Name: 基于同位素示踪实验结合的工作流研究多营养源的微生物代谢 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-22T13:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 47 s
Description: 了解利用同位素示踪实验定量研究微生物多营养源代谢的方法。该技术可追踪消耗营养物质的命运及合成化合物的代谢来源，适用于酵母及其他微生物的代谢研究。

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感谢 Jean-Roch Mouret、Sylvie Dequin 和 Jean-Marie Sabalyrolles 为机器人辅助发酵系统的构思所做出的贡献，感谢 Martine Pradal、Nicolas Bouvier 和 Pascale Brial 提供的技术支持。本项目经费由法国国民教育部、研究与技术部提供。

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作者无任何利益冲突需要披露。

利用同位素示踪实验量化化合物在代谢网络中的分布是理解微生物代谢运行机制的一种有前景的方法。尽管该方法已成功应用于一种或两种标记底物的研究，但目前尚无法通过多种元素同位素标记来研究不同来源物质的代谢即，超过两种底物）。事实上，现有的分析技术仅在使用单一元素的同位素标记时，或可能在双元素共标记时，才能准确定量测定蛋白质源性氨基酸及其他分子的标记模式。因此，为了克服这些限制并评估微生物对多种营养源的利用情况，我们选择在相同环境条件下重复进行一系列培养实验，每次实验中仅对选定的一种底物进行同位素标记 13C 或 15氮同位素。随后，进一步结合每种方法所提供的特异性信息 13C 或 15氮示踪实验为多种来源的代谢提供了定量的扩展视角。
所报道方法的成功依赖于在标准条件下进行可重复的一系列培养，以及从处于相同生理状态的细胞群体中采集样本，该状态对所有培养物均一致（细胞生长、底物消耗， 等等。）。这些条件必须得到满足，以便将来自独立实验的数据合并并进行联合分析。满足这些约束...

了解微生物代谢的运行机制对于设计高效策略以优化发酵工艺并调控发酵产物的生成至关重要。过去二十年中，基因组学和功能基因组学的进步极大地拓展了人们对多种微生物代谢网络拓扑结构的认识。获取这些信息推动了旨在全面理解细胞功能的方法的发展1。这些方法通常依赖于对可测量参数的模型化解释。实验数据一方面包括代谢物的摄取和生成速率，另一方面则包括通过同位素示踪实验获得的细胞内定量信息。这些数据为推断特定代谢网络中不同代谢通路的体内活性提供了关键依据2,3,4。目前，现有的分析技术仅能在使用单元素同位素标记、或可能在双同位素共标记的情况下，准确检测分子的标记模式。此外，在大多数生长条件下，碳源通常仅由一种或两种化合物组成。因此，基于碳底物的13C同位素示踪方法已被广泛而成功地应用于全面解析碳代谢网络的运行机制5,6,7,8。
相比之下，在许多自然和工业环境中，支持微生物生长的可利用氮源通常由多种分子组成。例如，在葡萄酒或啤酒发酵过程中，氮以18种氨基酸和铵盐的混合物形式提供，且浓度各不相同9。这种可用于生物合成的氮化合物组合使得这些复杂培养条件与生理学研究中常用的条件大不相同，因为后者通常仅使用单一氮源，一般是铵盐。
总体而言，细胞内化的氮化合物可直接掺入蛋白质中，或被分解代谢。包括酵母Saccharomyces cerevisiae在内的许多微生物，其氮代谢网络结构极为复杂，这与底物的多样性相适应。从示意图上看，该系统基于氮代谢核心中心的整合，该核心催化谷氨酰胺、谷氨酸和α-酮戊二酸之间的相互转化10,11，并联合转氨酶和脱氨酶共同作用。通过该网络，来自铵离子或其他氨基酸的氨基被收集，同时释放出α-酮酸。这些中间产物也通过中心碳代谢（CCM）12,13合成。大量分支反应和中间产物既参与外源性氮源的分解代谢，也参与蛋白质氨基酸的合成代谢，从而满足细胞的合成需求。这些相互关联的代谢通路的活性还会导致代谢物的外排。特别是，α-酮酸可通过Ehrlich途径被重新定向，生成高级醇及其乙酸酯衍生物14，这些物质是产品感官特征的重要贡献者。因此，氮代谢的运行方式在生物量生成和挥发性分子（香气）的形成中起着关键作用。
氮代谢中涉及的反应、酶和基因在文献中已有广泛描述。然而，多种氮源在代谢网络中的分配问题至今尚未得到解决。这一信息缺失主要有两个原因：首先，考虑到氮代谢网络具有高度复杂性，要全面理解其运行机制需要大量的定量数据，而这些数据直到目前才得以获得；其次，许多实验限制以及分析方法的局限性阻碍了先前用于阐明碳浓缩机制（CCM）功能的研究方法的应用。
为解决这些问题，我们选择开发一种基于同位素示踪实验系列数据整合的系统级方法。该工作流程包括： 
- 在相同环境条件下进行一系列发酵实验，每次标记不同的选定营养源（底物）； 
- 结合多种分析方法（高效液相色谱、气相色谱-质谱联用），在发酵的不同阶段精确测定标记底物的残余浓度，以及由标记分子分解代谢产生的化合物（包括衍生的生物量）的浓度和同位素富集度； 
- 对每种消耗的标记分子进行质量与同位素平衡计算，并对数据集进行进一步整合分析，通过确定通量比值，获得微生物对多种营养源利用情况的全局性概述。
应用该方法时，必须注意菌株/微生物在不同培养之间的可重复行为。此外，应于不同培养过程中相同的明确定义的发酵阶段取样。在本论文所报告的实验工作中，采用机器人辅助系统对发酵过程进行在线监测，以满足这些要求。
此外，选择一组合适的标记底物（包括化合物种类、标记性质及标记位置）对于解决研究中的科学问题至关重要。本研究中选择了15N标记的铵盐、谷氨酰胺和精氨酸，因为它们是葡萄汁中三种主要的氮源。这使得我们能够评估氮素从被消耗的化合物重新分配到蛋白质氨基酸中的模式。我们还旨在探究被消耗氨基酸的碳骨架的去向及其对挥发性分子生成的贡献。为实现这一目标，研究中加入了均匀13C标记的亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸和缬氨酸，这些氨基酸来源于Ehrlich途径中的主要中间产物。
总体而言，我们定量研究了酵母在发酵过程中如何通过重新分配外源性氮源以满足其生物合成需求，从而应对复杂的氮资源，同时将过量的碳前体以挥发性分子形式排出。本文报道的实验方法可应用于研究其他微生物利用多种营养源的情况。该方法似乎是分析遗传背景或环境条件对微生物代谢行为影响的合适途径。

