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">**包被材料可重复使用直至耗尽。然而，每次使用会消耗少量培养基，且随时间推移可能积聚灰尘，需定期进行滤膜除菌。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：多种类球体形成方法的比较29。“监测”：无需转移至显微镜培养皿即可监测类球体的能力。€：0-50€，€€：50-150€，€€€：150-500€，€€€€：&gt;500€
荧光显微镜能够直接监测类球体内的关键生物学特征，包括细胞死亡、存活能力、增殖、代谢、黏度，甚至力学特性30。荧光寿命成像显微镜（FLIM）为研究荧光探针在其（微）环境中的相互作用提供了额外的定量维度31,32,33,34，可根据不同的发射寿命解析重叠的发射光谱35,36，以及基于细胞内源性自发荧光探测细胞代谢状态。因此，诸如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NAD(P)H）、黄素单核苷酸（FMN）、黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）、原卟啉IX等广泛存在的细胞内源性荧光化合物，可通过单光子或双光子FLIM进行检测，并作为葡萄糖分解代谢、氧化磷酸化（OxPhos）的内源性“传感器”，从而提供细胞氧化还原状态的总体概况。NAD(P)H以游离胞质形式或与蛋白质结合的线粒体形式存在37,38。类似地，FAD的氧化态具有荧光特性，其游离形式的荧光寿命更长。NAD(P)H和FAD的显微成像通常采用双光子激发FLIM，以避免样品发生光损伤39。通常，“光学代谢成像”FLIM还可结合染料探针、基因编码的生物传感器、磷光寿命成像显微镜（PLIM）以及基于比率的强度测量方法，以更全面地揭示类球体或类器官的代谢、氧合状态、增殖及细胞存活情况29,30,31。此外，FLIM还可与 Förster 共振能量转移（FRET）技术结合，通过检测供体荧光团在与受体近距离接触时的寿命变化，研究药物与其靶标区域的结合情况33,40,41。
获取的荧光寿命成像（FLIM）图像通常用于逐像素计算荧光寿命。目前，获得荧光寿命主要有三种常用策略：半定量的“快速FLIM”42（有时称为“tau sense”43,44）、通过单指数、双指数或三指数拟合进行衰减曲线拟合，以及基于相量转换和相量图分析的“无需拟合”方法。根据设备供应商的不同，可使用其提供的软件（如LAS X、Symphotime、SPCImage等）或开源软件（例如FLIMfit45、FLIMJ46或其他工具47）来处理测得的FLIM数据。通常，供应商提供的软件适用于初步数据分析，而开源解决方案则可实现更精确的研究，例如利用相量图和三维可视化分析。
尽管荧光寿命成像显微镜（FLIM）作为一种研究类球体的方法具有实用性和吸引力，但目前可用的实验方案极少，且在选择最适合进行涉及FLIM的活细胞多参数显微成像实验的类球体形成方法方面普遍缺乏指导。本文基于形态学、活性及氧合状态，对常用的类球体形成方案进行了详细比较，并采用了近期已验证并表征的远红光和近红外（NIR）氧传感纳米探针（MMIR1）。该阳离子纳米颗粒负载了两种报告染料：一种是不受O2影响的参考染料——氮杂-BODIPY（激发波长650 nm，发射波长675 nm），另一种是NIR范围内对O2敏感的金属卟啉PtTPTBPF（激发波长620 nm，发射波长760 nm）。MMIR1可在常规荧光显微镜（通过比率分析）或磷光寿命显微镜（PLIM）上实现氧梯度的实时分析，且无细胞毒性，可提供稳定信号，支持长期监测和多重检测25,29。根据是否需要染料或纳米探针染色、类球体通量或细胞类型的不同，可选择最合适的形成方案。由于类球体的活性和氧合状态研究在癌症及干细胞来源类球体研究中具有重要意义，本文所展示的方案还包括使用这些模型进行NAD(P)H-FLIM和FAD-FLIM的示例及预期典型结果。本文介绍的成像与分析流程针对目前最主流的基于时间相关单光子计数（TCSPC）的FLIM显微成像平台。

