基于同位素示踪实验结合的工作流研究多营养源的微生物代谢
2018年1月22日
本议定书描述了一个实验过程, 定量和全面地研究多种营养来源的代谢。这一工作流程, 基于同位素示踪实验和分析程序的结合, 使被消耗的营养素的命运和由微生物综合的分子的新陈代谢的起源被确定。
该程序的总体目标是使用标记的底物定量研究多种营养来源的代谢。该工作流程可以确定所消耗营养物质的归宿和酵母合成化合物的代谢来源。这种方法可以帮助回答微生物代谢领域的关键问题，例如所有新陈代谢如何根据环境条件进行。
该技术的主要优点是它允许阐明和定量来自多个来源的营养分配蛋白质。该方法用于研究酵母的氮代谢，但也可以应用于其他代谢和微生物。该实验成功的关键在于发酵的可重复性。
用户必须特别注意收集处于相同定义生理阶段的细胞。演示该程序的将是来自我们技术人员的 Christian Picou、实验室的博士生 Pauline Seguinot 和博士后研究员 Stephanie Rollero。在高压釜中，在装有磁力搅拌棒的 1 升烧瓶中对为每个氮源制备的每种合成培养基进行巴氏杀菌。
溶解适量的标记分子，以在培养基中达到所需的最终浓度。使用一次性真空过滤系统对培养基进行消毒。使用无菌量筒，将培养基分装在两个预先消毒的发酵罐中，这两个发酵罐包含一个磁力搅拌棒，并配有发酵锁，以避免氧气进入，但允许释放二氧化碳。
在 YPD 培养基中培养酿酒酵母菌株后，在层流下收集预培养等分试样，并使用装有 100 微米孔径的电子粒子计数器定量细胞群。离心预培养物后，将沉淀悬浮在适当体积的无菌水中，以获得每毫升 2.5 乘以 10 至第 9 个细胞的最终浓度。然后，用 1 毫升细胞悬液接种每个发酵罐。
在此之后，通过将发酵罐安装在正确放置在 21 位搅拌板上的支撑导轨中来准备发酵平台，并将搅拌速率设置为 270 RPM。要开始对每次发酵进行在线监测，请启动机器人控制应用程序，单击 Start Assay 按钮并选择要进行的发酵体积。要确保显示的界面允许指示平台上发酵罐的数量和位置，请右键单击插槽位置并选择 Disable 以停用对空位置的监控。
要初始化计算软件，请单击 Initializer 按钮，然后单击 OK 进行验证。然后，单击机器人控制应用程序的 Start 按钮开始重量采集。接下来，将从发酵罐中取出的两个 6 毫升样品以 2， 000 倍 G 在 4 摄氏度下离心 5 分钟。完成后，将每个冷冻的上清液转移到两个试管中，并在零下 80 摄氏度下储存。
用 5 毫升蒸馏水洗涤每个沉淀两次，并储存在零下 80 摄氏度以测量同位素富集。向 800 μL 样品中加入 200 μL 含有 2.5 毫摩尔正亮氨酸作为内标的 25% 磺基水杨酸溶液，以去除高分子量分子。孵育和离心后，通过 0.22 微米孔径的硝酸纤维素膜过滤混合物，并将样品放入氨基酸分析系统中。
在分析系统的程序或软件中，单击按钮 运行 开始使用配备阳离子交换柱的分析仪进行液相色谱分析。接下来，通过将先前制备的标记细胞沉淀悬浮在 200 μL 过甲酸中来制备氧化提取物。在 4 摄氏度下孵育 4 小时后，加入 33.6 毫克硫酸钠终止反应。
向氧化提取物中加入 800 微升六正常盐酸，并将样品在密封玻璃管中于 110 摄氏度下在干热烘箱中孵育 16 小时。让样品冷却至室温后，加入 200 μL 2.5 毫摩尔神经亮氨酸，并用氮气流去除氯化氢气体。用 800 微升蒸馏水洗涤干燥的提取物两次，然后用 800 微升乙醇洗涤。
然后，向提取物中加入 800 微升 200 毫摩尔乙酸锂缓冲液。使用前面描述的色谱方法确定样品中蛋白质中氨基酸的相对浓度。加入 1.2 毫升 6 摩尔盐酸，将样品在 105 摄氏度下在干热烘箱中密闭玻璃管中孵育 16 小时，从而水解标记的细胞沉淀。
让样品冷却至室温后，加入 1.2 mL 蒸馏水。离心以去除细胞碎片后，将上清液分配到敞开玻璃管中的六个 400 微升馏分中。在 105 摄氏度的干热烘箱中干燥馏分 4 到 5 小时，直到它们达到糖浆的稠度。
在生物质水解过程中，通过经常控制作酸，将馏分干燥至糖浆稠度。对于 ECF 衍生化，将冷却的干燥水解物溶解在 200 μL 20 毫摩尔盐酸和 133 μL 吡啶和乙醇的 1 对 4 混合物中。加入 50 微升氯甲酸乙酯以衍生化氨基酸。
二氧化碳释放后，将混合物转移到含有 500 微升二氯甲烷的离心管中，以提取衍生化合物。涡旋样品 10 秒钟。以 10， 000 次 G 离心 4 分钟后，用巴斯德移液器收集每个样品的下层有机相，然后转移到包含锥形玻璃插件的 GC 自动进样器样品瓶中，以便将每个样品直接进样到 GCMS 仪器中。
HPLC 衍生化试剂用于 ECF 程序。经常更换 ECF 试剂。对于 DMF-DMA 衍生化，将干燥的水解物溶解在 50 μL 甲醇和 200 μL 乙腈中。
加入 300 微升 DMF-DMA 并涡旋样品。然后，将样品转移至包含锥形玻璃插件的 GC 自动进样器样品瓶中。对于 BSTFA 衍生化，将水解物悬浮在 200 μL 乙腈中。
向样品中加入 200 微升 BSTFA，并密封玻璃管。在 135 摄氏度下孵育 4 小时后，将冷却的提取物直接转移到包含锥形玻璃插件的 GC 自动进样器样品瓶中。现在，使用配备自动进样器进样器并与质谱仪耦合的气相色谱仪分析样品。
单击计算机软件菜单中的 Instrument。在 Sequence（序列）选项卡下，单击 Edit Sample Log Table（编辑样品日志表）以创建样品列表，然后单击 Run（运行）和 Run Sequence（运行序列）以开始进样。分析完成后，记录对应于其不同质量同位素体的每个氨基酸的强度簇。
将 10 μL 适当的氘代内标加入 15 mL 玻璃管中的 5 mL 上清液中。加入 1 毫升二氯甲烷，盖紧试管，在摇床上摇动样品 20 分钟。离心后，将下层有机相收集在 15 mL 玻璃管中。
重复二氯甲烷萃取后，干燥超过 500 毫克无水硫酸钠的有机提取物，并用巴斯德移液管收集液相。在氮通量下将提取物浓缩 4 倍。然后，将浓缩的样品转移到 GC 自动进样器样品瓶中。