<table><tbody><tr><td>D-葡萄糖</td><td>PanReac</td><td>141341.0416</td><td></td></tr><tr><td>D-果糖</td><td>PanReac</td><td>142728.0416</td><td></td></tr><tr><td>DL-苹果酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M0875</td><td></td></tr><tr><td>一水柠檬酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7129</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5379</td><td></td></tr><tr><td>硫酸钾</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0772</td><td></td></tr><tr><td>七水硫酸镁</td><td>Sigma Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>二水氯化钙</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>氯化铵</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4514</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71690</td><td></td></tr><tr><td>一水硫酸锰</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7634</td><td></td></tr><tr><td>七水硫酸锌</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z4750</td><td></td></tr><tr><td>五水硫酸铜(II)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7631</td><td></td></tr><tr><td>碘化钾</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4286</td><td></td></tr><tr><td>六水氯化钴(II)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3169</td><td></td></tr><tr><td>硼酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B7660</td><td></td></tr><tr><td>七钼酸铵</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7302</td><td></td></tr><tr><td>肌醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I5125</td><td></td></tr><tr><td>泛酸钙半钙盐</td><td>Sigma Aldrich</td><td>21210</td><td></td></tr><tr><td>盐酸硫胺素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4625</td><td></td></tr><tr><td>烟酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N4126</td><td></td></tr><tr><td>吡哆醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5669</td><td></td></tr><tr><td>生物素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B4501</td><td></td></tr><tr><td>麦角&amp;eacute;醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6510</td><td></td></tr><tr><td>吐温80</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1754</td><td></td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>VWR Chemicals</td><td>101074F</td><td></td></tr><tr><td>六水三氯化铁</td><td>Sigma Aldrich</td><td>236489</td><td></td></tr><tr><td>L-天冬氨酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9256</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1251</td><td></td></tr><tr><td>L-丙氨酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7627</td><td></td></tr><tr><td>L-精氨酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5006</td><td></td></tr><tr><td>L-半胱氨酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G3126</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>L-组氨酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8000</td><td></td></tr><tr><td>L-异亮氨酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I2752</td><td></td></tr><tr><td>L-亮氨酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L8000</td><td></td></tr><tr><td>L-赖氨酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L5501</td><td></td></tr><tr><td>L-甲硫氨酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9625</td><td></td></tr><tr><td>L-苯丙氨酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2126</td><td></td></tr><tr><td>L-脯氨酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0380</td><td></td></tr><tr><td>L-丝氨酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S4500</td><td></td></tr><tr><td>L-苏氨酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8625</td><td></td></tr><tr><td>L-色氨酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