<table><tbody><tr><td>0.05% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>Sigma 也提供该产品</td></tr><tr><td>10 mL 血清移液管</td><td>VWR</td><td>612-3700</td><td>Sarstedt、Corning、VWR 及其他公司也提供类似产品</td></tr><tr><td>12 孔细胞培养板，无菌</td><td>Greiner bio-one</td><td>665-180</td><td>Sarstedt、Corning 及其他公司也提供类似产品</td></tr><tr><td>12 孔可拆卸腔室载玻片</td><td>Ibidi</td><td>81201</td><td>Grace Bio-Labs、ThermoFisher Scientific 及其他公司也提供该产品</td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>Nerbe plus</td><td>02-502-3001</td><td>Sarstedt、Corning、VWR 及其他公司也提供类似产品</td></tr><tr><td>3D 培养皿微模具</td><td>Microtissue</td><td>Z764000-6EA</td><td></td></tr><tr><td>6 孔细胞培养板，无菌</td><td>Greiner bio-one</td><td>657160</td><td>Sarstedt、Corning、VWR 及其他公司也提供类似产品</td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td>ChemLab</td><td>CL02.0537.5000</td><td></td></tr><tr><td>Biofloat</td><td>Sarstedt</td><td>83.3925.400</td><td>用于类球体形成的商业化涂层 96 孔板</td></tr><tr><td>Calcein Green-AM</td><td>Tebubio</td><td>AS-89201</td><td>使用时稀释 1:1000</td></tr><tr><td>CellSens Dimension 软件</td><td>Olympus</td><td>version 3</td><td></td></tr><tr><td>人胎盘来源 IV 型胶原蛋白</td><td>Sigma</td><td>C5533</td><td>用于制备 0.07 mg/mL 胶原蛋白和 0.03 mg/mL 多聚-D-赖氨酸包被的显微镜培养皿</td></tr><tr><td>共聚焦荧光寿命显微镜</td><td>Leica Microsystems</td><td>N/A</td><td>Stellaris 8 Falcon 倒置显微镜，配备白光激光器、HyD X 检测器、气候/温度控制腔室（OkoLab）、25x/0.95 W 物镜</td></tr><tr><td>D(+)-葡萄糖</td><td>Merck</td><td>8342</td><td>配制 1 M 储存液，使用时稀释 1:100（成像培养基终浓度为 10 mM）</td></tr><tr><td>无酚红、无葡萄糖、无丙酮酸、无谷氨酰胺的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5030-10X1L</td><td>用于成像培养基的配制</td></tr><tr><td>胎牛血清&amp;nbsp;(FBS)</td><td>Gibco</td><td>10270-098</td><td>Sigma 也提供该产品。使用前需进行热灭活</td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td>使用时稀释 1/100（成像培养基终浓度为 10 mM）</td></tr><tr><td>人结肠癌细胞 HCT116</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>version 1.54f</td><td></td></tr><tr><td>Leica Application Suite X (LAS X)</td><td>Leica Microsystems</td><td>version 4.6.1.27508</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td>Sigma 也提供该产品。使用时稀释 1:100</td></tr><tr><td>Lipidure-CM5206</td><td>Amsbio</td><td>AMS.52000034GB1G</td><td></td></tr><tr><td>McCoy's 5A 培养基，需添加 1 mM 丙酮酸钠和 10 mM HEPES</td><td>VWR</td><td>392-0420</td><td>HCT116 细胞的标准生长培养基</td></tr><tr><td>微图案化 3D 打印 PDMS 印模</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>由根特大学微系统技术中心 Jan Vanfleteren 博士教授提供</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Chemlab</td><td>CL00.1429.100</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer 计数板</td><td>Fisher Scientific</td><td>15980396</td><td></td></tr><tr><td>O2 探针：MMIR1</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>完整表征、验证及部分应用可参见：https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.12.11.571110&lt;br/&gt; v1</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher scientific</td><td>Gibco18912014</td><td>将 PBS 片剂溶于 500 mL 蒸馏水中</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液（100 倍浓度）：青霉素（10,000 U/mL）/ 链霉素（10,000 &amp;mu;g/mL）</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Sigma 也提供该产品。使用时稀释 1:100</td></tr><tr><td>多聚-D-赖氨酸</td><td>Sigma</td><td>P6407-5mg</td><td>用于制备 0.07 mg/mL 胶原蛋白和 0.03 mg/mL 多聚-D-赖氨酸包被的显微镜培养皿</td></tr><tr><td>碘化丙啶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>25535-16-4</td><td>细胞死亡染色，使用浓度为 1 &amp;micro;g/mL，孵育 1 小时</td></tr><tr><td>PVDF 注射器滤器 0.22 &amp;micro;m</td><td>Novolab</td><td>A35149</td><td>Sarstedt、Corning、VWR 及其他公司也提供类似产品</td></tr><tr><td>丙酮酸钠（100 mM）</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td>使用时稀释 1/100（成像培养基终浓度为 1 mM）</td></tr><tr><td>SphericalPlate 5D 24 孔板</td><td>Kugelmeiers</td><td>SP5D-24W</td><td></td></tr><tr><td>无菌培养皿</td><td>Greiner bio-one</td><td>633181</td><td>Sarstedt、Corning、VWR 及其他公司也提供类似产品</td></tr><tr><td>组织培养瓶（25 cm&amp;sup2;）</td><td>VWR</td><td>734-2311</td><td>Sarstedt、Corning、VWR 及其他公司也提供类似产品</td></tr><tr><td>组织培养瓶（75 cm&amp;sup2;）</td><td>VWR</td><td>734-2313</td><td>Sarstedt、Corning、VWR 及其他公司也提供类似产品</td></tr><tr><td>U 型底 96 孔板</td><td>VWR</td><td>10062-900</td><td>Sarstedt、Corning、Greiner Bio-one 及其他公司也提供类似产品</td></tr><tr><td>超纯琼脂糖</td><td>Invitrogen (Life Technologies)</td><td>16500-500</td><td>其他类型的琼脂糖包括低熔点琼脂糖（A-9414，Sigma）、常规用途琼脂糖（A-9539，Sigma）</td></tr><tr><td>宽场荧光倒置显微镜</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td>IX81 倒置荧光显微镜，配备电动 Z 轴控制、CoolLED pE4000（16 通道，365–770 nm）、ORCA-Flash4.0LT（Hamamatsu）cMOS 相机、OkoLab 玻璃加热板、CellSens Dimension v.3 软件，以及 4x/0.13 UPlanFLN 和 40x/0.6 LUCPlanFLN 干物镜。（可选，用于高分辨率成像）60x/1.0 LUMPLFLN 水镜</td></tr></tbody></table>

