Name: 无透镜视频显微术在黏附细胞培养动态定量分析中的研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: 学习使用无透镜视频显微术对贴壁细胞进行延时成像，以HeLa细胞为模型在培养箱内直接监测细胞周期动态。该方法可采集220万次测量数据并追踪超过一万条细胞周期轨迹，为细胞增殖和药物筛选研究提供高通量分析工具。

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作者无任何致谢事项。

1. 细胞培养监测采集
<ol>
	<li>在 DMEM + 谷氨酰胺中培养 HeLa 细胞例如，GlutaMAX）培养基，添加10%（v/v）热灭活胎牛血清和1%青霉素-链霉素。</li>
	<li>用纤连蛋白包被6孔玻璃底培养板（25 &#181;g/mL）中孵育 1 小时。然后接种 2 x 104 每孔细胞数</li>
	<li>在获取过程中，每3天更换一次培养基。</li>
	<li>对于延时成像采集，使用视频无透镜显微镜（可商业获得）。 
	注意：本方法基于 Ozcan 所描述的无透镜计算成像技术 等16 在受控温度的培养箱中进行连续监测的修改版本 37 &#176;C12,15采用互补金属氧化物半导体（CMOS）图像传感器，其像素间距为 1.67 &#181;m 成像区域为6.4 x 4.6 mm2. 多波长照明由多芯片发光二极管（LED）装置提供，可发出红、绿、蓝三色光。波长峰值分别位于636 nm、521 nm和452 nm，光谱带宽分别为25 nm、45 nm和25 nm。红-绿-蓝（RGB）LED位于上方 150 &#181;m 距离细胞约5 cm处的针孔。靠近LED处测得的光功率低至 10 &#181;W 在每个波长下，每次采集的光照时间仅为一秒钟。因此，在无透镜视频显微镜下观察细胞培养物时，不会出现光毒性问题。</li>
	<li>将细胞培养容器与CMOS传感器接触放置图1）。使用底部带有玻璃盖玻片的容器，这对无透镜成像的质量至关重要。也可使用塑料容器，但由于其光学质量较差，会导致无透镜成像质量下降。</li>
	<li>使用采集软件（商业可购）控制视频无透镜显微镜，该软件可同时进行延时采集和全息重建。用户需在软件界面中输入的参数包括：帧率、实验持续时间以及细胞培养类型，即贴壁细胞或悬浮细胞。</li>
	<li>设置采集软件的输入参数。将帧率设为每10分钟采集一次，并将细胞培养类型设为“贴壁”。 
	注意：每10分钟采集一帧的帧率是一个较优的选择，既能确保可靠的细胞追踪，又可使待分析的数据集大小保持在合理范围内。本无透镜显微成像系统可实现的最快帧率为每5分钟采集一帧。进一步提高帧率将导致CMOS传感器过度发热，可能影响培养细胞的存活率。</li>
	<li>启动延时成像采集，全息重建算法（商业可得）将自动处理无透镜采集的数据，以获得细胞培养的相位图像。该全息重建算法基于多波长相位恢复算法。17 并提供一个范围为 [- 的 RGB 重建相位图像&#960;, +&#960;] 对29.4 mm大视野范围内的每个单细胞2无透镜同轴全息成像的原理是：使用平面波（归一化后的振幅为1）照射一个薄样本（位于 z=0 处），并在样本后方一段较短距离 z=Z（通常为 1 mm）处的 CMOS 传感器上探测其衍射强度图像。在本实验装置中，照明光源依次切换至 3 个不同波长（&#955;1=0.450 &#181;m, &#955;2=0.540 &#181;m, &#955;3=0.647 &#181;m）以测量同一样品的三个衍射图样。</li>
</ol>
2. 细胞培养数据分析
<ol>