T0254</td><td></td></tr><tr><td>L-酪氨酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3754</td><td></td></tr><tr><td>L-缬氨酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V0500</td><td></td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C5-L-缬氨酸</td><td>Eurisotop</td><td>CLM-2249-H-0.25</td><td></td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C6-L-亮氨酸</td><td>Eurisotop</td><td>CLM-2262-H-0.25</td><td></td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;N-氯化铵</td><td>Eurisotop</td><td>NLM-467-1</td><td></td></tr><tr><td>ALPHA-&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;N-L-谷氨酰胺</td><td>Eurisotop</td><td>NLM-1016-1</td><td></td></tr><tr><td>U-&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;N4-L-精氨酸</td><td>Eurisotop</td><td>NLM-396-PK</td><td></td></tr><tr><td>乙酸乙酯</td><td>Sigma Aldrich</td><td>270989</td><td></td></tr><tr><td>丙酸乙酯</td><td>Sigma Aldrich</td><td>112305</td><td></td></tr><tr><td>2-甲基丙酸乙酯</td><td>Sigma Aldrich</td><td>246085</td><td></td></tr><tr><td>丁酸乙酯</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E15701</td><td></td></tr><tr><td>2-甲基丁酸乙酯</td><td>Sigma Aldrich</td><td>306886</td><td></td></tr><tr><td>3-甲基丁酸乙酯</td><td>Sigma Aldrich</td><td>8.08541.0250</td><td></td></tr><tr><td>己酸乙酯</td><td>Sigma Aldrich</td><td>148962</td><td></td></tr><tr><td>辛酸乙酯</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W244910</td><td></td></tr><tr><td>癸酸乙酯</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W243205</td><td></td></tr><tr><td>十二酸乙酯</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W244112</td><td></td></tr><tr><td>乳酸乙酯</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W244015</td><td></td></tr><tr><td>丁二酸二乙酯</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W237701</td><td></td></tr><tr><td>2-甲基丙基乙酸酯</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W217514</td><td></td></tr><tr><td>2-甲基丁基乙酸酯</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W364401</td><td></td></tr><tr><td>3-甲基丁基乙酸酯</td><td>Sigma Aldrich</td><td>287725</td><td></td></tr><tr><td>2-苯乙基乙酸酯</td><td>Sigma Aldrich</td><td>290580</td><td></td></tr><tr><td>2-甲基丙醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>294829</td><td></td></tr><tr><td>2-甲基丁醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>133051</td><td></td></tr><tr><td>3-甲基丁醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>309435</td><td></td></tr><tr><td>己醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>128570</td><td></td></tr><tr><td>2-苯乙醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>77861</td><td></td></tr><tr><td>丙酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>94425</td><td></td></tr><tr><td>丁酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>19215</td><td></td></tr><tr><td>2-甲基丙酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>58360</td><td></td></tr><tr><td>2-甲基丁酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>193070</td><td></td></tr><tr><td>3-甲基丁酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W310212</td><td></td></tr><tr><td>己酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>153745</td><td></td></tr><tr><td>辛酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W279900</td><td></td></tr><tr><td>癸酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W236403</td><td></td></tr><tr><td>十二酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L556</td><td></td></tr><tr><td>1L发酵罐</td><td>Legallais</td><td>AT1357</td><td>手工制作的发酵用发酵罐</td></tr><tr><td>一次性真空过滤系统</td><td>Dominique