多细胞球体的制备及多参数活细胞荧光寿命成像显微镜（flim）分析

Production and Multi-Parameter Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) of Multicellular Spheroids

多细胞肿瘤球体是一种流行的三维组织微聚集体&#160;用于模拟肿瘤微环境、测试并优化药物治疗的模型&#160;并在三维环境中利用生物传感器和纳米传感器。其易于制备、尺寸可预测、生长可控，以及观察到的营养物质和代谢物梯度，对于重现三维类生态位环境至关重要&#160;细胞微环境。然而，类球体的异质性及其制备方法的差异性可能影响整体细胞代谢、存活率以及药物反应，这使得选择最合适的&#160;方法学，需考虑尺寸、变异性、生物制造需求以及应用方面的相关要求 体外 干细胞与癌细胞生物学中的三维组织模型。特别是类球体的制备可能影响其与定量活体显微技术（如光学代谢成像、荧光寿命成像显微术（FLIM））以及类球体监测的兼容性&#160;利用纳米传感器或活力检测进行缺氧研究。本文介绍了多种传统的类球体形成方案，重点阐述了这些方案与活细胞宽场、共聚焦及双光子显微镜成像的兼容性。后续从成像到分析的流程&#160;结合多种癌症和干细胞类球体，展示了多路自体荧光FLIM的检测流程。

本文介绍了多种多细胞球体的形成方法，用于后续的多参数活细胞显微成像。通过荧光寿命成像显微技术（FLIM）、细胞自发荧光、染色染料和纳米颗粒，展示了对活体三维（3D）肿瘤细胞和干细胞来源的球体中细胞代谢、缺氧状态及细胞死亡进行分析的方法。

