从白蛉提取内分泌物的方法 Bemisia tabaci

该实验的总体目标是从微小昆虫中提取内共生体以进行进一步的实验。这种方法可以帮助回答昆虫学和宏观生物学观点中的关键问题，因为大多数内共生体不能在体外培养。方法表明分离出足够数量的细菌以进行进一步实验非常重要。

该技术的主要优点是我们可以方便地分离粉虱细菌内共生体。这也可以应用于从其他昆虫（如蚜虫、植物蝉和蓟马）中分离内共生体。首先，收集一只成年粉虱，并在 30 微升裂解缓冲液中匀浆。

将匀浆在 65 摄氏度下孵育 1 小时。然后 100 摄氏度 10 分钟。使用粉虱 DNA 和线粒体细胞色素氧化酶 1 引物，使用以下试剂制备 25 μL PCR 反应物。

然后，使用此处显示的程序运行 PCR 反应。接下来，按照推荐的方案使用 DNA 凝胶提取试剂盒清洁 PCR 产物。然后，根据文本协议进行序列分析。

为了扩增粉虱内每个内共生体的特定基因，请对粉虱 DNA 进行 PCR。根据先前发表的方案，对扩增的样品进行琼脂糖凝胶电泳和测序，以确定粉虱内的细菌种类并鉴定每种细菌的特异性基因。为了解剖和纯化粉虱细菌组，将 100 微升 1x PBS 溶液添加到显微镜载玻片上。

然后，从棉叶中采摘第三或第四龄若虫。并让他们沉浸在 PBS 中。在显微镜下，用细昆虫针将细菌组从粉虱体内拉出。

分离细菌组时要小心，因为它小而脆弱。轻轻地在若虫的一侧切一个孔，轻轻按压另一侧以释放细菌组。然后，将 20 微升微量加载器安装到 0.5 至 10 微升移液器上，并将 PBS 中的单个细菌组提取到微量加载器中。

通过将细菌组移入 PBS 并提取来清洗细菌组以消除其他粉虱组织的污染。重复洗涤 3 次。强烈建议重复洗涤以尽可能多地消除污染。

立即将洗涤后的细菌组移液到含有 60 微升 PBS 的离心管中。注射器过滤组装好的细菌组，通过 5 微米的滤膜。重复多次过滤，使混合液体彻底穿过膜。

为了扩增滤液，制备缓冲液 D2，以与推荐的方案一起使用，用于从血液或细胞中扩增基因组 DNA，并进行一些修饰。直接向离心管中加入 1.5 μL 滤液，然后加入 1.5 μL 缓冲液 D2。充分混合并将样品在冰上孵育 10 分钟。然后加入 1.5 微升终止液。

加入 15 μL 反应缓冲液和 1 μL DNA 聚合酶，轻轻混合。将混合物在 30 摄氏度下孵育 16 小时，然后在 65 摄氏度下孵育 3 分钟。使用专为细菌设计的特异性引物直接在扩增的滤液上进行 PCR，以确认细菌种类。

根据先前发表的方法，还通过使用粉虱基因 β-肌动蛋白和 EF1 的引物进行 PCR 以确认是否存在来自宿主基因组的污染。最后，根据文本协议进行元基因组测序。在此图中，显示了用于饲养粉虱的棉花和粉虱的几个发育阶段。

包括成虫和第一、第二和第四龄若虫。此处显示了 MEAM1 第四龄若虫内内共生体 Portiera 和 Hamiltonella 的 FISH 分析。观察到两种细菌重叠，并且都局限于粉虱的细菌细胞。

这里显示的是粉虱的 Portiera 内共生体的透射电子显微镜图像，表明 Portiera 可能失去了细胞壁。在对接头和重复的污染数据进行测序和清理后，获得了专性共生体 Portiera 的完整基因组。产生 358、232 个碱基对的环基因组。

此外，还获得了 Hamiltonella 的基因组草案，其中包括 138 个重叠群，这些重叠群根据配对末端关系组装成 89 个支架。一旦掌握了这项技术，如果执行得当，可以在 20 小时内完成。在尝试此过程时，请务必记住让样品免受环境细菌的污染。

按照此程序，可以进行其他分析，如 RA 序列和质量细菌组，以回答其他问题，如内共生基因表达和代谢。该技术发展后，为昆虫学和微生物学领域的研究人员探索昆虫或节肢动物体内共生体的功能铺平了道路。看完这个视频，你应该对如何从昆虫细菌组中提取共生体有了很好的了解。

不要忘记，使用某些试剂可能很危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如戴手套。