Deutscher</td><td>029311</td><td></td></tr><tr><td>发酵罐（250 ml）</td><td>Legallais</td><td>AT1352</td><td>手工制作的发酵用发酵罐</td></tr><tr><td>无菌管</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>发酵锁</td><td>Legallais</td><td>AT1356</td><td>手工制作的发酵用发酵锁</td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>蛋白胨</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>摇床培养箱</td><td>Infors HT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>颗粒计数器</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605697</td><td>Multisizer 3 Coulter计数器</td></tr><tr><td>离心机</td><td>Jouan</td><td></td><td>GR412</td></tr><tr><td>平板搬运机器人系统</td><td>Lab Services BV</td><td>PF0X-MA</td><td>自动化仪器</td></tr><tr><td>平板搬运机器人软件</td><td>Lab Services BV</td><td></td><td>机器人监控软件</td></tr><tr><td>RobView</td><td></td><td></td><td>自主研发的计算软件</td></tr><tr><td>My SQL</td><td></td><td></td><td>国际源数据库</td></tr><tr><td>Cimarec i Telesystem 多点搅拌器</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50088009</td><td>String Drive 60</td></tr><tr><td> BenchBlotter 平台摇床</td><td>Dutscher</td><td>60903</td><td></td></tr><tr><td>氨酶法检测试剂盒</td><td>R-Biopharm AG</td><td>5390</td><td></td></tr><tr><td>分光光度计比色皿</td><td>VWR</td><td>634-0678</td><td></td></tr><tr><td>分光光度计 UviLine 9400</td><td>Secomam</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氨基酸标准品 生理型 - 酸性及中性</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6407</td><td></td></tr><tr><td>氨基酸标准品 生理型 - 碱性</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6282</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸锂缓冲液 - 茚三酮显色剂</td><td>Biochrom</td><td>BC80-6000-06</td><td></td></tr><tr><td>磺基水杨酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2130</td><td></td></tr><tr><td>正亮氨酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N1398</td><td></td></tr><tr><td>Biochrom 30 AAA</td><td>Biochrom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EZChrom Elite</td><td>Biochrom</td><td></td><td>仪器控制与数据分析软件</td></tr><tr><td>Ultropac 8 树脂 锂型</td><td>Biochrom</td><td>BC80-6002-47</td><td>锂型高分辨率生理柱</td></tr><tr><td>滤膜 Millex GV</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGVX13NL</td><td>Millex GV 13mm（孔径 0.22 &amp;micro;m）</td></tr><tr><td>膜滤器 PALL</td><td>VWR</td><td>514-4157</td><td>Supor-450 47mm 0.45&amp;micro;m</td></tr><tr><td>真空泵 Millivac Mini</td><td>Millipore</td><td>XF5423050</td><td></td></tr><tr><td>铝制光滑称量皿 70mm</td><td>VWR</td><td>611-1380</td><td></td></tr><tr><td>精密天平</td><td>Mettler</td><td></td><td>规格 AE163</td></tr><tr><td>干燥二甲基亚砜</td><td>Merck</td><td>1029310161</td><td>（最大含水量 0.025% H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O）SeccoSolv</td></tr><tr><td>燃烧炉</td><td>Legallais</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA 蛋白检测试剂盒</td><td>Interchim</td><td>UP40840A</td><td></td></tr><tr><td>甲酸</td><td>Fluka</td><td>94318</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>37%发烟盐酸 