	<li>用于细胞追踪时，采用 Trackmate 算法，这是一种用于单颗粒自动追踪的开源 Fiji 插件18首先，将完整的时间序列图像导入 Fiji（使用“加载图像序列”命令）。由于数据集通常较大，包含约 400 帧 RGB 图像，每帧大小约为 29.7 Mb，因此以 8 位格式加载速度更快。接下来，使用 TrackMate Fiji 插件引导用户完成细胞追踪算法的多个阶段，包括细胞检测阶段、细胞追踪阶段，以及对检测结果和计算轨迹施加的多种滤波器。在每个阶段，均可配置算法参数并立即显示结果，以便必要时可方便地前后切换，调整设置。TrackMate 界面的各个菜单如图所示 图2 使用 HeLa 细胞实验的实际设置。</li>
	<li>设置采集软件的输入参数如下（参见 图2将估计的斑点直径设为15像素，检测阈值设为0.25，链接最大距离设为15像素，间隙闭合最大距离设为15像素，轨迹中的斑点数量设为3.5。 
	注意：这些设置显然会因实验而异，尤其是“估计的斑点直径”，其对应于细胞大小（此处以像素为单位）。 1.67 &#181;m）。同样适用于“连接最大距离”，该参数表示细胞在连续两帧之间移动的最大距离（此处以像素为单位） 1.67 &#181;m其最佳值取决于细胞的运动性，同时也受细胞密度的影响。</li>
	<li>细胞追踪过程结束后，点击“分析”按钮，以生成三个文本文件形式的结果 图2）。最有用的文件名为“Spots in tracks statistics”，包含一个表格，列出了在采集过程中检测到的所有细胞及其对应的 (x,y) 位置、帧编号和轨迹编号。基于此数据，使用专用算法进行细胞分割并检测细胞分裂（参见补充代码文件）。另外两个文件名为“Links in tracks statistics”和“Track statistics”，包含与轨迹相关的所有结果， 例如 持续时间、检测到的间隙数量、轨迹起始帧等</li>
	<li>使用细胞分割算法（参见补充代码文件），从重建的相位图像中自动提取若干描述细胞形态的参数。这些参数包括细胞表面积（S）、细胞长轴长度（L）、细胞短轴长度（l）以及细胞长径比（L/l）。如前所述，无透镜显微镜恢复的相位信号与样品层的密度和厚度成正比。15.</li>
	<li>除了细胞的形态特征外，还可从重建的相位图像中提取定量的细胞干重（CDM）测量值13,19,20 
	<img alt="公式 1" src="/files/ftp_upload/56580/56580eq1v3.jpg" />&#160;Eq. (1) 
	其中&#160;&#966;(x,y) 是重建的相位偏移19, &#955; 波长和&#160;&#945; = 1.8 × 10-4 m3/kg 与干质量相关的折射率特异性折射系数1,19.</li>
	<li>使用细胞折射率与培养基折射率之差的估算值来评估细胞厚度。细胞厚度与折射率差之间的关系 h(x,y）且测得的相位偏移由下式给出20: 
	<img alt="公式 2" src="/files/ftp_upload/56580/56580eq2v3.jpg" />&#160;公式 (2.1) 
	<img alt="公式 3" src="/files/ftp_upload/56580/56580eq3v3.jpg" />公式 (2.2) 
	与&#160;&#916;n(x,y) = n细胞 (x,y) - n培养基 (x,y），细胞与培养基之间折射率的差异。下文中，假设该值为常数 &#916;n = 0.025，该值是根据在HeLa细胞核中测得的折射率（n = 1.355）估算得到的11) 以及磷酸盐缓冲液（PBS）培养基（n=1.33）的折射率。尽管细胞厚度值仅为基于假设的估算，其相对变化仍具有意义，可用于识别分裂中的细胞。</li>
	<li>使用专用算法（参见补充代码文件）检测细胞分裂事件的发生，然后提取与检测到的细胞分裂相关的细胞轨迹。为了检测细胞分裂，需筛选出测量厚度大于 8 &#181;m 首先识别细胞，然后检查在相近的空间和时间内是否有新细胞出现。通过这种方式，细胞分裂的检测依赖于两个可靠的判据。也可将其他更复杂的方法应用于无透镜延时成像中的细胞分裂检测。21,22,23.</li>
</ol>