对于 GCMS 定量，以 10：1 的分流比进样 2 μL 样品，并使用适当的柱温箱温度曲线分离提取的挥发性分子。使用文本方案中的电子表格，输入与细胞外氨基酸浓度、细胞干重、细胞蛋白质含量、挥发性分子浓度以及蛋白原性氨基酸和挥发性分子的同位素富集相对应的原始数据值。此处显示了研究葡萄酒发酵过程中发现的多种氮源的酵母管理的工作流程示意图。
对于不同的采样点，生物参数在受干扰物之间显示出很高的可重复性。这里显示了氮从葡萄汁来源重新分配到所有蛋白原氨基酸的概述。结合质量平衡的测定，蛋白质来源氨基酸同位素富集的测量首次定量了氮来源的精氨酸、谷氨酰胺、铵和其他来源对每种化合物的胺基的贡献。
这里描述了直接回收到生物质中的消耗氨基酸量之间的比较。这里显示了酵母代谢网络中消耗的脂肪族氨基酸、亮氨酸和缬氨酸的分配。超过 96% 的消费缬氨酸和亮氨酸在其转化产品中被回收。
令人惊讶的是，尽管这些化合物在培养基中的可用性与其在生物质中的含量之间存在相当大的不平衡，但很大一部分缬氨酸和亮氨酸被分解代谢。一旦掌握，这项技术可以在五天内完成。在尝试此程序时，重要的是要记住根据科学问题仔细选择底物的标记部分。
为确保良好的生物学重现性，请一式两份进行发酵和色谱分析。该技术发展后，为微生物学领域的研究人员探索微生物的新陈代谢和生理学如何根据环境条件而变化铺平了道路。不要忘记，使用衍生化试剂和精氨酸溶剂可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如戴手套和在通风橱下工作。
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概述
本协议描述了一种使用标记底物定量研究多种营养源代谢的方法。它允许确定消耗的营养物质的命运以及微生物合成的化合物的代谢来源。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物代谢
- 营养源调查
- 同位素示踪实验
背景
- 这种方法可以阐明代谢在不同环境条件下如何运作。
- 它已被应用于研究酵母的氮代谢。
- 该技术可以适用于各种微生物和代谢途径。
- 发酵的可重复性对成功结果至关重要。
研究目的
- 定量分析各种营养源的代谢。
- 确定合成化合物的代谢来源。
- 解决微生物代谢领域的关键问题。
使用的方法
- 同位素示踪实验
- 代谢分析的分析程序
- 营养物质分布的定量评估
- 可重复性的发酵技术
主要结果
- 成功阐明了多种来源的营养分布。
- 对酵母的氮代谢有了洞察。
- 对其他微生物和代谢研究的潜在应用。
- 实验方法的重复性得到了验证。
结论
- 这种方法为研究微生物代谢提供了一种全面的方法。
- 它可以适用于该领域的各种研究问题。
- 可重复性是获得可靠结果的关键。
常见问题
Executive Industry Relevance
Understanding how microorganisms partition multiple nutrient sources is critical for optimizing fermentation processes in biopharma production, where complex media formulations are common. This workflow enables quantitative mapping of nutrient fate, supporting mechanistic de-risking in strain development and media optimization. By revealing metabolic origins of key compounds, it enhances predictive confidence in microbial cell factory design.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of nutrient utilization pathways and metabolic flux distribution under defined conditions.
- Operational Value: Provides reproducible fermentation data to validate hypotheses about nutrient preference and metabolic routing.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative labeling patterns and mass balance data for assessing substrate consumption and product formation.
- Operational Value: Standardizes sample collection and analytical workflows via robot-assisted monitoring and HPLC/GC-MS integration.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports extrapolation from defined media to complex, industrial-like environments by elucidating nitrogen source partitioning.
