Lens-free Video Microscopy for the Dynamic and Quantitative Analysis of Adherent Cell Culture

该方法的总体目标是通过无镜头视频显微镜获取和分析监测的大量贴壁细胞的动力学。因此，我们认为这项技术在生物学的许多领域都很有趣，可用于研究细胞增殖或细胞膀胱炎或药物筛选，或不同的生物过程监测。所以这种技术是无标签的，而且非常简单。

但它在研究大细胞群方面非常有效。当我们从细菌检测领域转向哺乳动物细胞成像领域时，这种方法的想法是什么。然后，生物学家需要将电路的延时采集直接放入培养箱中。

然后，我们构建了一台与培养箱兼容的定制无镜头视频显微镜，并开发了一种全息重建算法，以获得存在于非常大视野中的数千个细胞的图像。通过在室温下用纤连蛋白包被 6 孔玻璃底板 1 小时来开始此过程。1 小时后，去除多余的纤连蛋白，并用 PBS 冲洗 6 孔玻璃底板。

在该演示中使用在 DMEM 中生长的 Hela 细胞，加上谷氨酰胺培养基，在活化的胎牛血清中补充 10% 热量，以及 1% 青霉素和链霉素。每个培养板接种 2 万个细胞。使用玻璃底的容器很重要。

对于无镜头采集的质量。将培养板放入无镜头视频显微镜顶部的培养箱中。用于这种延时采集的无镜头视频显微镜是市售的。

它有一个金属氧化物半导体图像传感器，成像面积为 29.4 平方毫米，像素间距为 1.67 微米。多波长照明由位于 150 微米针孔上方、距离电池约 5 厘米的多芯片发光二极管器件提供。在开始延时采集之前，请务必检查盖板上是否有冷凝水。

因为冷凝会降低采集的图像质量。如果培养板盖上出现冷凝，请清洁盖板。使用市售的采集软件控制视频无镜头显微镜。

它同时执行延时采集和全息重建。在软件界面中输入所需的输入参数。将帧速率设置为每 10 分钟 1 次采集，将细胞培养类型设置为贴壁，并将实验持续时间设置为 3 天。

开始延时采集。此图像显示了一帧中 29.4 平方毫米区域上蓝色通道中原始采集的完整视野示例。图 B 是图 A 的细节，图 C 是图 B 的细节，全息重建算法会自动处理无晶状体采集，以获得细胞培养物的相位图像。

显示了阶段展开前的单元示例图像，后跟阶段展开后的图像。细胞追踪是使用 TrackMate 算法完成的，TrackMate 算法是一个开源的斐济插件，用于自动追踪单个颗粒。加载后，将完整的延时采集到斐济并按照文本协议中的描述配置算法，设置输入参数。

将估计的斑点直径设置为 15 像素，将检测器阈值设置为 0.25，将链接最大距离设置为 15 像素，将间隙闭合最大距离设置为 15 像素，并将轨迹中的光斑数设置为 3.5。细胞跟踪算法的第一步是检测无镜头采集中的细胞。显示了细胞跟踪算法的结果，所有细胞轨迹显示超过 50 帧，或大约 8 小时。

带有与中速相对应的颜色代码。底部面板是顶部面板中黄色矩形的详细图像。此处显示了细胞追踪的代表性视频剪辑。

在单元格跟踪过程结束时，选择 analysis 按钮以 3 个文本文件的形式生成结果。根据这些数据，使用专用算法进行细胞分割并检测细胞分裂，如文本协议和补充代码文件中所述。编译整个延时采集期间的所有单细胞测量值，生成多个指标随时间变化的散点图。

整个视野中的单元格总数在 2.7 天内从 2000 个增加到 15000 个。乘以时间点数，这会产生一个包含大量检测到的细胞的数据集。每个都以其坐标和形态特征为特征，例如干质量、面积、平均厚度、主要访问长度和纵横比。

细胞追踪和细胞分割算法的结合，可实现单细胞水平的动力学测量。此示例显示了持续约 66 小时的细胞轨迹分析，并在黄色圆圈中的时间点显示 4 次细胞分裂。计算了几个指标作为时间的函数：细胞表面积、干质量、平均厚度和细胞运动。

2.7 天观察的细胞周期持续时间分布接近 agouzian。平均 16.5 小时。自动测量的细胞周期长度与手动测量的细胞周期长度密切相关。

还检查了其他参数，例如细胞初始干质量、最终干质量和细胞周期期间的平均生长速率。掌握后，可以在几个小时内完成延时采集的完整数据分析，具体取决于 CPU 配置和硬件性能。在尝试此过程时，仔细计算初始细胞浓度非常重要。

如果初始细胞浓度太大，细胞轨迹算法将无法正确定义细胞轨迹。但是，如果细胞浓度太低，则完整分析的统计数据也将太低。按照此程序，可以执行自动化的细胞追踪分析，以回答以下领域的其他问题：生物学、基础生物学或趋化性。

这项新技术也为细胞谱系的监测铺平了道路，有望为研究细胞周期带来有趣的见解。观看本视频后，您应该对如何通过无镜头视频显微镜进行延时采集以及如何分析大量细胞有很好的了解。