<ol><li>Zangle, T. A., Teitell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+mass+profiling%3A+an+emerging+approach+in+quantitative+biophysics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Live-cell mass profiling: an emerging approach in quantitative biophysics.</a> Nat Methods. 11 (12), 1221-1228 (2014).</li>
<li>Popescu, G., Park, K., Mir, M., Bashir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+technologies+for+measuring+single+cell+mass%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">New technologies for measuring single cell mass.</a> Lab Chip. 14 (4), 646-652 (2014).</li>
<li>Reed, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+massively+parallel+single-cell+drug+response+measurements+via+live+cell+interferometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Rapid, massively parallel single-cell drug response measurements via live cell interferometry.</a> Biophys J. 101 (5), 1025-1031 (2011).</li>
<li>Mir, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+measurement+of+cycle-dependent+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Optical measurement of cycle-dependent cell growth.</a> Proc Natl Acad Sci. USA. 108 (32), 13124-13129 (2011).</li>
<li>Girshovitz, P., Shaked, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generalized+cell+morphological+parameters+based+on+interferometric+phase+microscopy+and+their+application+to+cell+life+cycle+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Generalized cell morphological parameters based on interferometric phase microscopy and their application to cell life cycle characterization.</a> Biomed Opt Express. 3 (8), 1757-1773 (2012).</li>
<li>Kemper, B., Bauwens, A., Vollmer, A., Ketelhut, S., Langehanenberg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+quantitative+cell+division+monitoring+of+endothelial+cells+by+digital+holographic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Label-free quantitative cell division monitoring of endothelial cells by digital holographic microscopy.</a> J Biomed Opt. 15 (3), (2010).</li>
<li>Mir, M., Bergamaschi, A., Katzenellenbogen, B. S., Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+sensitive+quantitative+imaging+for+monitoring+single+cancer+cell+growth+kinetics+and+drug+response%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Highly sensitive quantitative imaging for monitoring single cancer cell growth kinetics and drug response.</a> PLoS One. 9 (2), 1-8 (2014).</li>
<li>Bon, P., Savatier, J., Merlin, M., Wattellier, B., Monneret, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+detection+and+measurement+of+living+cell+morphometric+features+with+single-shot+quantitative+phase+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Optical detection and measurement of living cell morphometric features with single-shot quantitative phase microscopy.</a> J Biomed Opt. 17 (7), (2012).</li>
<li>Aknoun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Living+cell+dry+mass+measurement+usinq+quantitative+phase+imaging+with+quadriwave+lateral+shearing+interferometry%3A+an+accuracy+and+sensitivity+discussion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Living cell dry mass measurement usinq quantitative phase imaging with quadriwave lateral shearing interferometry: an accuracy and sensitivity discussion.</a> J Biomed Opt. 20 (1), 1-4 (2015).</li>
<li>Cotte, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marker-free+phase+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Photonics%22%5BJournal%5D)">Marker-free phase nanoscopy.</a> Nature Photonics. 7 (2), 113-117 (2013).</li>
<li>Choi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tomographic+phase+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Tomographic phase microscopy.</a> Nat Methods. 4 (9), 717-719 (2007).</li>
<li>Kesavan, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+monitoring+of+major+cell+functions+by+means+of+lensfree+video+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">High-throughput monitoring of major cell functions by means of lensfree video microscopy.</a> Sci Rep. 4, 1-11 (2014).</li>
<li>Zheng, G., Lee, S. A., Antebi, Y., Elowitz, M. B., Yang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ePetri+dish%2C+an+on-chip+cell+imaging+platform+based+on+subpixel+perspective+sweeping+microscopy+%28SPSM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">The ePetri dish, an on-chip cell imaging platform based on subpixel perspective sweeping microscopy (SPSM).</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108 (41), 16889-16894 (2011).</li>
<li>Pushkarsky, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+single-cell+motility+analysis+on+a+chip+using+lensfree+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Automated single-cell motility analysis on a chip using lensfree microscopy.</a> Sci Rep. 4, 4717(2014).</li>
<li>Allier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+dense+cell+cultures+by+multiwavelength+lens-free+video+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytom+Part+A%22%5BJournal%5D)">Imaging of dense cell cultures by multiwavelength lens-free video microscopy.</a> Cytom Part A. 91 (5), 1-10 (2017).</li>
<li>Su, T. -W., Seo, S., Erlinger, A., Ozcan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+lensfree+imaging+and+characterization+of+a+heterogeneous+cell+solution+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">High-throughput lensfree imaging and characterization of a heterogeneous cell solution on a chip.</a> Biotechnol Bioeng. 102 (3), 856-868 (2009).</li>