Emsure</td><td>Merck</td><td>1003171000</td><td>ACS、ISO、Reag. Ph Eur 级</td></tr><tr><td>乙酸锂缓冲液</td><td>Biochrom</td><td>80-2038-10</td><td></td></tr><tr><td>市售水解氨基酸溶液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>AAS18</td><td></td></tr><tr><td>L-甲硫氨酸砜</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M0876</td><td></td></tr><tr><td>L-半胱氨酸酸一水合物</td><td>Sigma Aldrich</td><td>30170</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex 玻璃培养管</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z653586</td><td></td></tr><tr><td>吡啶</td><td>Acros Organics</td><td>131780500</td><td>99% 超纯</td></tr><tr><td>氯甲酸乙酯</td><td>Sigma Aldrich</td><td>23131</td><td></td></tr><tr><td>二氯甲烷</td><td>Sigma Aldrich</td><td>32222</td><td></td></tr><tr><td>样品瓶</td><td>Sigma Aldrich</td><td>854165</td><td></td></tr><tr><td>1.5ml 样品瓶用微型内插管</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SU860066</td><td></td></tr><tr><td>GC/MS</td><td>Agilent Technologies</td><td>5890 GC/5973 MS</td><td></td></tr><tr><td>Chemstation</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>仪器控制与数据分析软件</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34860</td><td>Chromasolv，用于 HPLC</td></tr><tr><td>乙腈</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34998</td><td>ChromasolvPlus，用于 HPLC</td></tr><tr><td>N,N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛</td><td>Sigma Aldrich</td><td>394963</td><td></td></tr><tr><td>BSTFA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>33024</td><td></td></tr><tr><td>DB-17MS 柱</td><td>Agilent Technologies</td><td>122-4731</td><td>30m*0.25mm*0.15&amp;micro;m</td></tr><tr><td>无水硫酸钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>238597</td><td></td></tr><tr><td>工业级氮气</td><td>Air products</td><td>14629</td><td></td></tr><tr><td>Zebron ZB-WAX 柱</td><td>Phenomenex</td><td>7HG-G007-11</td><td>30m*0.25mm*0.25&amp;micro;m</td></tr><tr><td>高纯氦气</td><td>Air products</td><td>26699</td><td></td></tr><tr><td>玻璃巴斯德吸管</td><td>VWR</td><td>612-1702</td><td></td></tr></tbody></table>

基于同位素示踪实验组合的工作流程以研究微生物对多种营养源的代谢

Workflow Based on the Combination of Isotopic Tracer Experiments to Investigate Microbial Metabolism of Multiple Nutrient Sources

微生物学领域的研究依赖于多种方法的实施。特别是，适当方法的开发对于深入了解在含有特定氮源和碳源的化学成分明确培养基中生长的微生物的代谢过程具有重要贡献。相比之下，尽管多种营养物质在自然或工业环境中广泛存在，但微生物对其代谢调控的研究仍几乎处于空白状态。这种情况主要是由于缺乏合适的方法学，从而阻碍了相关研究的开展。
我们报告了一种实验策略，可定量且全面地探究当营养物质以不同分子的混合物形式提供时，代谢如何运作。 即，一种复杂的资源。本文描述了其在评估多种氮源通过酵母代谢网络分配过程中的应用。该工作流程结合了在使用选定的稳定同位素示踪实验中获得的信息 13C- 或 15N标记的底物。该方法首先在相同培养基中进行平行且可重复的发酵，培养基包含多种含氮分子的混合物；但每次仅对选定的一种氮源进行标记。结合多种分析手段（HPLC、GC-MS），用于评估目标化合物的标记模式，并定量分析底物在其他代谢物中的消耗与回收情况。对完整数据集的整合分析可全面揭示细胞内消耗底物的去向。该方法需要精确的取样流程——通过机器人辅助系统实现发酵过程的在线监测——并完成大量耗时的分析工作。尽管存在这些限制，该方法首次实现了对多种氮源在酵母代谢网络中分配路径的解析。我们阐明了氮元素从较丰富的氮源向其他含氮化合物的再分配过程，并确定了挥发性分子及蛋白源性氨基酸的代谢来源。

图3展示了为研究酵母在葡萄酒发酵过程中对多种氮源的调控机制所采用的工作流程示意图。 
在不同取样时间点，生物学参数——包括生长特性、氮源消耗模式以及蛋白质源性氨基酸的分布特征——在多次发酵实验中表现出高度可重复性（图4）。这种一致性验证了基于14次独立发酵实验所产生数据整合分析方法的有效性。
图5 展示了氮素从葡萄汁中可利用的来源向所有蛋白质源性氨基酸重新分配的全面概览。该分析主要基于在存在条件下进行的实验所获得的结果 15含氮标记化合物。结合质量与同位素平衡的测定，对蛋白质源性氨基酸同位素富集度的测量首次量化了来源于精氨酸、谷氨酰胺、铵盐及其他前体的氮对这些化合物中各个氨基的贡献。此处强调的氮素显著再分配反映了其在代谢过程中的重要作用。 ...

