Name: 从白蛉提取内分泌物的方法 Bemisia tabaci (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: 学习从烟粉虱Bemisia tabaci体内提取内共生菌的方法，通过解剖和过滤技术分离细菌，用于DNA扩增和测序分析。该方案适用于昆虫学、微生物学及共生关系研究，也可推广至蚜虫、蓟马等其他昆虫的内共生菌提取。

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本研究得到了国家重点研发计划（2016YFC1200601）和国家自然科学基金（31390421）的资助。

1. 烟粉虱的饲养与隐存种鉴定
<ol>
	<li>在标准条件下，将烟粉虱物种饲养于棉属植物 Gossypium hirsutum（锦葵科）（品种 Zhe-Mian 1973）上，饲养环境为网笼，温度 27 ± 1 °C，相对湿度 70 ± 10%，光周期为 14 小时光照 : 10 小时黑暗。</li>
	<li>取单只成虫烟粉虱，加入 30 µL 裂解缓冲液（10 mM Tris，pH 8.4，50 mM KCl，0.45% [wt/vol] Tween-20，0.2% [wt/vol] 明胶，0.45% [vol/vol] Nonidet P 40，60 g/mL 蛋白酶 K）进行匀浆处理。</li>
	<li>将匀浆液于 65 °C 孵育 1 小时，随后于 100 °C 孵育 10 分钟。 
	注意：如有需要，可适当延长 65 °C 的孵育时间。100 °C 的孵育时间需严格控制，以充分灭活蛋白酶 K 并避免 DNA 损伤。</li>
	<li>使用烟粉虱 DNA（来自步骤 1.3）进行聚合酶链式反应（PCR），引物基于线粒体细胞色素氧化酶 I 基因设计。 
	COI-F: 5'-TTGATTTTTTGGTCATCCAGAAGT-3' 
	COI-R: 5'-TAATATGGCAGATTAGTGCATTGGA-3'
	<ol>
		<li>PCR 反应在总体积 25 µL 体系中进行，包含 1 U Taq DNA 聚合酶、2.5 µL 10x Buffer、0.2 mM dNTP、每种引物各 0.2 mM 以及 2 µL 烟粉虱 DNA。</li>
		<li>PCR 程序如下：95 °C 预变性 3 分钟；随后进行 35 个循环，每个循环包括 95 °C 变性 45 秒、50 °C 退火 45 秒、72 °C 延伸 1 分钟；最后在 72 °C 再延伸 10 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 DNA 凝胶回收试剂盒，按照推荐的操作流程对 PCR 扩增产物进行纯化。</li>
	<li>按照制造商说明书，使用 DNA 测序系统对纯化后的 DNA 样品进行测序。</li>
	<li>利用基本局部比对搜索工具（BLAST）分析测序结果，以鉴定烟粉虱的隐存种，并排除其他物种的污染。</li>
</ol>
2. 内共生体的鉴定与定位
<ol>
	<li>对烟粉虱DNA（步骤1.3中获得）进行PCR扩增，以扩增烟粉虱体内每种内共生菌的特异性基因（PCR反应体系见第1.4节，PCR程序及引物列于 表1).</li>
	<li>将扩增后的样品按照先前发表的方案进行琼脂糖凝胶电泳20 （1% 琼脂糖凝胶，以 Tris-乙酸-EDTA 作为电泳缓冲液，电压 5 V/cm）以鉴定每种细菌的特异性基因。</li>
	<li>回收并测序每条条带，以确定烟粉虱体内的细菌种类（参见第1.5–1.7节）。</li>
	<li>进行荧光检测 原位 根据已发表的方案，对粉虱进行荧光原位杂交（FISH）以确定内共生菌的位置19. 
	注意：如有必要，可增加荧光探针的浓度。</li>
</ol>
3. 透射电子显微镜（TEM）
<ol>
	<li>将粉虱浸入含有2.5%（体积分数）戊二醛的磷酸盐缓冲液（0.1 M，pH 7.0）中固定4小时。</li>
	<li>用磷酸盐缓冲液（0.1 M，pH 7.0）洗涤样品三次，每次15分钟。</li>