<li>Delacroix, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrospinal+fluid+lens-free+microscopy%3A+a+new+tool+for+the+laboratory+diagnosis+of+meningitis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Cerebrospinal fluid lens-free microscopy: a new tool for the laboratory diagnosis of meningitis.</a> Sci Rep. 7, 39893(2017).</li>
<li>Tinevez, J. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TrackMate%3A+an+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">TrackMate: an open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2016).</li>
<li>Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+cell+mass+and+growth+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of cell mass and growth dynamics.</a> Am J Physiol Physiol. 295 (2), 538-544 (2008).</li>
<li>Liu, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+refractive+index+for+cell+biology+and+disease+diagnosis%3A+past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Cell refractive index for cell biology and disease diagnosis: past, present and future.</a> Lab Chip. 16, 634-644 (2016).</li>
<li>Rapoport, D. H., Becker, T., Mamlouk, A. M., Schicktanz, S., Kruse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+validation+algorithm+allows+for+automated+cell+tracking+and+the+extraction+of+biologically+meaningful+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A novel validation algorithm allows for automated cell tracking and the extraction of biologically meaningful parameters.</a> PLoS One. 6 (11), e27315(2011).</li>
<li>Al-Kofahi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+cell+lineage+construction%3A+A+rapid+method+to+analyze+clonal+development+established+with+murine+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Automated cell lineage construction: A rapid method to analyze clonal development established with murine neural progenitor cells.</a> Cell Cycle. 5 (3), 327-335 (2006).</li>
<li>Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I., van Cappellen, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+in+cell+and+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Tracking in cell and developmental biology.</a> Semin Cell Dev Biol. 20 (8), 894-902 (2009).</li>
<li>Posakony, J. W., England, J. M., Attardi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+growth+and+division+during+the+cell+cycle+in+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial growth and division during the cell cycle in HeLa cells.</a> J Cell Biol. 74 (2), 468-491 (1977).</li>
<li>Zocchi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+CD38+Increases+Intracellular+Calcium+Concentration+and+Reduces+Doubling+Time+in+HeLa+and+3T3+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Expression of CD38 Increases Intracellular Calcium Concentration and Reduces Doubling Time in HeLa and 3T3 Cells.</a> J Biol Chem. 273 (14), 8017-8024 (1979).</li>
<li>Reitzer, L. J., Wice, B. M., Kennell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+glutamine%2C+not+sugar%2C+is+the+major+energy+source+for+cultured+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Evidence that glutamine, not sugar, is the major energy source for cultured HeLa cells.</a> J Biol Chem. 254 (8), 2669-2676 (1979).</li>
<li>Benedetti, A. D. E., Joshi-barve, S., Rinker-Schaeffer, C., Rhoads, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Antisense+RNA+against+Initiation+Factor+eIF-4E+mRNA+in+HeLa+Cells+Results+in+Lengthened+Cell+Division+Times%2C+Diminished+Translation+Rates%2C+and+Reduced+Levels+of+Both+eIF-4E+and+the+p220+Component+of+eIF-4F%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression of Antisense RNA against Initiation Factor eIF-4E mRNA in HeLa Cells Results in Lengthened Cell Division Times, Diminished Translation Rates, and Reduced Levels of Both eIF-4E and the p220 Component of eIF-4F.</a> Mol Cell Biol. 11 (11), 5435-5445 (1991).</li>
<li>Kumei, Y., Nakajima, T., Sato, A., Kamata, N., Enomoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+G1+phase+duration+and+enhancement+of+c-myc+gene+expression+in+HeLa+cells+at+hypergravity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Reduction of G1 phase duration and enhancement of c-myc gene expression in HeLa cells at hypergravity.</a> J Cell Sci. 93 (2), 221-226 (1989).</li>
<li>Ginzberg, M. B., Kafri, R., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+being+the+right+%28cell%29+size%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">On being the right (cell) size.</a> Science. 348 (6236), 1245075(2015).</li>
<li>Mathieu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+lens-free+imaging+of+cell+migration+in+diverse+physical+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Time-lapse lens-free imaging of cell migration in diverse physical microenvironments.</a> Lab Chip. 16 (17), 3304-3316 (2016).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文中，我们展示了可在培养箱内使用无透镜视频显微技术，以捕捉数千个细胞的动力学行为。为了描述整体方法，我们说明了如何利用标准的细胞追踪算法分析培养中HeLa细胞长达2.7天的延时成像数据。最终获得的数据集包含2.2×106次细胞测量结果以及10,584条细胞周期轨迹。实验在HeLa细胞培养物上进行，细胞间距离相对较大（细胞密度&#60;500个细胞/mm2），且细胞形态可近似为圆盘状。这两个特征有利于自动细胞追踪分析的应用，从而能够获取如此大规模的数据集。对于细胞间距离更小或形态更复杂的其他细胞系，追踪难度将增加，所获得的数据集规模也会相应减小。
我们认为，这种方法在许多研究中具有重要意义，例如细胞增殖和细胞大小相关研究。后者是基础生物学中的一个重要研究领域，仍有许多问题尚未解决，正如Ginzberg et al.29在综述中所详细讨论的那样。本研究提出的方案因此提供了一种测量细胞增殖研究所需关键参数的方法，即细胞周期持续时间、细胞干重、细胞周期起始与结束时的细胞干重比值以...