本方案描述了一种用于定量且全面研究多种营养物质代谢的实验方法。该工作流程结合了同位素示踪实验与分析程序，可确定被消耗营养物质的去向以及微生物合成分子的代谢来源。

微生物学领域的研究依赖于多种方法的实施。特别是，建立适当的方法……

本实验的总体目标是利用标记底物定量研究多种营养物质的代谢过程。该工作流程可用于确定被消耗营养物质的去向以及酵母合成化合物的代谢来源。该方法有助于解答微生物代谢领域中的一些关键问题，例如在不同环境条件下整个代谢网络如何运行。该技术的主要优势在于能够阐明并量化来自多种来源的营养物质蛋白的分布情况。该方法曾被用于研究酵母的氮代谢，但也可应用于其他代谢过程及微生物。本实验成功的关键在于发酵过程的可重复性。用户必须特别注意收集处于相同定义生理阶段的细胞。演示该实验操作的人员包括本技术团队的 Christian Picou、实验室的博士研究生 Pauline Seguinot 以及博士后研究员 Stephanie Rollero。在高压灭菌锅中，将为每种氮源配制的合成培养基分别放入含磁力搅拌子的 1 升锥形瓶中进行灭菌处理。溶解适量的标记分子，使培养基中达到所需的最终浓度。使用一次性真空过滤系统对培养基进行灭菌。用无菌量筒将培养基均分至两个预先灭菌的发酵罐中，每个发酵罐内含磁力搅拌子，并配备发酵锁，以防止氧气进入，同时允许二氧化碳释放。在YPD培养基中培养酿酒酵母菌株后，于超净工作台中收集预培养物的等分试样，并使用配备100微米孔径的电子颗粒计数器对细胞数量进行定量。将预培养物离心后，将沉淀重悬于适量无菌水中，以获得每毫升2.5 × 10⁹个细胞的终浓度。随后，向每个发酵罐中接种1毫升细胞悬液。随后，通过将发酵罐安装在已正确放置于21孔搅拌板上的支撑导轨中，构建发酵平台，并将搅拌速率设定为270 RPM。为启动每条发酵过程的在线监测，运行机器人控制应用程序，点击“开始检测”按钮，并选择要进行的发酵体积。为确保显示界面能够指示平台上发酵罐的数量和位置，可右键单击槽位位置，选择“禁用”以关闭对空位的监测。初始化计算软件时，单击“Initializer”按钮，然后点击“OK”确认。接着，单击机器人控制应用程序中的“Start”按钮以开始重量采集。随后，取自发酵罐的两份六毫升样品在四摄氏度条件下以2,000 ×g离心五分钟。完成后，将每份冷冻上清液转移至两个离心管中，并于负80摄氏度保存。将每个沉淀物用5毫升蒸馏水洗涤两次，并于-80摄氏度保存，用于同位素富集度测定。向800微升样品中加入200微升含有2.5毫摩尔正亮氨酸（作为内标）的25%磺基水杨酸溶液，以去除高分子量分子。孵育并离心后，将混合物通过0.22微米孔径的硝酸纤维素膜过滤，然后将样品放入氨基酸分析系统中。在分析系统的程序或软件中，点击“运行”按钮，使用配备阳离子交换柱的分析仪开始液相色谱分析。接着，通过将先前制备的标记细胞沉淀悬浮于 200 微升过甲酸中，制备氧化提取物。在 4 摄氏度下孵育 4 小时后，加入 33.6 毫克硫酸钠以终止反应。向氧化后的提取物中加入800微升6摩尔/升的盐酸，在干燥烘箱中，于110摄氏度下将样品置于密封玻璃管中孵育16小时。待样品冷却至室温后，加入200微升2.5毫摩尔/升的内标物神经亮氨酸，并通入氮气流去除氯化氢气体。用800微升蒸馏水将干燥的提取物洗涤两次，然后再用800微升乙醇洗涤。 然后，向提取物中加入 800 微升 200 毫摩尔的醋酸锂缓冲液。使用先前所述的色谱方法测定样品中蛋白质内氨基酸的相对浓度。通过加入 1.2 毫升 6 摩尔的盐酸并将在干燥加热烘箱中、密闭玻璃管内于 105 摄氏度孵育 16 小时，对标记的细胞沉淀进行水解。待样品冷却至室温后，加入1.2毫升蒸馏水。离心去除细胞碎片后，将上清液分装至六个敞口玻璃试管中，每管400微升。