	<li>将样品再次浸入含有1%（wt/vol）OsO₄的磷酸盐缓冲液（0.1 M，pH 7.0）中进行固定4 2小时。</li>
	<li>使用梯度浓度乙醇（30%、50%、70%、80%、90%、95% 和 100%）对样品进行脱水，每次15分钟。</li>
	<li>将样品转移并浸入100%丙酮中20分钟。</li>
	<li>将样品置于100%丙酮与100% Spurr树脂（1:1）混合液中，室温下处理1小时。</li>
	<li>将样品转移至室温下由100%丙酮与100% Spurr树脂按1:3比例配制的混合液中，孵育3小时。</li>
	<li>将样品转移并浸入100% Spurr树脂（于70 °C孵育）中，持续超过9小时。</li>
	<li>使用切片机对粉虱样品进行切片。</li>
	<li>将超薄切片（第3.9节获得）浸入醋酸铀酰饱和溶液中染色5-10分钟，随后浸入50%碱性柠檬酸铅溶液中再染色5-10分钟。 
	注意：第3.1–3.10节中所用试剂的体积取决于样品。请确保样品完全浸没在试剂中。</li>
	<li>在透射电子显微镜下（15,000×）观察样品，以确定细菌的定位、形态和大小，供后续使用（参见第4.6节）。</li>
</ol>
4. 粉虱共生体组织的解剖与纯化
<ol>
	<li>在载玻片上加入 100 µL 的 1x PBS 溶液。从棉叶上挑选一些 3rd 或 4th 龄若虫，并将其浸入 PBS 溶液中。</li>
	<li>在体视显微镜下使用精细的昆虫学针，将共生菌体从烟粉虱体内取出。
	<ol>
		<li>在若虫一侧轻轻切开一个小孔，然后轻压另一侧，使共生菌体排出。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将 20 µL 微量移液吸头（前端剪裁至与共生菌体大小匹配）安装到 0.5–10 µL 移液器上。将单个共生菌体从 PBS 溶液中吸取至微量移液吸头中。</li>
	<li>通过将共生菌体反复移入 PBS 溶液并重新吸出的方式清洗共生菌体，以去除其他烟粉虱组织的污染。重复三次。</li>
	<li>立即将清洗后的共生菌体移入含有 60 µL 1x PBS 溶液的离心管中。</li>
	<li>使用注射器将收集的共生菌体通过 5 µm 滤膜过滤（滤膜孔径根据烟粉虱共生细胞中细菌和细胞核的大小确定）。重复多次，确保混合液充分通过滤膜。 
	注意：为了获得更好的扩增和测序结果，应收集超过 100 个共生菌体。为减少细菌在滤膜上的黏附损失，可先用 1x PBS 溶液润湿滤膜。</li>
</ol>
5. 内共生体基因组的扩增
<ol>
	<li>使用DNA扩增试剂盒，按照推荐方案并稍作修改，对滤液（主要含有烟粉虱的内共生菌）进行扩增。
	<ol>
		<li>选择从血液或细胞中扩增基因组DNA的推荐方案，并配制缓冲液D2用于后续实验。</li>
		<li>直接将1.5 µL滤液（见第4.6节）加入离心管中，随后加入1.5 µL缓冲液D2，并充分混匀。</li>
		<li>冰上孵育10分钟，然后加入1.5 µL终止液。</li>
		<li>加入15 µL反应缓冲液和1 µL DNA聚合酶，轻轻混匀。</li>
		<li>将混合物在30 °C孵育16小时，随后在65 °C孵育3分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用针对细菌设计的特异性引物，直接对扩增后的滤液进行PCR（如有必要可稀释扩增产物），以确认细菌种类（见第2.1节）。</li>
	<li>根据已发表的方法21，使用烟粉虱基因beta-Actin和EF1引物进行PCR，以检测是否存在宿主基因组污染（PCR配方见第1.4节）。</li>
</ol>
6. 内共生菌宏基因组测序
<ol>
	<li>在测序前，按照制造商说明书，将扩增后的滤液进行分光光度计和荧光计检测，以评估样品质量及是否符合测序标准。</li>
	<li>按照制造商说明书，将扩增产物送入基因组测序仪进行测序。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