在整个多个细胞周期中监测培养的哺乳动物细胞，并准确测量细胞大小和细胞干重，是一项具有挑战性的任务。多种无标记光学技术能够完成这一任务1,2：相移干涉测量法3、数字全息显微技术（DHM）4,5,6,7、四波横向剪切干涉测量法8,9以及定量相位断层成像技术10,11。这些方法已为理解哺乳动物细胞的细胞周期带来了许多新的认识。然而，这些技术很少与自动细胞追踪算法相结合，在测量细胞质量轨迹时通量仍然有限1（分别在3,4,5,6中N&#60;20）。因此，亟需一种新型光学方法，以实现对大量细胞（N&#62;1000）的质量轨迹进行统计学测量。
本文展示了无透镜视频显微技术能够在培养箱内直接对数千个细胞进行同时成像，并沿数千条单个细胞周期轨迹定量分析单细胞参数的能力。无透镜显微术是一种定量相位成像技术，可在非常大的视场范围内（通常为数十 mm2，本文中为 29.4 mm2）获取高密度细胞的相位图像12,13,14,15。从每幅图像中可确定多个单细胞层面的参数，例如，细胞面积、细胞干重、细胞厚度、细胞长轴长度和细胞长宽比12,15。随后，通过应用细胞追踪算法，这些特征可被绘制为每个单细胞随实验时间变化的函数曲线14,15。此外，通过检测细胞轨迹中细胞分裂的发生，还可提取其他重要信息，例如初始细胞干重（细胞分裂后立即）、最终细胞干重（细胞分裂前立即）以及细胞周期持续时间，即 两次连续分裂之间的时间间隔15。由于大视场通常允许在一次无透镜成像中分析 200 至 10,000 个细胞，因此这些测量可获得统计学上非常可靠的结果（N&#62;1000）。
为了阐述基于无透镜视频显微镜的方法，本文描述了监测和量化 HeLa 细胞培养物长达 2.7 天的实验方案。数据分析是一个包含多波长全息重建、细胞追踪、细胞分割和细胞分裂算法的四步过程。本文表明，该无透镜视频显微镜系统所获得的空间分辨率和相对较快的帧率（每 10 分钟采集一次）可与标准的细胞追踪算法兼容。对该数据集的完整分析最终获得了跨越完整细胞周期的 10,584 条细胞轨迹的测量结果。
总之，无透镜视频显微技术是一种强大的工具，可在一个实验中自动监测数千个未标记、未同步且未经修饰的细胞，并对每个细胞持续追踪多个细胞周期。因此，我们的测量不仅提供了多个细胞参数的平均值，更重要的是揭示了大量细胞群体中的细胞间变异性。