- Operational Value: Facilitates cross-functional alignment through standardized isotopic enrichment measurements of amino acids and volatiles.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within early discovery to inform strain selection and media formulation, particularly when transitioning from lab-scale to industrial fermentation conditions.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing on how yeast redistributes nitrogen from abundant sources to synthesize proteinogenic amino acids and volatile molecules.
- Screening: Delivers reproducible extracellular amino acid, cell dry weight, and isotopic enrichment data for comparative condition analysis.
- Analytics: Provides mass isotopomer distributions and recovery rates (e.g., >96% of leucine/valine recovered) to quantify metabolic flux and partitioning.
- Translational Research: Links nutrient source utilization in defined media to physiological relevance in mixed-source environments like wine fermentation.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized platform for investigating nutrient metabolism across microbial strains and industrial substrates.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in nutrient allocation and clarifies metabolic origins of biomass components.
- Operational Value: Ensures reproducibility through parallel fermentations and robotic sampling, minimizing variability in longitudinal studies.
- Strategic Value: Informs media optimization and strain engineering by quantifying contributions of individual nutrient sources to final product titers.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of microbial chassis based on demonstrated nutrient utilization efficiency.
Implementation Considerations
- Requires expertise in isotopic tracer design, fermentation science, and mass spectrometry-based metabolomics.
- Depends on access to HPLC, GC-MS, and robotic sampling infrastructure for online monitoring and sample processing.
- Necessitates cross-team standardization of labeling protocols, quenching methods, and derivatization procedures for consistent data.
- Involves adaptation considerations when extending from yeast to other microorganisms with differing cell wall or metabolic traits.
- Limited by the labor-intensive nature of sample preparation and derivatization steps, despite automation in monitoring.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:23
Fermentation and Sampling
3:52
Quantification of Consumed Nitrogen Sources and Proteinogenic Amino Acids
5:38
Measurement of Isotopic Enrichment of Proteinogenic Amino Acids
8:53
Quantification and Isotopic Enrichment of Volatile Compounds and Calculations
10:21
Results: Investigation of Microbial Metabolism of Multiple Nutrient Sources
11:38
Conclusion