由于烟粉虱体内的内共生菌无法进行培养 体外解剖并分离含菌细胞是获取足量内共生菌遗传物质的有效方法。在解剖前，应明确确认所涉及的粉虱种类及其内共生菌种类。粉虱 B. tabaci 是一个包含35种以上形态难以区分物种的复合种，不同的隐存种可能含有不同的内共生菌。 Portiera 以专性共生体的形式普遍存在22，且次级共生菌在不同物种间存在差异，甚至在单个烟粉虱个体中也有所不同17,21,23此外，尽管许多内共生菌已被证实局限于细菌细胞内，但有些内共生菌可能分布于烟粉虱整个体内24因此，在解剖菌体之前，有必要通过FISH和TEM分析不同内共生菌的定位。 
进行菌体解剖及后续任何操作时，所用材料必须严格无菌，以避免其他细菌可能造成的污染，尤其是PBS溶液...

与相对宿主形成密切共生关系的细菌在节肢动物中广泛存在1。内共生菌已被证实几乎在宿主的每一个发育阶段都会影响其营养代谢、繁殖以及对环境胁迫的响应等各个方面2,3,4 等5。然而，这些共生关系背后的机制在很大程度上仍不清楚。在研究细菌潜在功能和作用时，基因组学具有优先性和重要性。一些基本信息，例如分类地位、功能基因、代谢通路和分泌系统，均可从基因组序列中推断得出，从而揭示共生菌在共生关系中的潜在作用。随着高通量测序技术的发展，大量细菌基因组已被测序，并揭示了其多样的功能6。
内共生体在半翅目昆虫（如蚜虫）中具有至关重要的作用7，臭虫8，木虱9，褐飞虱10 和蝉11例如， Buchnera 在蚜虫中，作为专性共生菌，已证明其参与必需氨基酸的生物合成，且与蚜虫基因组中的基因共同发挥作用12此外，转录调控的 Buchnera 也得以揭示13在木虱中， Carsonella 测序并鉴定出迄今发现的最小细菌基因组14。所有这些内共生体的特征均基于基因组序列推断得出。由于这些内共生体无法培养 体外，已采用多种方法分离出适合测序的细菌。在蚜虫中，内共生菌通过离心和过滤提取，并进一步进行基因组和转录组分析5在褐飞虱中，内共生菌与整个昆虫基因组一同进行测序10.
烟粉虱 B. tabaci 是一个包含35种以上形态难以区分的物种（隐存种）的复合种，其中两种入侵性物种已扩散至全球，对农业生产造成了巨大危害15。值得注意的是，B. tabaci 物种体内的内共生菌在害虫的发育过程中显示出重要作用16。迄今为止，已在烟粉虱中鉴定出八种内共生菌，包括一种专性共生菌Candidatus Portiera aleyrodidarum，以及七种次级共生菌Hamiltonella、Rickettsia、Arsenophonus、Cardinium、Wolbachia、Fritschea 和 Hemipteriphilus17,18。
与之前描述的半翅目昆虫不同，粉虱 B. tabaci 是一种体长仅1毫米的极小型昆虫。大多数内共生菌局限于细菌细胞内19 （含有共生体的特化细胞，可进一步形成共生体组织） B. tabaci。此外，这些内共生菌无法进行培养 体外获得内共生体的唯一方法是从 B. tabaci 是解剖出共生菌体。然而，解剖过程存在困难。首先，脆弱的共生菌体总是与烟粉虱的其他组织相连，难以分离。其次，烟粉虱体型微小，限制了足量共生菌体的分离。第三，内共生菌在共生菌体内成簇分布，使得获取单一细菌物种极为困难。
本文报道了一种简单且低成本的方案，用于分离烟粉虱的内共生菌，以进行后续的宏基因组测序。通过解剖、纯化和扩增，可获得足够的内共生菌DNA，并确认细菌种类。所述方案也可类似地应用于其他节肢动物。