<table><tbody><tr><td>无透镜视频显微镜 Cytonote&amp;nbsp;</td><td>Iprasense</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Horus 图像采集软件</td><td>Iprasense</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6 孔玻璃底培养板</td><td>MatTek corporation</td><td>货号：P06G-0-14-F&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DMEM + GlutaMAX 培养基&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>热灭活胎牛血清&amp;nbsp;</td><td>Eurobio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>青霉素和链霉素&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>纤连蛋白&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab 图像处理工具箱&amp;nbsp;</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

无透镜视频显微技术用于贴壁细胞培养的动态定量分析

Lens-free Video Microscopy for the Dynamic and Quantitative Analysis of Adherent Cell Culture

在此，我们证明了无透镜视频显微技术能够使我们在培养箱内部直接同时捕获数千个细胞的动力学行为，并且可以对单个细胞在多个细胞周期中的行为进行监测和定量分析。我们描述了用于监测和定量HeLa细胞培养长达2.7天的完整实验方案。首先，使用无透镜视频显微镜进行细胞培养的图像采集，随后数据通过四个步骤进行分析：多波长全息重建、细胞追踪、细胞分割以及细胞分裂检测算法。结果表明，我们能够获得包含超过10,000条细胞周期轨迹以及超过2 × 106次细胞形态学测量的数据集。

在全息重建过程中，光场由标量场 A 描述（其中 <img alt="电动力学公式，矢量势分量 \( A_z^\lambda(\vec{r}) \)，物理方程。" src="/files/ftp_upload/56580/56580eq4v3.jpg" data-altupdatedat="1762258740000" data-alt="方程 4"> 表示在距离样品为 z 的平面上、横向位置为 <img alt="物理方程中力的矢量表示；矢量符号，教学符号。" src="/files/ftp_upload/56580/56580eq5v3.jpg" data-altupdatedat="1762258740000" data-alt="方程 5">、波长为 λ 处 A 的复数值）。光的传播由惠更斯-菲涅耳理论建模，该理论提供了一个传播核函数 <img alt="用于空间函数分析的数学符号 hλZ(r̅)。" src="/files/ftp_upload/56580/56580eq6v3.jpg" data-altupd...

无透镜视频显微技术使我们能够直接在培养箱内监测细胞培养物。本文介绍了获取和分析长达2.7天的培养HeLa细胞数据的完整方案，最终获得包含2.2×106次单个细胞形态测量结果和10584条细胞周期轨迹的数据集。