多细胞球体的制备及多参数活细胞荧光寿命成像显微镜（FLIM）分析

多细胞肿瘤球体是一种流行的三维组织微聚集体模型，用于模拟肿瘤微环境、测试和优化药物……

在本研究中，我们介绍并比较了可用于通过活细胞显微镜分析细胞代谢和氧分布的球形体形成方法。近年来，荧光寿命成像显微技术已被广泛用于研究活细胞中的代谢生物标志物，如 NADPH 和 FAD，同时已开发出多种荧光纳米颗粒，可将此类测量与细胞和组织氧合成像进行多重联合分析。多细胞球形体、类器官以及器官芯片能够模拟复杂且类似体内微环境的条件，从而最大限度减少对动物实验的需求。在类球体的制备方面，我们展示了多种形成方法，其通量范围可从低通量到高通量。这些方法还突出了其良好的光学通透性、与荧光寿命成像显微镜的兼容性，以及可包含细胞外基质组分的可能性。因此，尽管三维体外模型相较于二维培养能提供更接近生理的环境，但其高度变异性、低重复性以及实验报告不完整等问题仍然存在。类球体大小、营养成分、细胞外黏度甚至类球体形成方法等参数均可能导致细胞异质性增加。本实验方案旨在统一和标准化类球体的制备方法，重点阐述利用荧光寿命成像显微镜（FLIM）对类球体进行生命持续性及多参数分析时的关键环节。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

多细胞球体的生产和多参数活细胞荧光寿命成像显微镜 （FLIM）

荧光寿命成像（FLIM）已成为一种关键技术，用于成像活细胞中特定蛋白质和染料的环境及其相互作用。利用荧光分子转子的FLIM可实现对活细胞内黏度的成像图谱绘制。...

活细胞中分子转子的荧光寿命成像

本文介绍了一种球形体成像装置的制备方案。该装置可实现对癌细胞球形体的动态或长期荧光成像。本方案还提供了一种简单的图像处理流程，用于分析癌细胞的侵袭行为。...

三维球体模型中癌细胞侵袭的实时荧光成像与分析

本方案描述了利用标准荧光显微镜对球状体的氧合状态和细胞死亡进行多参数分析，从而实现用于生物打印的高通量球状体制备。该方法可用于控制球状体的活力并实现标准化，这对于构建三维组织、肿瘤微环境以及成功进行（微）组织生物制造具有重要意义。...

低成本氧气显微镜辅助的多细胞球体生物制造

本文描述了一种在显微镜腔室中构建黏附性梯度和可溶性梯度的方法，用于活细胞迁移研究。该人工构建的环境结合了抗污表面与黏附轨迹以及溶液梯度，从而可确定不同导向信号之间的相对重要性。...

创建黏附性与可溶性梯度以荧光显微镜成像细胞迁移

本方案描述了如何利用全内反射荧光显微镜观察和追踪活细胞表面的单个受体，从而分析受体的侧向流动性、受体复合物的大小，以及可视化瞬时的受体-受体相互作用。该方案可拓展应用于其他膜蛋白。...

高分辨率时空分析受体动力学的单分子荧光显微技术

质膜蛋白和脂质的空间分布与时间动态是生物学中的热点问题。本文通过时空图像涨落分析来探讨这一问题，该方法在概念上可提供与单粒子追踪相同的物理量，但使用小分子标记物和常规显微镜装置即可实现。...

从快速荧光成像到商用显微镜下活细胞膜上的分子扩散规律研究

本研究开发了一种新型成像方案，采用定制的电机驱动机械执行器，可实现对活细胞在机械应变下的实时响应进行测量。该系统适用于力学生物学研究，能够施加高达20%的应变，同时支持使用共聚焦显微镜或原子力显微镜进行近实时成像。...

活细胞成像在机械拉伸过程中的应用

将介绍一种先进的显微镜，该显微镜能够对分离的质膜及其周围的细胞内体积进行快速且高分辨率的成像。将转盘共聚焦显微技术与全内反射荧光显微技术集成于同一系统，可实现高达每3.5秒获取一幅图像堆栈的高速活细胞成像实验。...

利用先进的转盘-全内反射荧光显微镜技术可视化细胞中的黏附形成

我们介绍一种由电机驱动的离心式微流控装置，可用于培养细胞球体。利用该装置，可在高重力条件下轻松共培养单一或多种细胞类型的球体。...

基于CD的实验室平台用于生成多细胞三维球体

本方法涉及在允许活细胞共聚焦显微镜观察的同时，对嵌入硅橡胶中的三维软水凝胶进行单轴拉伸。文中展示了对外部和内部水凝胶应变以及纤维取向的表征。所开发的装置与实验方案可用于评估细胞对不同应变条件的响应。...

活体显微成像下三维水凝胶的可控应变

了解多细胞球体制备方法，结合荧光寿命成像显微镜（FLIM）技术进行活细胞代谢分析。本方案展示三维细胞培养模型中细胞代谢与氧分布的多参数成像技术，为减少动物实验提供标准化方法。

多细胞球体的制备及多参数活细胞荧光寿命成像显微镜（FLIM）分析

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