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;Taq&lt;/em&gt; DNA 聚合酶</td><td>Takara</td><td>R001A</td><td>包含 rTaq、10&amp;times;Buffer 和 dNTP</td></tr><tr><td>凝胶 DNA 回收试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>DNA 样本测序系统</td><td>ABI</td><td>ABI-3730XL</td><td></td></tr><tr><td>切片机</td><td>Leica</td><td>EM UC7</td><td></td></tr><tr><td>透射电子显微镜</td><td>Hitachi</td><td>H-7650 TEM</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000-C</td><td></td></tr><tr><td>20 &amp;mu;L 微量加样吸头</td><td>Eppendorf</td><td>F2771951</td><td></td></tr><tr><td>滤器 holder</td><td>Millipore</td><td>SX0001300</td><td></td></tr><tr><td>滤膜过滤器</td><td>Millipore</td><td>SMWP001300</td><td>5.0 &amp;mu;m SMWP</td></tr><tr><td>REPLI-g UltraFast Mini 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>150033</td><td>DNA 扩增试剂盒</td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 荧光计</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>基因组测序仪</td><td>Illumina</td><td>Hiseq 2000</td><td></td></tr></tbody></table>

从烟粉虱 bemisia tabaci 中提取内共生菌的方法

Methods for the Extraction of Endosymbionts from the Whitefly Bemisia tabaci

细菌共生体与其宿主形成密切关系，在大多数情况下可为宿主带来益处。基因组信息对于研究细菌共生体在其宿主中的功能与进化至关重要。由于大多数共生体无法培养 体外，分离出足量细菌用于基因组测序的方法至关重要。在烟粉虱中 Bemisia tabaci，已通过多种方法鉴定出多种内共生菌，并预测其在害虫的发育和繁殖过程中具有重要作用。然而，这些共生关系背后的机制在很大程度上仍不清楚。这一研究障碍部分源于粉虱体内的内共生菌大多局限于菌胞内，难以与宿主细胞分离。本文报道了一种从粉虱中鉴定、提取和纯化内共生菌的逐步实验方案 B. tabaci 主要通过解剖和过滤进行。采用该方法制备的内共生体样品，尽管仍为不同内共生体物种的混合物，但适用于后续基因组测序及内共生体可能功能的分析 B. tabaci该方法也可用于从其他昆虫中分离内共生菌。

中东-小亚细亚1型（MEAM1）物种的 B. tabaci 复合体在此作为描述示例。图中显示了用于饲养烟粉虱的棉花以及烟粉虱的多个发育阶段。 图1 包括一株棉花植株、成虫白粉虱和第1个st, 2nd 和 4th 粉虱的3龄若虫rd 4龄若虫的形态与之相似th 龄若虫）。显然，4th 龄若虫比1龄若虫大st 和 2nd 龄期若虫（图1）。FISH 分析 Portiera 和 Hamiltonella 在MEAM1中的情况如图所示 图2这两种内共生菌局限于粉虱的含菌细胞中，且可观察到两种细菌存在重叠分布的现象。 图3</strong...

本文介绍了一种通过解剖和过滤方法从烟粉虱Bemisia tabaci中分离内共生菌的实验方案。经过扩增后，所获得的DNA样本适用于后续对内共生菌与烟粉虱之间互惠关系的测序与研究。