在此，我们证明了无透镜视频显微技术能够使我们直接在培养箱内同时捕获数千个细胞的动力学行为……

本方法的总体目标是获取并分析通过无透镜视频显微镜监测的大规模贴壁细胞群体的动态行为。因此，我们认为该技术在生物学多个领域具有应用价值，可用于研究细胞增殖、细胞囊性病变或药物筛选，以及各类生物过程的监测。该技术无需标记，操作十分简便。但它在研究大规模细胞群体时非常有效。当我们从细菌检测领域转向哺乳动物细胞成像领域时，这一方法的理念得到了应用。此后，生物学家需要直接在培养箱内进行电路结构的时间序列成像。然后，我们构建了一种可与培养箱兼容的定制无透镜视频显微镜，并开发了一种全息重建算法，以获取视场内大量细胞的图像。开始本实验前，先在室温下用纤连蛋白包被6孔玻璃底板1小时。1小时后，去除多余的纤连蛋白，并用PBS冲洗6孔玻璃底板。本实验中使用的 Hela 细胞在 DMEM 加谷氨酰胺培养基中培养，培养基中添加 10% 经热灭活的胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素。每块培养板接种两万个细胞。使用玻璃底培养皿非常重要。为了保证无透镜成像的质量，将培养板放置在无透镜视频显微镜上方的培养箱中。本延时成像所使用的无透镜视频显微镜为市售产品。它采用金属氧化物半导体图像传感器，成像面积为29.4平方毫米，像素间距为1.67微米。多波长照明由位于细胞上方约5厘米处、一个150微米针孔上方的多芯片发光二极管装置提供。在开始延时成像采集之前，必须检查盖板上是否存在冷凝水。因为冷凝会降低成像质量。如果培养皿盖上已出现冷凝，应清洁皿盖。使用市售的采集软件控制无镜头视频显微镜。该系统同时执行延时图像采集和全息重建。在软件界面中输入所需的参数：将帧率设置为每10分钟采集1次，细胞培养类型设置为贴壁细胞，实验持续时间设置为3天。启动延时成像采集。该图像显示了在29.4平方毫米区域内，单帧图像中蓝色通道原始采集的完整视野示例。图B为图A的局部放大，图C为图B的进一步放大。全息重建算法将自动处理无透镜采集数据，以获得细胞培养物的相位图像。展示了相位解包裹前细胞的一个示例图像，随后是相位解包裹后的图像。细胞追踪通过 TrackMate 算法实现，该算法是 Fiji 的一个开源插件，用于单颗粒的自动追踪。在将完整的延时采集数据加载到 Fiji 中，并按照文本方案所述配置算法后，设置输入参数。将估计的斑点直径设为15像素，检测器阈值设为0.25，连接最大距离设为15像素，间隙闭合最大距离设为15像素，轨迹中的斑点数量设为3.5。细胞追踪算法的第一步是在无透镜成像中检测细胞。结果显示了细胞追踪算法的结果，所有细胞轨迹均跨越五十帧，约8小时。颜色编码对应于中位速度。底部面板是顶部面板中黄色矩形区域的详细图像。此处展示了一段细胞追踪的代表性视频片段。细胞追踪过程结束后，点击分析按钮，以生成三个文本文件形式的结果。根据这些数据，按照文本方案及补充代码文件中详述的方法，使用专用算法进行细胞分割并检测细胞分裂事件。整合整个延时成像过程中所有单细胞的测量数据，可绘制出多个指标随时间变化的散点图。整个视野中的细胞总数在2.7天内从两千增加到一万五千。乘以时间点的数量后，将产生一个包含大量被检测细胞的庞大数据集。每个细胞均以其坐标和形态学特征进行表征，例如干质量、面积、平均厚度、长轴长度和长宽比。细胞示踪与细胞分割算法的结合，能够实现单细胞水平的动力学测量。本示例展示了持续约六十六小时的细胞轨迹分析，其中在以黄色圆圈标注的时间点处共观察到4次细胞分裂。随时间变化计算了多项指标：细胞表面积、干重、平均厚度以及细胞运动性。在2.7天的观察期内，细胞周期持续时间的分布接近于对数正态分布，平均值为16.5小时。通过自动测量得到的细胞周期长度与手动测量结果具有良好的相关性。还考察了其他参数，例如细胞初始干重、最终干重以及细胞周期中的平均生长速率。一旦掌握该方法，整个延时成像数据的分析可在数小时内完成，具体耗时取决于CPU配置和硬件性能。在进行该实验操作时，必须严格控制初始细胞浓度。如果初始细胞浓度过高，细胞轨迹追踪算法将无法准确定义细胞的运动轨迹；但如果细胞浓度过低，则整个分析的统计学意义也会不足。通过遵循此操作流程，可开展类似自动化细胞追踪分析，以回答生物学、基础生物学或趋化性等领域的其他科学问题。这一新技术还为细胞谱系的监测开辟了道路，有望为细胞周期的研究提供有趣的见解。观看本视频后，您应能充分理解如何利用无透镜视频显微技术进行延时成像，以及如何分析大量细胞群体。

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科研

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Biology

生物学

无透镜视频显微术在黏附细胞培养动态定量分析中的研究

展示了无需透镜的片上细胞成像与表征技术。这种片上细胞成像方法为医学诊断和高通量细胞生物学应用提供了一种紧凑且成本效益高的工具，特别适用于资源匮乏的环境。...