将各管样品置于干热烘箱中，在105摄氏度下干燥四到五小时，直至其达到糖浆状稠度。在生物质水解过程中，通过频繁控制操作酸度，将组分干燥至糖浆状稠度。进行ECF衍生化时，将冷却后的干燥水解物溶解于200微升20毫摩尔盐酸和133微升吡啶与乙醇按1:4混合的溶液中。加入50微升氯甲酸乙酯以衍生化氨基酸。二氧化碳释放后，将混合物转移至含有500微升二氯甲烷的离心管中，以萃取衍生化化合物。涡旋振荡样品10秒。在10,000 ×g条件下离心4分钟后，用巴斯德吸管收集每个样品的下层有机相，并转移至含有锥形玻璃插件的气相色谱自动进样瓶中，以便每个样品可直接注入气相色谱-质谱联用仪（GCMS）中。高效液相色谱衍生化试剂用于ECF步骤。需频繁更换ECF试剂。进行DMF-DMA衍生化时，将干燥的水解产物溶解于50 µL甲醇和200 µL乙腈中。加入300微升DMF-DMA，涡旋混匀样品。然后将样品转移至含有锥形玻璃插件的GC自动进样瓶中。进行BSTFA衍生化时，将水解产物悬浮于200微升乙腈中。向样品中加入 200 微升 BSTFA，并将玻璃管密闭。在 135 摄氏度下孵育 4 小时后，将冷却的提取物直接转移至含有锥形玻璃插件的气相色谱自动进样瓶中。随后，使用配备自动进样器进样装置并与质谱仪联用的气相色谱仪分析样品。在计算机软件的菜单中点击“Instrument”。在“Sequence”选项卡下，点击“Edit Sample Log Table”以创建样品列表，然后点击“Run”和“Run Sequence”开始进样。分析完成后，记录每种氨基酸对应的各个质量同位素异构体的一组强度值。在15毫升玻璃管中加入10微升适当的氘代内标至5毫升上清液中。加入1毫升二氯甲烷， tightly 密封试管，并在摇摆平台上震荡样品20分钟。离心后，收集下层有机相至另一15毫升玻璃管中。重复二氯甲烷萃取后，用500毫克无水硫酸钠干燥有机萃取液，并用巴斯德吸管收集液相。在氮气流下将萃取液浓缩至原体积的四分之一。然后，将浓缩后的样品转移至气相色谱自动进样瓶中。进行气相色谱-质谱（GCMS）定量时，注入两微升样品，分流比为10:1，并采用适当的色谱柱升温程序分离提取的挥发性分子。根据文本方案中的电子表格，输入与胞外氨基酸浓度、细胞干重、细胞蛋白含量、挥发性分子浓度以及蛋白质源性氨基酸和挥发性分子同位素富集度相对应的原始数据。下图展示了研究酵母在葡萄酒发酵过程中如何调控多种氮源利用的工作流程示意图。在不同的取样时间点，各次发酵之间的生物学参数表现出高度的可重复性。此处展示了氮元素从葡萄汁中的来源向所有蛋白质氨基酸重新分配的总体情况。结合质量平衡的测定，对蛋白质氨基酸同位素富集度的测量首次实现了定量分析，明确了来源于精氨酸、谷氨酰胺、铵盐及其他氮源的氮对每种化合物中氨基基团的贡献程度。此处展示了消耗的氨基酸直接转化为生物量的比例比较。图中显示了脂肪族氨基酸亮氨酸和缬氨酸在酵母代谢网络中的分配情况。超过96%的消耗性缬氨酸和亮氨酸在其转化产物中得以回收。令人惊讶的是，尽管培养基中缬氨酸和亮氨酸的供应量与其在生物量中的含量存在显著不平衡，仍有相当一部分被分解代谢。掌握该技术后，可在五天内完成实验。在进行该操作时，重要的是要牢记根据科学问题仔细选择底物的标记部位。为确保良好的生物学重复性，应将发酵和色谱分析各进行两次。该技术建立后，为微生物学领域的研究人员探索微生物的代谢和生理特性如何随环境条件变化提供了途径。请注意，使用衍生化试剂和精氨酸溶剂时可能存在极高危险性，因此在操作过程中必须采取预防措施，例如佩戴手套并在通风橱内操作。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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