从烟粉虱 Bemisia tabaci 中提取内共生菌的方法

细菌共生体与其宿主形成密切的关系，在大多数情况下会赋予宿主一定的优势。基因组信息对于……至关重要

本实验的总体目标是从微小昆虫中提取内共生菌，用于后续实验。该方法有助于回答昆虫学和宏观生物学领域的一些关键问题，因为大多数内共生菌无法在体外培养。该方法能够分离出足量的细菌用于后续实验，因此显得尤为重要。该技术的主要优势在于能够方便地分离烟粉虱的细菌内共生体。该方法也可应用于其他昆虫（如蚜虫、叶蝉和蓟马）内共生体的分离。首先，收集一只成年烟粉虱个体，并将其在30 µL裂解缓冲液中进行匀浆处理。将匀浆在 65 摄氏度孵育一小时，然后在 100 摄氏度孵育 10 分钟。使用烟粉虱 DNA 和线粒体细胞色素氧化酶 1 引物，按以下试剂配制 25 微升 PCR 反应体系。然后，使用此处所示的程序进行PCR反应。接着，按照推荐的方案使用DNA凝胶回收试剂盒纯化PCR产物。随后，根据文本方案进行序列分析。为了扩增烟粉虱体内每种内共生菌的特定基因，对烟粉虱DNA进行PCR扩增。根据已发表的实验方案，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳及测序，以确定烟粉虱体内的细菌种类，并鉴定每种细菌的特定基因。为解剖并纯化烟粉虱的菌体组织，向载玻片上加入100 µL的1×PBS溶液。然后，从棉叶上选取三龄或四龄若虫，并将其浸入PBS中。在显微镜下，使用精细的昆虫学针将虫体内的共生菌器官从烟粉虱体内取出。分离菌体时需小心操作，因其体积小且脆弱。在若虫一侧轻轻剪开一个小孔，从另一侧稍加按压以挤出菌体。随后，将20微升微量移液器装到0.5至10微升移液枪上，从PBS中吸取单个菌体至微量移液器中。通过将菌体组织用移液器转移至 PBS 中并进行提取，以去除其他粉虱组织的污染。重复洗涤三次。强烈建议重复洗涤，以尽可能去除更多污染。立即将洗涤后的共生菌体用移液器转移至含有60 µL PBS的离心管中。使用5 µm滤膜对组装好的共生菌体进行注射器过滤。重复过滤多次，以彻底使混合液体通过滤膜。为了扩增滤液，配制缓冲液 D2，用于血液或细胞基因组 DNA 扩增的推荐方案，并进行部分修改。直接将 1.5 µL 滤液加入离心管中，随后加入 1.5 µL 缓冲液 D2。充分混匀后，将样品置于冰上孵育 10 分钟。然后加入 1.5 µL 终止液。加入15微升反应缓冲液和1微升DNA聚合酶，轻轻混匀。将混合物在30摄氏度孵育16小时，随后在65摄氏度孵育3分钟。使用针对细菌设计的特异性引物，直接对扩增后的滤液进行PCR，以确认细菌种类。同时，根据已发表的方法，使用针对烟粉虱基因 beta-actin 和 EF1 的引物进行 PCR，以确认是否存在宿主基因组污染。最后，按照文本方案进行宏基因组测序。在本图中，展示了用于饲养烟粉虱的棉花以及烟粉虱的多个发育阶段。包括成虫及一龄、二龄和四龄若虫。此处展示了MEAM1四龄若虫体内共生菌Portiera和Hamiltonella的FISH分析结果。观察到两种细菌存在重叠定位，且均局限于粉虱的含菌细胞内。图中显示了粉虱体内共生菌 Portiera 的透射电子显微镜图像，表明 Portiera 可能已失去其细胞壁。在完成测序并去除接头序列和重复数据的污染后，获得了专性共生菌 Portiera 的完整基因组，其基因组为环状结构，共包含 358,232 个碱基对。此外，获得了汉密尔顿氏菌（Hamiltonella）的一个草图基因组，该基因组包含138个重叠群，根据成对末端关系组装为89个支架。一旦掌握该技术，若操作得当，可在20小时内完成。在进行该实验过程中，重要的是要注意防止环境细菌对样品造成污染。完成此操作后，可进一步进行其他分析，如RA测序和大规模细菌组分析，以回答有关内共生菌基因表达和代谢的更多问题。该技术建立后，为昆虫学和微生物学领域的研究人员探索昆虫或节肢动物体内内共生菌的功能铺平了道路。观看本视频后，您应能充分掌握如何从昆虫细菌体中提取共生菌。请注意，某些试剂的操作可能具有危险性，因此在进行本实验时，应始终采取佩戴手套等防护措施。

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生物学

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利用人工寄主从寄生蜂Trichogramma dendrolimi中提取毒液

学习从烟粉虱Bemisia tabaci体内提取内共生菌的方法，通过解剖和过滤技术分离细菌，用于DNA扩增和测序分析。该方案适用于昆虫学、微生物学及共生关系研究，也可推广至蚜虫、蓟马等其他昆虫的内共生菌提取。

从烟粉虱 Bemisia tabaci 中提取内共生菌的方法

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