无透镜片上细胞成像技术为高通量细胞生物学与医学诊断提供了新工具

本文旨在指导读者使用集成的原子力-光学成像显微镜对培养中的活细胞进行机械刺激操作。文中提供了一步一步的操作方案，并展示了一组典型的实验数据，用以显示活细胞对机械刺激的响应。...

活细胞对机械刺激响应的集成光学与原子力显微镜研究

该方法可实现对细胞的实时监测，并对细胞迁移的不同参数（如速度、位移和速率）进行定量测量。与传统方法不同，这种实时方法并非基于终点定量迁移测量，而是能够连续监测并计算各种参数。...

使用延时视频显微镜对细胞随机迁移进行定量分析

通过变角全内反射荧光显微镜（VA-TIRFM），可实现对细胞在基底上黏附拓扑结构的纳米级精度测量。...

可变角度全内反射荧光显微镜下细胞黏附的纳米拓扑结构

我们展示了一种基于微流控的检测方法，用于测量细胞通过一系列微米级狭窄通道的通过时间尺度。...

一种用于探测细胞变形能力的微流控技术

传统的制备含有荧光探针的聚丙烯酰胺（PA）凝胶的方法涉及将凝胶夹在粘附表面与玻璃载片之间。本文表明，通过用聚-D-赖氨酸（PDL）包被该载片，并将荧光探针定位在凝胶表面1.6...

一种用于牵引力显微镜技术中将报告荧光微珠定位在细胞培养表面附近的新型方法

将介绍一种先进的显微镜，该显微镜能够对分离的质膜及其周围的细胞内体积进行快速且高分辨率的成像。将转盘共聚焦显微技术与全内反射荧光显微技术集成于同一系统，可实现高达每3.5秒获取一幅图像堆栈的高速活细胞成像实验。...

利用先进的转盘-全内反射荧光显微镜技术可视化细胞中的黏附形成

由于基于 Förster 共振能量转移（FRET）的传感器本身信噪比（SNR）较低，cAMP 信号的测量一直具有挑战性，尤其是在三维空间中。本文介绍了一种高光谱 FRET 成像与分析方法，可实现三维空间内 cAMP...

使用四维（x, y, z 和 &lambda;）高光谱FRET成像与分析技术测量活细胞中三维cAMP分布

我们介绍一种用于复杂生命机制高通量研究的微流控系统，该系统包含1500个培养单元、一组增强型蠕动泵以及一个现场混合模块。该微流控芯片可实现对体内高度复杂且动态变化的微环境条件进行分析。...

利用高通量微流控装置产生动态环境条件

本文描述了一种微张力计/共聚焦显微镜的设计与操作方法，可用于在观察界面形貌的同时，同步测量界面张力和界面膨胀流变学性质。该方法可实时构建在技术和生理过程中具有重要意义的界面结构-性能关系。...

用于共聚焦显微镜观察动态界面的微张力测定仪

本方案介绍了一种基于鬼笔环肽的丝状肌动蛋白染色技术，并结合共聚焦激光扫描显微镜（CLSM），用于观察微流控动态培养通道以及传统固定孔静态培养腔室中贴壁细胞层的结构。该方法有助于评估细胞层的融合度、单层形成情况以及层厚的均匀性。...

生理尺寸微流控培养装置中上皮细胞单层的制备与结构评估

学习使用无透镜视频显微术对贴壁细胞进行延时成像，以HeLa细胞为模型在培养箱内直接监测细胞周期动态。该方法可采集220万次测量数据并追踪超过一万条细胞周期轨迹，为细胞增殖和药物筛选研究提供高通量分析工具。

无透镜视频显微技术用于贴壁细胞培养的动态定量分析

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