通过成像质谱分析 研究 感染期间琼脂和组织中生长的细菌菌落的微生物合作

我们的协议能够可视化感染期间发生的微生物相互作用的空间代谢。我们已经开发了这种成像质谱工作流程，用于在琼脂和组织模型上生长的细菌共培养物。分析非传统底物（例如在琼脂上生长的细菌培养物）存在许多挑战。

使用我们的方案，可以适当干燥细菌标本，以促进MALDI基质在随后的成像质谱分析中的应用。该方法广泛适用于各种代谢物、微生物病原体或疾病，以及需要细胞或组织生化空间测量的样品类型，特别是在分析前需要脱水的样品类型时。制备细菌培养物大菌落后，从包装材料中去除安装在ITO涂层显微镜载玻片上的琼脂糖细菌菌落。

将样品放入装有干燥剂的干燥盒中，在室温下放置48至72小时。目视检查菌落在琼脂表面的变形。接下来，关闭样品室的真空管路，并打开旋片泵的电源开关，使真空泵预热并达到适当的真空压力。

打开可变电压变压器以加热缠绕在腔室周围的电线丝。调整可变电源，直到真空室的内部温度达到约50摄氏度。当泵预热时，将干冰和100%乙醇的浆液放入冷阱冷凝器中。

使用扳手打开真空室，松开 16 毫米双布法兰夹。将琼脂糖样品插入腔室，并用 16 毫米双布法兰夹紧密封腔室。然后打开泵阀排空腔室，让样品干燥 60 到 120 分钟。

完成后，通过关闭旋片泵上的阀门并打开真空法兰以接触环境空气，将真空室缓慢排放到环境压力。如前所述打开腔室，然后从腔室中取出干燥的琼脂糖样品。使用1，5-二氨基萘MALDI基质，有利于氨基酸的解吸和电离以及负离子模式。

将样品连接到喷雾器托盘上，并将准备好的溶液装入喷雾器管路。使用计算机软件，指定基质化合物均匀涂层的必要参数。监控喷洒顺序，直到完成。

从喷雾器托盘中取出样品，并将其储存在干燥柜中直至分析。将基质包被的样品插入MALDI靶板显微镜载玻片适配器中。使用永久性标记刻下至少三个包含样品区域的基准标记。

使用平板扫描仪获取显微镜载玻片的光学图像，包括基准标记。现在定义手稿中描述的质谱仪器方法。在负离子模式下，使用所选离子的连续积累方法从电荷质量数100到200中选择100道尔顿质量窗口进行气相信号富集，该方法包括目标代谢物的电荷质量值。

打开仪器的图像采集软件，使用设置向导定义文件名和位置、MS采集模式、要采样的感兴趣区域以及图像的空间分辨率。通过使用光学图像中的基准标记与仪器样品载体同步来示教样品。然后使用软件的感兴趣区域选择工具定义光学图像上的感兴趣区域。

定义完所有参数后，开始采集序列，在定义的感兴趣区域内连续采集每个像素的质谱。图像采集后，使用MIS文件扩展名保存数据，这是用于成像质谱平台的供应商特定文件格式。在flexImaging或SCiLS软件包中打开数据文件，或导出为非专有数据格式（如mzML），并使用供应商中立的软件进行可视化。

使用参考软件，定义目标峰的质量窗口，以生成采样区域中离子分布的假彩色热图。在平均质谱显示上，放大到感兴趣的峰，然后选择包含峰谱面积的适当质量数窗口。现在，右键单击突出显示的质量窗口，然后选择添加质量过滤器。

使用高分辨率精确质量数测量确定的可疑代谢物的暂定鉴定，通过电荷值标记所选质量数。选择强度阈值以调整假色热图显示的分析物图像的动态范围。进一步调整质量过滤参数，使质量窗口包含峰分布的面积，然后添加质量过滤器。

用100%乙醇冲洗所有冷冻切片设备，并在将样品放入低温恒温器室之前使其干燥。使用欧姆表准备ITO涂层的显微镜载玻片，以识别带有导电涂层的载玻片侧面。使用金刚石尖端的划线，蚀刻并标记显微镜载玻片的ITO涂层侧。

然后在研究冷冻切片机上进行冷冻切片。将OCT嵌入的小鼠ceca组织从80摄氏度的冰箱转移到干冰上的冷冻切片机室。在冷冻切片机室内，使用额外的OCT溶液将OCT包埋的组织安装在样品卡盘上。

OCT溶液凝固后，将卡盘固定在标本头上，并以10至50微米的增量开始冷冻切片，以达到器官的所需组织深度或平面。一旦达到组织的最佳横截面，就开始收集12微米厚的切片。使用艺术家画笔轻轻操作切片，然后将其放在涂有特氟龙涂层的显微镜载玻片上。

要从特氟龙包被的载玻片中取出组织，请将ITO包被的显微镜载玻片滚动到组织切片的顶部。通过将手掌压在ITO涂层载玻片的背面，将组织切片解冻到显微镜载玻片上。继续解冻，直到组织切片从半透明过渡到不透明或哑光纹理。

对于当天的分析，将干冰上的组织安装显微镜载玻片转移到装有干燥剂的干燥盒中储存。如前所述，执行 MALDI 基质应用和 MALDI 成像质谱。分析来自多个生物学重复的离子图像，并使用SCiLS统计软件通过强度箱形图比较来比较结果的显著性。

细菌培养样品的负离子模式MALDI分析可以检测数十种代谢物。高分辨率精确的质量数测量允许对鸟氨酸和精氨酸进行初步鉴定。图中显示了成像质谱分析的测量区域。

这些样品的成像质谱允许鸟氨酸和精氨酸氨基酸代谢物的空间映射，这些代谢物被发现在粪肠球菌存在下被改变和差异定位。使用苏木精和伊红染色观察感染小鼠盲肠杆菌的组织形态。显示了施用1，5-二氨基萘MALDI基质层后小鼠盲肠组织的光学图像。

鸟氨酸和精氨酸的 MALDI 离子图像在组织样品中显示出独特的空间分布。该方案最重要的考虑因素是保持细菌培养标本的温和干燥和处理，以尽量减少样品的鼓泡、开裂和其他变形。在成像质谱之后，可以对组织样品进行明场和荧光显微镜分析以评估组织形态。

这还可以使用基于抗体的成像方法对分子途径进行靶向验证。